全 文 ：15%,玉米粉 6%)粉碎 , 称取 200g ,加水1 000ml , 煮沸 20min , 用
6 层纱布过滤 ,补充水至1 000ml。
1.2.2　培养基的制备
见参考文献[ 7] 。
1.2.3　培养方法
在超净工作台上将灭菌后的培养基倒入口径为 9.0cm 的
无菌培养皿中 ,每皿约 89ml ,摇匀并冷却制成平板。取在 PDA
试管培养基上培养好的四种食用菌菌丝体 , 分别接到平板培
养基上 ,倒置于培养箱中 , 25℃无光照培养 11d ,每个处理接种
4 个平行 ,设 3 次重复。 24h 后开始观测菌丝生长 , 以后每隔
24h观测一次。
2　结果与分析
2.1 不同比例的阿魏菇菌糠提取液对四种食用菌菌丝生长速
度的影响
通过不同比例的阿魏菇菌糠提取液对四种食用菌菌丝生
长速度影响的实验结果(见表 1)可以看出:在 PDA 培养基中 ,
加入 10%的阿魏菇菌糠提取液对鸡腿菇菌丝生长无明显影
响 ,但当加入量超过 30%时 , 对其有明显的抑制作用;对于金
针菇 ,菌糠提取液加入量从 30%增加到 50%时 , 明显促进其菌
丝的生长 ,加入量为 50%时 , 其菌丝生长最快 , 当加入量增加
到70%以上时 ,其菌丝生长减缓;在 PDA培养基中加入 10%
～ 50%的阿魏菇菌糠提取液对香菇的菌丝生长有促进作用 ,
当增加到 70%时 ,开始抑制其生长;在加入 10%～ 30%阿魏菇
菌糠提取液的 PDA 培养基中 ,杏鲍菇菌丝生长加快 ,当加入量
大于 30%时 , 提取液对杏鲍菇菌丝生长有明显的抑制作用。
表 1　鸡腿菇 、香菇 、杏鲍菇 、金针菇菌丝生长速度
Table 1　The mycelium growth rate of four edible fungi
组号 处理
鸡腿菇 香菇 杏鲍菇 金针菇
生长速度
(cm d)
生长速度
(cm d)
生长速度
(cm d)
生长速度
(cm d)
1 0%(CK) 0.265 0.225 0.319 0.310
2 10% 0.261 0.259 0.339 0.369
3 30% 0.190 0.267 0.314 0.398
4 50% 0.138 0.224 0.287 0.457
5 70% 0.157 0.204 0.257 0.325
6 100% 0.191 0.170 0.213 0.278
图 1　不同比例的阿魏菇菌糠提取液对四种食用菌菌丝增长率影响
Fig.1　Effect of diff erent proportional aquatic extract ion substance f rom residue
of Pleurotus ferulae on mycelium growth ratio of four edible fungi
2.2　不同比例的阿魏菇菌糠提取液对四种食用菌菌丝增长
率的比较
通过不同比例的阿魏菇菌糠提取液对四种食用菌菌丝增
长率影响的分析(见图 1),发现不同浓度的阿魏菇菌糠提取液
对有些食用菌菌丝生长有促进作用 , 对有些有抑制作用。 菌
糠提取液浓度为 10%时 , 对四种食用菌菌丝生长均有一定的
促进作用 , 此时杏鲍菇的菌丝增长率达到最大值 , 而对鸡腿菇
菌丝生长的影响最小;菌糠提取液浓度为 30%时 , 香菇的增长
率最大 , 促进作用最为明显 ,而杏鲍菇和鸡腿菇菌丝的增长率
有所下降 , 抑制作用开始显现;当浓度升至 50%时 , 对金针菇
的促进作用最为明显 , 对杏鲍菇的抑制作用开始显现 , 而对鸡
腿菇的抑制作用也最为明显 , 香菇菌丝增长率几乎为零;当浓
度为 70%时 ,对金针菇菌丝生长的促进作用减缓 , 对其他三种
食用菌菌丝生长的抑制作用增强;菌糠提取液浓度为 100%
时 , 对四种食用菌菌丝生长有明显的抑制作用 , 对香菇的抑制
作用达到最大。
3　讨论
阿魏菇是一种大型木腐真菌 , 能利用纤维素 、半纤维素 、
木质素等作为碳源 , 并对其进行降解进而转化为富含蛋白质 、
碳水化合物的菌丝体和子实体 , 阿魏菇菌糠中含有大量的菌
丝体。利用阿魏菇菌糠再栽培姬松茸或其他品种食用菌都已
有一定的成功经验[ 8 ,9] ,但本实验结果与郭海增等[ 10]试验结果
有所不同 , 这是因为本实验中未对阿魏菇菌糠进行发酵 , 而是
直接用于母种培养基的重新配制。本实验为阿魏菇菌糠的循
环再利用提供理论依据 , 结果表明:适量的阿魏菇菌糠提取液
对金针菇 、香菇的菌丝生长有利 , 而对杏鲍菇和鸡腿菇菌丝生
长是不利的 , 从而反映出添加适量的阿魏菇菌糠再栽金针菇 、
香菇的可能性 , 而用其再栽杏鲍菇和鸡腿菇 , 则可能是行不通
的。
参考文献:
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天山堇菜提取物的抑菌活性研究
沈小燕1 ,解成喜1＊ ,刘迪2(1.新疆大学理化测试中心 , 新疆 乌鲁木齐 830046;2.新疆大学生命科学与技术学院 ,新疆 乌鲁木齐 830046)
摘要:目的:研究天山堇菜提取物抗菌活性。方法:用 85%乙醇采用回流浸煮提取天山堇菜生物碱 ,用超声法提取黄酮化合
物 ,以此为供试液对 4 种细菌和 5种真菌做抑菌实验。结果:供试液对供试细菌有不同程度的抑制作用 , 两种提取物对肺炎克雷
伯菌的最小抑菌浓度是 0.175g ml;对臭鼻克雷伯菌的最小抑菌浓度分别是 0.15g ml和 0.175g ml;对类产碱假单胞菌和奇异变型
杆菌的最小抑菌浓度是 0.20g ml ,而对所选真菌抑制效果却不明显。结论:天山堇菜有一定的抗菌活性 , 是有研究开发价值的一
种中草药。
关键词:天山堇菜;提取物;抑菌试验
712009 年 19(2)　　　　　　　　　　　　　　　　　生　物　技　术　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
DOI :10.16519/j.cnki.1004-311x.2009.02.012
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2009)02-0071-03
Study on Antimicrobial Activity of Viola tianshanica Maxim.Extracts
SHEN Xiao-yan1 , XIE Cheng-xi1 , ＊ , LIU-di2
(1.Physical and Chemical Analysis Center , Xinjiang University , Urumqi 830046 , China;
2.College of Life S cience and Technology , Xinjiang University , Urumqi 83046 , China)
Abstract:Objective:To study on the antimicrobial activity of Viola tianshanicaMaxim.Method:The alkaloids and flavonoids of extracts from Vio-
la tianshanica Maxim.with 85% edible-ethanol were used as antimicrobial agents.Four species of bacteria and five fungus were taken as test-
bacteria.Result:The extracts from Viola tianshanicaMaxim had the best antibacterial effect on the tested bacteria .The minimal inhibition concen-
trations(MIC) of antibacterial of extractions are respectively as follows:Klebsiella pneumonia 0.175g ml , Klebsiella ozaenae 0.15g ml and
0.175g ml , Pseudomona pseudoalcaligenes and Proteus mirabilis 0.20g ml.But effect was not obvious on fungus.Conclusion:Extracts of Viola
tianshanica Maxim.showed some antimicrobial activity.
Key words:Viola tianshanica Maxim;extracts;antimicrobial activity
收稿日期:2008-10-28;修回日期:2008-11-14
作者简介:沈小燕(1983-), 女 ,在读硕士生 , 从事维吾尔医药研究 ,
Tel:0991-8589339 , Emai l:shen-xiaoyan2007@yahoo.cn;＊通讯作者:
解成喜(1953 -), 男 , 教授 , 从事分析化学工作 , Tel Fax:0991-
8582529 , Emai l:xiecx@xju.edu.cn。
　　天山堇菜 , 维药名为比那夫西(Herba Violae tianshanicae),
是堇菜科(Violaceae)植物天山堇菜 Viola tianshanica Maxim.的
干燥全草。其气味微苦辛 、凉 , 清热解毒 , 具有调理 、软化 、发
汗的作用。主要用于轻泻异常胆液质 , 调节血液热性过盛 , 生
津止渴 , 发汗退烧。 临床用于热性感冒 、发烧 、头痛 、咽痛 、肢
肿 、小儿惊厥 , 也可外用于疔疮肿痛等。用量 6 ～ 12g , 当茶饮
或煎服 , 外用适量[1] 。其要用部位是全草 , 全草经预试检出含
挥发油 、黄酮类 、生物碱 、氨基酸 、粘液质皂苷 、鞣质等[ 2] 。
国内外学者对其提取物的抑菌作用做了一些研究[3-5] , 但
对生物碱的抑菌试验的报道却很少有见。本文目的是研究天
山堇菜生物碱和黄酮的抑菌特性 , 希望能为进一步合理开发
利用新疆天山堇菜资源提供科学依据。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验材料
天山堇菜(购自新疆维吾尔医院 , 80℃烘干 , 粉碎过 60 目
筛备用);
细菌:肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)、臭鼻克雷伯菌
(Klebsiella ozaenae)、类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcali-
genes)、奇异变型杆菌(Proteus mirabilis)均为新疆大学生命科学
与技术学院保存。
真菌:稻瘟病菌(Rice blast fungus)、意大利青霉(Penicillium
italicum)、黄瓜疫霉(Phytophthora melonis)、甜瓜枯萎病毒
(Fusarium oxysporam f.sp.Melonis)、瓜类根腐病菌(Melon Pyth-
ium aphanidermatum)均为新疆大学生命科学与技术学院保存。
1.1.2　试剂
无水乙醇(分析纯 , 天津市致远化学试剂有限公司);三氯
甲烷(分析纯 , 天津市盛淼精细化工有限公司);水为蒸馏水。
1.1.3　仪器
LDZX-40Ⅱ型自动压力灭菌消毒器(上海申安医疗器械
厂);隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂);超净工
作台(苏净集团安泰公司制造);KQ5200B 超声波仪;AL204 电
子天平;RE-52A 型旋转蒸发仪;pH 计;摇床。
1.1.4　培养基
参照沈萍的方法[ 6] 。 牛肉膏蛋白胨培养基(培养细菌
用);马铃薯培养基(简称 PDA ,培养真菌用)。
1.2　方法
1.2.1　供试液的提取
1.2.1.1　生物碱的提取:精确称取天山堇菜粉末 50g , 置入
1 000mL烧瓶中 ,加入 500mL 85%乙醇 , 回流3h ,过滤 , 合并旋转
蒸发器 50℃真空回收乙醇至较稀的膏状 , 加入适量的 2%HC1
溶解该膏状物质 ,并将酸液移至分液漏斗中 , 加适量氯仿洗涤
3次 ,弃去氯仿层 , 酸水液加入浓氨水调节pH 值在9 ～ 10 ,再加
适量氯仿萃取 4 次 , 将氯仿层移入 50mL容量瓶中 , 加氯仿至
刻度 , 摇匀得 1g ml 的氯仿试液。 然后分别稀释为浓度
0.50g ml和 0.25g ml , 最后过滤除菌 ,供抗菌实验用。
1.2.1.2　黄酮化合物的提取:精确称取天山堇菜粉末 50g , 加
85%乙醇溶液 500mL, 超声提取 60min , 抽滤 , 用 85%乙醇洗涤
滤渣 2遍 , 合并滤液旋转蒸发 , 定容在50mL容量瓶 , 得到1g mL
的提取液 ,然后分别稀释至浓度 0.50g ml和 0.25g ml , 过滤除
菌 , 供抗菌试验用。
1.2.2　菌种活化
将保存菌种反复转种 2 次 , 使菌种新鲜。细菌置 37℃培
养 24h;真菌置 25 ～ 28℃培养 24h 左右 ,备抗菌试验用。
1.2.3　无菌滤纸片的制备
用打孔器将干净的滤纸打成直径为 7.0mm 的小圆纸片 ,
置烘箱 121℃、2h , 干热灭菌冷却备用。
1.2.4　天山堇菜生物碱的抑菌试验
1.2.4.1　细菌的抑菌试验(滤纸片法):将培养好的菌液取
200μL加入到装有固体培养基的培养皿中 , 涂抹均匀 , 然后在
每个平板中用镊子加入 3 片在不同浓度(0.25g ml 、0.5g ml 和
1g ml)的提取液中浸泡的滤纸片 , 氯仿和 85%乙醇分别作对
照 , 3 个重复 ,放入培养箱中 37℃培养 24h 后观察并以十字交
叉法测量抑菌圈。
1.2.4.2　真菌的抑菌试验:在无菌条件下 , 定量吸取真菌原液
加入已灭菌的 PDA 培养基中 , 摇匀后趁热倒入直径为 90mm
的培养皿中制成平板 , 分别配成 0.25g ml 、0.5g ml和 1g ml 的
含药培养基 , 以含氯仿和 85%乙醇的处理为空白对照;用直径
7mm的无菌打孔器切取菌饼置平板中央 , 每皿 1 片 , 每处理 3
次重复 , 28℃培养 3d 后观察并以十字交叉法测量菌落直径 , 计
算生长抑制率。
抑制率=对照菌落直径-处理菌落直径对照菌落直径-7 ×100%
1.2.4.3　天山堇菜提取物的最低抑菌浓度(MIC):分别用氯
仿和 85%乙醇对生物碱和黄酮提取物进行稀释 ,使终浓度为:
0.150 、0.175、0.20、0.25g/mL。对 4 种细菌的抑菌效果见表 5 ,
表中数据为抑菌圈直径(mm)。
2　结果与分析
2.1　天山堇菜提取物的抑菌作用
天山堇菜中的黄酮和生物碱对 4 种细菌均有一定的抑菌
作用 , 并且呈浓度效应。对于肺炎克雷伯菌而言生物碱的抗
菌效果要好于黄酮化合物 , 臭鼻克雷伯菌和类产碱假单胞菌
的黄酮抑菌作用大于生物碱 , 奇异变型杆菌的两种提取物的
抑菌效果相当。见表 1、表2。从表 3、表4 可以看出 ,天山堇菜
的两种提取物对供试真菌的抑菌作用很小 。
2.2　天山堇菜提取物的最低抑菌浓度(MIC)
由表 5 可以看出天山堇菜的两种提取物对肺炎克雷伯菌
的抑菌作用较强一些 ,MIC是 0.175g ml;对臭鼻克雷伯菌而言
生物碱的抑菌作用要大于黄酮 , MIC 分别是 0.15g ml 和
0.175g ml;对类产碱假单胞菌和奇异变型杆菌的抑菌效果较
72　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　生　物　技　术　　　　　　　　　　　　　　　　　2009年 19(2)
弱 ,MIC 都是 0.20g ml。
表 1　不同浓度的天山堇菜生物碱滤纸片法抑制细菌实验结果
Table 1　The antibacterrial activities of different concent rations of alkaloids
f rom Viola tianshanica Maxim.
实验菌种 抑菌圈直径(mm)对照 0.25g ml 0.5g ml 1g ml
肺炎克雷伯菌 7.0 8.3 11.5 17.5
臭鼻克雷伯菌 8.0 9.5 12.0 20.3
类产碱假单胞菌 7.0 7.7 9.1 10.2
奇异变型杆菌 7.0 8.5 9.8 12.5
注:表格中数据均为 3次重复的平均值。
表 2　不同浓度的天山堇菜黄酮的抑制细菌实验结果
Table 2　The antibacterrial activities of different concentrations of flavanones
f rom Viola tianshanica Maxim.
实验菌种 抑菌圈直径(mm)对照 0.25g ml 0.50g ml 1.00g ml
肺炎克雷伯菌 7.0 8.0 10.7 15.3
臭鼻克雷伯菌 8.5 10.0 13.0 23.0
类产碱假单胞菌 7.0 7.9 9.4 11.1
奇异变型杆菌 7.0 8.4 9.3 11.9
注:表格中数据均为 3次重复的平均值。
表 3　不同浓度的天山堇菜生物碱的抑制真菌实验结果
Table 3　The anti-fungus activities of different concentrations of alkaloids from
Viola tianshanica Maxim.
实验菌种 抑制率(%)
0.25g ml 0.50g ml 1.00g ml
稻瘟病菌 5.3 9.4 15.4
意大利青霉 10.4 16.5 25.5
黄瓜疫霉 0 0 0
甜瓜枯萎病毒 0 0 0
瓜类根腐病菌 0 0 0
注:表格中数据均为 3次重复的平均值。
表 4　不同浓度的天山堇菜黄酮的抑制真菌实验结果
Table 4　The anti-fungus lactivities of diff erent concent rations of flavanones
f rom Viola tianshanica Maxim.
实验菌种 抑制率(%)
0.25g ml 0.50g ml 1.00g ml
稻瘟病菌 0 0 0
意大利青霉 5.3 7.5 9.2
黄瓜疫霉 0 1.5 5.3
甜瓜枯萎病毒 0 0 2.4
瓜类根腐病菌 0 0 0
注:表格中数据均为 3次重复的平均值。
3　讨论
据文献[ 3 , 4]报道天山堇菜提取物对枯草芽孢杆菌 、金黄色
葡萄球菌 、大肠杆菌 、痢疾杆菌有一定的抑制作用 , 而本实验
研究发现天山堇菜的提取物对克雷伯菌属的细菌 、类产碱假
单胞菌 、奇异变型杆菌有一定的抑制作用。且首次研究了天
山堇菜中的生物碱的抑菌作用。 克雷伯菌属的细菌为临床感
染常见的病原体之一 , 可引起多种疾病 ,其中尤以肺炎克雷伯
杆菌感染最为常见 , 可引起典型的原发性肺炎以及伤口创面 、
呼吸道 、泌尿道等部位的感染及其败血症 ,甚至引起严重的脑
膜炎 、腹膜炎等[ 7] 。 此类病人大多患有严重的慢性基础性疾
病 ,或因长期住院 、化疗 、插管 , 免疫力降低 , 或长期大量使用
抗生素引起菌群失调有关[ 8] 。臭鼻克雷伯菌可引起慢性呼吸
道疾病和化脓性疾病 , 如脓胸和皮肤感染[9] 。所以对天山堇
菜抑菌的研究可以有效预防和控制克雷伯菌的感染 ,也为可
以合理的使用抗菌药物提供参考。
表 5　天山堇菜提取物的MIC
Table 5　The MIC of Viola tianshanica Maxim.extract
实验菌种 黄酮抑菌圈直径(mm) 生物碱抑菌圈直径(mm)
0.15g ml 0.175g ml 0.20g ml 0.25g ml 0.15g ml 0.175g ml 0.20g ml 0.25g ml
肺炎克雷
伯菌 7.0 7.0 7.5 8.0 7.0 7.0 7.1 8.3
臭鼻克雷
伯菌 7.0 7.2 7.9 10.0 7.0 7.0 7.7 9.5
类产碱假
单胞菌 7.0 7.0 7.0 7.9 7.0 7.0 7.0 7.7
奇异变型
杆菌 7.0 7.0 7.4 8.4 7.0 7.0 7.2 8.5
注:表格中数据均为 3次重复的平均值 ,对照的抑菌圈直径为 7mm。
天山堇菜提取物对植物真菌的抑菌效果很差 , 这种情况
的出现可能是天山堇菜提取物中的有效成分对细菌细胞壁的
破坏作用大于植物真菌的细胞壁。
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华临床医学研究杂志 ,2008 , 14(8):1212-1212.
响应面试验设计优化脱氢酶发酵培养基
李静文 ,路福平＊ ,别松涛 ,张业尼 ,张艺 ,刘瑞娟(天津市工业微生物重点实验室 , 天津科技大学生物工程学院 , 天津 300457)
摘要:目的:对简单节杆菌TCCC11037发酵生产脱氢酶的培养基进行优化。 方法:利用单因子试验筛选出最适碳源为葡萄
糖 ,氮源为酵母膏。采用 Plackett-Burman(P-B)方法筛选出对产酶有重要影响的因素 , 并采用响应面试验设计(RSM)对重要因
素进行优化。结果:葡萄糖 、酵母膏 、KH2PO4 的浓度是影响脱氢酶产生的重要因素。优化后的培养基组成为(%):葡萄糖 1.21 ,
酵母膏 0.65 , KH2PO4 0.24 ,玉米浆 0.8;培养基初始 pH 值 7.0 ,接种量5%,通气条件为装液量 100mL 500mL。结论:优化后脱氢酶
活力达到 24.57μmol (g·min),得到了明显的提高。
关键词:简单节杆菌;脱氢酶;Plackett-Burman;优化;响应面
中图分类号:TQ464.8　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2009)02-0073-04
Application of Response Surface Methodology in Optimizing the
Fermention Conditions for Producing Dehydrogenase
LI Jing-wen , LU Fu-ping＊ , BIE Song-tao , ZHANG Ye-ni , ZHANG Yi , LIU Rui-juan
732009 年 19(2)　　　　　　　　　　　　　　　　　生　物　技　术