全 文 ：第 25卷　第 3期
2009年 5月
福建师范大学学报 (自然科学版 )
Journal of Fujian Normal Univ e rsity ( Na tural Science Edition)
Vo l. 25　 No. 3
May 2009
文章编号: 1000-5277( 2009) 03-0089-05
铁钉菜抗生物质的初步提取及检测
张　迪 1 , 刘艳如 1 , 郑　怡 1* , 林　勇 2
( 1. 福建师范大学生命科学学院 , 福建 福州　 350108;
2. 福建农业科学院土壤肥料研究所 , 福建 福州　 350013)
　　摘要: 对铁钉菜 ( Ishige okamura ) 的乙醚和乙醇总提取物及其不同极性的萃取物的抗生活性进行了测
定 , 包括对细菌、 真菌及藻类的抑制作用 . 结果表明 , 铁钉菜的乙醚、 乙醇总提取物具有较高的抑制细菌活
性 , 对海洋小球藻 (Chlorella spp)和球形棕囊藻 (Phaeocytis globosa )亦有良好的抑制作用 . 铁钉菜不同极
性溶剂的萃取物表现出不同的抗生活性 ,其中氯仿相抑制细菌的能力最高 ,正丁醇相对真菌菌丝的抑制效果
最好 , 而有抑藻活性的成分则主要集中在低极性的石油醚相和氯仿相中 ,氯仿相对供试细菌生长的最小抑菌
质量浓度为 3. 125～ 12. 500 mg /m L. 采用薄层层析分离氯仿组分得到 6个条带 , 其中的 Rf0. 79带的抑菌效
果最好 .
关键词: 铁钉菜 ; 抑菌 ; 抑藻 ; 薄层层析
中图分类号: Q945　　　文献标识码: A
　收稿日期: 2008-09-10
　基金项目: 福建省科技厅重点项目 ( 2005N036)
　作者简介: 张迪 ( 1983—　 ) , 男 , 福建三明人 , 硕士研究生 , ph otoh ost@ 126. com.
* 通讯作者: zy718@ fjnu. edu. cn
Extraction and Determination of Antibiotic Substance
from Ishige okamurai
ZHANG Di
1 , LIU Yan-ru
1 , ZHENG Yi
1* , LIN Yong
2
( 1. College of L ife Sciences, Fujian Normal University , Fuz hou 350108, China;
2. Institute of Soil and Fertilizer Fujian Academy of Agricultural Sciences , Fuzhou 350013, China)
Abstract: The ethano l-ether crude ex t ract and dif ferent ex t ractiv e f ractions of Ishige
okamura were tested for thei r antibio tic activ ities against some fungi, bacteria and alg ae.
The resul ts show ed that crude ex t ract had a good antibacterial activi ty and ef fectiv e resis-
tance to the g row th of Phaeocytis globosa and Chlorella spp. There were di fferent antibio tic
activi ties in ex t ractiv e f ractions wi th dif ferent solvents. Chlorofo rm ex tract had the strongest
inhibi tion to bacteria, n-butyl alcohol ex tract had the st rongest resistance to the g row th of
hypha, pet roleum ether ex t ract and chlo ro fo rm ex tract w ere good in rest raining the g row th of
Phaeocytis globosa and Chlorella spp. The M IC of chlo roform ex tract to the dif ferent tested
bacterium is f rom 3. 125 to 12. 500 mg /mL. Six f ractions w ere got using the thin layer ch ro-
ma tog raphy ( TLC) to separate chloroform ex tract and the best antibacterial activi ty w as
fund in the f raction Rf0. 79.
Key words: Ishige okamurai ; antimicrobial; a ntialg al; TLC
近年来 , 众多的研究表明很多海藻成分具有良好的抗肿瘤、 抗病毒、 抗真菌、 抗细菌、 增强免疫
力及抑制某些靶酶等生物活性 [ 1] . 褐藻又是藻类中高级的一大类群 , 其中的铁钉菜 ( Ishige okamurai )
在我国东海、 南海分布广泛 , 民间用于喉炎、 淋巴结炎、 甲状腺肿的治疗 , 具有清热解毒、 软坚散结
的作用 [2 ] .本文以铁钉菜为材料 ,研究了铁钉菜的乙醇和乙醚粗提物及它们不同有机溶剂萃取物的抗生
活性 , 包括抗菌和抑藻作用 , 并通过薄层层析对高抑菌活性的萃取相进行了初步的分离与检测 , 为进
一步开发利用铁钉菜的天然活性物质提供参考 .
1　材料与方法
1. 1　材料
1. 1. 1　海藻样品
铁钉菜采于福建石狮黄金海岸 , 采集时间为 2007年 6月 . 海藻采回后立即清洗干净 , 室内阴干 ,
保存备用 .
1. 1. 2　供试菌种
细菌: 大肠杆菌 ( Escherichia col i )、金黄色葡萄球菌 ( Staphylococeus aureus )、枯草芽孢杆菌 ( Bacil-
lus subtil is )、 白色念珠菌 (Candida albicans )、 假单胞杆菌 ( Pseudomonas aeruginosa)、 藤黄八叠球菌
( Sarcina lutea)、 烂尾病病原菌 ( Aeromonas sobria) . 真菌: 稻瘟病病原菌 (Piricularia oryzae Cav )、
绿色木霉 ( Trichoderma viride )、 玉米大斑病菌 ( Helm inthos porium turcicicum Pass) . 微藻: 海洋小
球藻 (Chlorella spp)、 球形棕囊藻 ( Phaeocy tis globosa ) . 细菌使用牛肉膏蛋白胨培养基培养 , 真菌使
用 PDA培养基培养 , 海藻使用 f /2培养基培养 .
1. 1. 3　实验试剂与仪器
CM-纤维素钠盐 300-800 (上海润捷化学试剂有限公司 )、薄层层析硅胶 GF254化学纯 (青岛海洋
化工有限公司 ) , 其余有机溶剂均为国产分析纯 .
SHB-IIIS循环水式多用真空泵、 旋转蒸发仪 RE52C、 UD-650型桌上式洁净工作台、 CH-2型显微
镜、 光照培养箱、 JJ200型精密电子天平、 ZF-I型石英紫外检测仪 (上海顾村电光仪器厂 )、 高速万能
粉碎机 (天津市泰斯特仪器有限公司 )、 NovaspecⅢ紫外分光光度计 ( Amersham Biosciences) .
1. 2　方法
1. 2. 1　铁钉菜粗提物的制备
将已经在通风处阴干的铁钉菜 ,于 45℃下烘干 24 h后用高速万能粉碎机粉碎成粉末 .取铁钉菜粉
末 1. 5 kg , 依次用藻粉 3倍体积量的乙醇和乙醚浸泡提取 , 每种溶剂反复浸提 3次 , 每次 10 d左右 .
将提取液过滤、 减压浓缩后合并两种提取物得到总提物 118. 74 g , 占藻粉总质量的 7. 92% .
1. 2. 2　溶剂萃取
将制得的铁钉菜总提取物 (浸膏 ) 以 50%甲醇溶解后 , 依次用石油醚、 氯仿、 乙酸乙酯萃取 , 蒸
掉甲醇补加适量水确保充分溶解 , 再用水饱和的正丁醇进行萃取 , 每种溶剂重复萃取 3次 , 将萃取液
合并得到 5种萃取物溶液 ,水相经检测基本无活性弃去 .将萃取收集的各相溶剂蒸干获得萃取浸膏 ,分
别得到石油醚相浸膏 63. 36 g , 氯仿相浸膏 5. 3 g , 乙酸乙酯相浸膏 19. 58 g ,正丁醇相浸膏 15. 1 g. 称
取浸膏若干 , 加入相应溶剂 , 充分溶解 , 配制成质量浓度为 100 mg /mL的相应药液备用 .
1. 2. 3　薄层层析
将抑菌活性最强的氯仿相萃取物进行薄层层析分离 ,用 GF254薄层层析硅胶自制层析板 ,按 m (硅
胶 ) ∶ V ( CMCNa 0. 5%的溶液 ) = 1∶ 3的比例制作 [3 ] . 展层剂为 V (氯仿 )∶ V (甲醇 )∶V (丙酮 ) =
16∶ 2∶ 1 (以上化学试剂均为分析纯 AR) ,石英紫外检测仪下检测 ,计算各分离带的比移值 Rf ,刮取、
收集相同条带 , 加入等量无水乙醇溶解 , 离心取上层清液并适当浓缩备用 .
1. 2. 4　抑菌和抑藻活性检测方法
细菌抑菌活性检测采用圆形纸片扩散法 . 分别刮取供试菌菌苔 1环于 5 mL无菌水中 , 摇匀菌悬
液 , 倒入熔化并冷却至 40～ 50℃的培养基中 , 摇匀后 , 迅速分装于培养皿中 , 待凝固后备用 . 取已消
毒过的圆形滤纸浸取相应的提取液 , 略干后平贴于培养基平板上 , 同时用相应的溶剂做空白对照 . 置
恒温培养箱中培养 ( 26～ 27℃ , 18～ 24 h)后分别观察结果 , 测量抑菌圈 [4- 5 ] . 以上步骤均按无菌条件
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操作 , 每个样品设 2个平行样 , 结果取平均值 .
真菌的抑菌活性检测采用菌丝生长速率法 [3 ] . 准确将 1 m L药液均匀涂布 PDA培养基上 , 对照则
涂布相同体积的溶剂 . 在培养 3～ 4 d的供试菌平板上 ,用直径为 1. 0 cm的打孔器制成若干菌饼 ,用接
种针挑取菌饼轻放于含药培养基平面中央 (有菌丝的一面向下 ) , 每培养皿放置 1个菌饼 . 每处理重复
3次 . 28℃下培养一定时间后测量菌落的直径 ,按以下公式计算不同处理对供试菌的菌丝生长抑制率 .
菌丝生长抑制率 /% = (对照菌落直径-处理菌落直径 ) / (对照菌落直径 -菌饼直径 ) × 100% .
抑藻活性的检测: 取处于指数生长期的球形棕囊藻、 海洋小球藻 , 加入 f /2培养液配制成 3× 108 ,
8× 108 L- 1的藻液 ,每 100 mL分装于 250 mL锥形瓶中并分别加入药剂置于恒温光照培养箱中培养 ,温
度为 20± 1℃ ,光照条件为 12 h光照 , 12 h黑暗 ,光照强度为 3 000 lx . 每隔 36 h用血球计数板计数 [6 ]
1次并记录数据 , 每隔 24 h用分光光度计测量 (海产小球藻 570 nm, 球形棕囊藻 680 nm)并扣除加入
药剂自身的吸光值后记录数据 [ 7- 8 ] .
2　结果与分析
2. 1　粗提物的抗菌和抑藻活性
用圆形纸片法测定了质量浓度为 100 mg /mL的铁钉菜粗提物对 7种供试细菌的抑制活性 ,结果表
明 (见表 1) , 总提取物对不同的细菌抑制能力不一样 , 其中对八叠球菌的抑制能力最强 , 对白色念珠
菌、 枯草芽孢杆菌、 烂尾病病原菌的抑制能力也比较强 , 抑菌度都大于 5 mm, 而对假单胞杆菌、 大肠
杆菌基本没有表现出抑制效果 .
表 1　总提取物的抗细菌活性
S. l C. a B . s A . s S. a P . f E . c
抑菌圈直径 /mm 10. 1 8. 4 7. 6 6. 1 1. 0 0. 0 0. 0
活性 + + + + + + + + + + - -
空白 - - - - - - -
注: S. a为金黄色葡萄球菌 , E. c为大肠杆菌 , B. s为枯草芽孢杆菌 , S . l为八叠球菌 ,C . a为白色念珠菌 ,P . f 为假单胞杆菌 ,
A. s为烂尾病病原菌 . + + + : 抑菌圈宽度 > 10 mm; + + : 10 mm > 抑菌圈宽度 > 5 mm; + : 5 mm > 抑菌圈宽度
> 0 mm; - : 未发现 , 下同
用菌丝生长速率法测定了铁钉菜粗提物 (质量浓度为 100 mg /mL) 对稻瘟病菌、 绿色木霉、 玉米
大斑病菌的菌丝抑制实验结果 (见表 2)表明 , 粗提物对供试真菌的菌丝生长普遍有抑制作用 , 但抑制
能力不强 .
表 2　总提取物抗真菌活性
供试真菌 t培养 /h 抑制率 /%
P .o 30 54. 9
Y . v 50 58. 6
72 42. 7
H . p 50 32. 4
72 37. 0
　　　　　　　　　注: P. o为稻瘟病菌 , Y . v为绿色木霉 , H. p为玉米大斑病菌 , 下同
图 1　不同藻培养时间与藻细胞密度的关系
通过 1. 2. 3中所述的藻细胞计数法测定了质量浓度为
0. 1 mg /mL的铁钉菜粗提物对球形棕囊藻和海产小球藻
生长的影响 .结果如图 1所示 ,两种藻的粗提物处理组的藻
细胞密度较乙醇空白组几乎没有增加 , 说明铁钉菜粗提物
对球形棕囊藻和海产小球藻的生长有抑制作用 .
2. 2　萃取物的抗菌和抑藻活性
质量浓度为 100 mg /mL铁钉菜不同萃取组分抑制细
菌活性的纸片法测定结果如表 3所示 , 氯仿组分的抑制细
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菌能力最强 , 对 7种菌都有不同程度的抑制作用 , 具有一定的广谱性 , 因而将氯仿相通过薄层层析作
进一步分离 , 并测定最低抑菌质量浓度 .
表 3　不同萃取组分的抗细菌活性
供试细菌 抑菌圈宽度 /mm石油醚 氯仿 乙酸乙酯 正丁醇
E . c 0. 0 14. 5 0. 0 0. 0
P . f 0. 0 10. 6 0. 0 0. 5
S. a 0. 0 7. 6 3. 8 5. 1
S. l 0. 0 5. 9 3. 1 3. 9
A . s 0. 0 5. 9 1. 3 3. 0
B . s 0. 0 4. 9 1. 0 2. 9
C. a 0. 0 3. 8 0. 0 0. 0
　　质量浓度为 100 mg /mL的不同萃取组分对真菌菌丝生长的测定结果 (见表 4)表明正丁醇组分抑
制真菌活性明显高于其他组分 , 其中对稻瘟病菌、 绿色木霉、 玉米大斑病菌在 24～ 48 h对菌丝的抑制
效果明显且持续时间长 , 因此 , 铁钉菜提取物中具有抑制真菌菌丝活性的物质大部分存在于正丁醇萃
取相中 .
表 4　不同萃取组分的真菌抑菌活性
供试真菌 t培养 /h 抑制率 /%氯仿 乙酸乙酯 正丁醇 石油醚
P . o
24 81. 8 82. 5 100 49. 3
36 36. 0 55. 7 98. 7 8. 3
Y . v
24 74. 1 1. 7 81. 3 - 46. 6
36 57. 1 31. 3 100 - 20. 2
48 33. 9 9. 7 92. 7 21. 8
H . p
36 40. 7 57. 6 100 8. 5
48 26. 7 48. 7 94. 5 5. 5
　　　　　注:负值为促进作用
图 2　海产小球藻培养时间与藻液吸光度的关系 图 3　球形棕囊藻培养时间与藻液吸光度的关系
通过测吸光度法测定了质量浓度为 0. 1 mg /m L的不同溶剂萃取物 (每 100m L藻液加入 100μL丙
酮溶解的质量浓度为 100 mg /mL的提取物 )对球形棕囊藻和海产小球藻生长的影响 . 从图 2和图 3中
可以看出铁钉菜提取物的石油醚相、 氯仿相对海产小球藻与球形棕囊藻有明显的抑制作用 , 乙酸乙酯
相对海产小球藻与球形棕囊藻也有一定的抑制作用 , 而正丁醇相对球形棕囊藻则表现出促进作用 .
2. 3　氯仿相的最低抑制质量浓度与薄层层析
采用倍半稀释法 [9- 10 ]测定氯仿相的最低抑菌质量浓度 , 结果如表 5所示 . 烂尾病病原菌、 大肠杆
菌、 枯草芽孢杆菌对氯仿组分比较敏感 , 达到 3. 125 mg /mL, 而八叠球菌、 白色念珠菌、 假单胞杆菌
次之 , 为 6. 250 mg /mL, 金黄色葡萄球菌最不敏感 , 为 12. 500 mg /mL.
对氯仿相进行硅胶薄层层析分离得到了包括基带在内的 6个条带 , 各条带分离物抑菌活性的实验
结果表明 (见表 6) ,不同条带有不同程度的抑菌作用 ,其中 Rf0. 79和 Rf 0. 96条带的抑菌能力比较强 .
特别是 Rf0. 79条带对所有供试菌均有抑制作用而且效果相对也较好 .
92 福 建 师 范 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 　　　　　　　　　　　 2009年　
表 5　氯仿组分最低抑制细菌质量浓度
供试菌株 空白 d/( mg m L- 1 )
100. 000 50. 000 25. 000 12. 500 6. 250 3. 125
E . c - + + + + + + + + + + -
A . s - + + + + + + + -
B . s - + + + + + + + + -
P . f - + + + + + - -
C . a - + + + + - -
S. l - + + + + - -
S. a - + + + + - - -
表 6　氯仿相薄层层析分离组分的抑菌活性
层析带 S. l C . a B . s A . s S. a P . f E . c
Rf 0. 00 + + - - - - -
Rf 0. 46 - + - - - - -
Rf 0. 58 - + - - - - -
Rf 0. 67 + + - - - - -
Rf 0. 79 + + + + + + +
Rf 0. 96 + + + + - - +
　　　　注: + : 有抑制作用 ; - : 无抑制作用
3　讨论
铁钉菜粗提物对大肠杆菌和假单胞杆菌抑制作用不明显 , 但是经萃取分离后出现的氯仿组分却表
现了较高的抑菌活性 , 这可能与 Robles and Ballantine ( 1999) [ 11]所提到的拮抗作用有关 , 在粗提物中
一些活性物质互相拮抗 , 而经过萃取后其中某些物质被分开了 , 于是表现出抑菌的活性 , 也有可能是
通过萃取分离后其中某些有效成分浓度的增加而导致的 . 同时 , 实验中也发现铁钉菜粗提物对白色念
珠菌、 八叠球菌的抑制作用强于萃取分离后组分的作用 , 这可能与粗提物中一些活性物质的协同作用
有关 .
铁钉菜粗提物经萃取分离后 , 正丁醇相对供试真菌的菌丝生长有良好的抑制效果 , 而氯仿相的抗
细菌效果最好 , 表明抗细菌和抗真菌活性物质在不同极性溶剂萃取相的含量和分布不一样 , 这为抗细
菌或抗真菌有效成分的进一步分离纯化提供了有用的帮助 .
本文通过对铁钉菜氯仿萃取相进行薄层层析分离发现展层剂 ( V (氯仿 )∶V (甲醇 )∶V (丙酮 ) =
16∶ 2∶ 1 )分离铁钉菜氯仿相具有较好的分离效果 . 薄层层析分离分得到的各个条带中 , Rf0. 79条带
的抗菌谱广 , 效果也相对较好 , 其中的活性成分有待于进一步的分离和分析鉴定 .
抑藻实验的结果说明铁钉菜提取物中存在能够抑制海产小球藻和球形棕囊藻生长的活性物质 , 而
且通过萃取物的抑藻实验可以发现这些抑藻活性成分主要存在于极性较低的萃取相里 , 这与李锋民 [12 ]
等在芦苇抑藻化感物质研究中的结论有所不同 , 其最佳抑藻组分出现在极性较强的水相中 . 虽然实验
结果说明铁钉菜提取物对海产小球藻和球形棕囊藻确有抑制作用 ,但实验条件毕竟不同于自然条件 ,在
实际水体中铁钉菜乙醇提取物的实际灭藻效果尚须进一步验证 .
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