全 文 ：收稿日期:2004-02-22
作者简介:陈晓辉 ,女 ,理学博士 , Tel:(024)23843711-3363 , E-mail:cxh88820022002@yahoo.com.cn.
制备反相高效液相色谱法用于从杉材中分离制备倍半萜类化合物
陈晓辉1 , 　张晖芬1 , 　毕开顺1 , 　金哲史2 , 　崛池 道郎2
(1.沈阳药科大学药学院 , 辽宁 沈阳 110016;2.日本爱媛大学生物资源利用学科 , 日本 高知 783-8502)
摘要:利用制备高效液相色谱法从日本产杉材(Cryptomeria japonica D.Don)中分离制备倍半萜类化合物。 在
YWC-Pack C18柱上 , 以异丙醇-甲醇-正己烷-水(体积比为 50∶35∶10∶5)为流动相 , 流速为 5 mL/min, 制备了 2 种倍
半萜类化合物 , 经紫外光谱 、红外光谱及核磁 、质谱分析 , 确认它们分别为(-)-cubebol和(+)-2 , 7(14), 10-bisa-
bolat rien-1-ol-4-one。所制备的两个化合物的纯度分别为 98.7%和 99.1%。
关键词:制备液相色谱;倍半萜类化学成分;杉材
中图分类号:O658　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-8713(2005)01-0085-03
Isolation and Preparation of Sesquiterpenols from the Japanese
Cedar , Cryptomeria japonica D.Don by Preparative
Reversed-Phase High Performance Liquid
Chromatography and Its Characterization
CHEN Xiaohui1 , ZHANG Huifen1 , BI Kaishun1 , KIM Chul-Sa2 , HORIIKE Michio2 ,
(1.School of Pharmacy , Shenyang Pharmaceutical University , Shenyang 110016 , China;
2.Department of Bioresources Science , Faculty of Agriculture , Ehime University , Kochi 783-8502 , Japan)
Abstract:A method for the isolation of sesquiterpenols from the Japanese Cedar , Cryptomeria
japonica D.Don by preparative reversed-phase high performance liquid chromatography (RP-
HPLC)was established.The preparation of the sesquiterpenols was carried out on a preparative
liquid chromatograph with a YWC-Pack C18 column , and the mobile phase was isopropanol-
methanol-hexane-water(50∶35∶10∶5 , v/v)at a flow rate of 5.0 mL/min.The two sesquiter-
penols , (-)-cubebol and(+)-2 ,7(14),10-bisabolatrien-1-ol-4-one , were separated by liquid chro-
matography and identified by spectroscopic analyses (ultraviolet (UV), infrared (IR), nuclear
magnetic resonance(NMR), electrospray ionization mass spectrometry(ESI-MS)).The purities
of the two sesquiterpenols were 98.7%and 99.1%, respectively.
Key words:preparative high performance liquid chromatography;chemical constituents of
sesquiterpenols ;Cryptomeria japonica D.Don
　　杉材是日本森林资源的代表之一 ,在日本的人
工林中占有 37%的比例 。中国的南部(包括台湾)
以及韩国也有分布。因为它的资源丰富 ,国外学者
从 20世纪 60年代就开始对其开展药理以及生理活
性的研究[ 1～ 3] ,其中杉材中的萜类和酚性成分的杀
虫 、抗菌作用的报道很多[ 4～ 7] 。本文作者为进一步
开发其资源利用 ,确定其药理活性成分的结构 ,利用
制备液相色谱的分离纯化技术对杉材(Cryptome-
ria japonica D.Don)中的萜类化学成分进行了系
统的研究 ,从杉材中提取分离出 2 个萜类化合物 。
经紫外光谱(UV)、红外光谱(IR)、核磁共振谱
(NMR)和质谱(MS)等技术的鉴定 ,所分离出的化
合物属于倍半萜类化合物 ,分别为(-)-cubebol和
(+)-2 , 7(14), 10-bisabolatrien-1-ol-4-one。其中
(-)-cubebol为首次在杉材中得到。
1　实验部分
1.1　仪器与材料
　　Shimadzu LC-10A 高效液相色谱仪 , 配 HI-
TACHI L-6000泵 ,Hitachi L-4000 UV(254 nm)检测
器;Shimadzu GC-14A气相色谱仪;JEOL MS 600气
质联用仪(GC-MS);Shimadzu FTIR-4300红外光度
计;Bruker ARX 500(500 MHz)及 JEOL JNM-LA
400(500 MHz)核磁共振分光仪(NMR),以四甲基硅
2005年 1月
January 2005
色 谱
Chinese Journal of Chromatography
Vol.23 No.1
85 ～ 87
烷(TMS)为内标 , CDCl3 为溶剂;HORIBA SEPA-200
旋光度测定仪 ,以氯仿为溶剂 。
　　试剂均为色谱纯和分析纯 。柱色谱用硅胶(100
～ 200目)。杉材来自于日本四国地区 。
1.2　实验条件
　　分析型高效液相色谱条件:分析色谱柱 Sym-
metry Shield C18(150 mm×3.9 mm i.d., 5μm),流
动相Ⅰ为甲醇-水(体积比为 90∶10)溶液 ,流速 0.8
mL/min。
　　制备型高效液相色谱条件:制备色谱柱 YWC-
Pack C18(300 mm×10 mm i.d., 10 μm),流动相 Ⅱ
为异丙醇-甲醇-正己烷-水(体积比为 50∶35∶10∶5)
混合溶液 ,流速 5 mL/min。
　　气相色谱条件:色谱柱 CBPI(25 m×0.22 mm
i.d., 0.25 μm),采用氢火焰离子化检测器(FID),
进样口温度 250 ℃, 色谱柱升温程序为 100 ℃(2
min)10 ℃/min 250 ℃(30 min)。
1.3　杉材中倍半萜类化合物的提取分离
　　取经粉碎并过 20目筛的杉材粉末 500 g ,用甲
醇 1 L 在室温下浸泡 72 h ,过滤 ,反复浸提 2 次后 ,
将得到的甲醇浸提液合并 ,减压浓缩干燥 ,得甲醇提
取物(10.2 g)。取甲醇提取物 5 g ,与 200 mL 水混
悬后 ,依次用正己烷 、醋酸乙酯萃取(每次 200 mL ,
分别萃取 3次),得正己烷萃取物(4.5 g)和醋酸乙
酯萃取物(4.0 g)。对得到的醋酸乙酯萃取部分另
做酚类化合物的研究 。本文重点对正己烷萃取部分
的化学成分进行研究。
　　取正己烷萃取物(0.9 g),经自制硅胶色谱柱
(230 mm×17 mm i.d.,硅胶 40 g)分析 ,用正己烷-
醋酸乙酯(体积比为 20∶80)混合溶液洗脱 ,得 Fr-
Ⅰ-1和 Fr-Ⅰ-2两部分。
　　将 Fr-Ⅰ-1洗脱液浓缩至干 ,用流动相 Ⅱ溶解
至其质量浓度为 1 g/L ,作为制备液相色谱用供试
品溶液 。制备液相色谱的分离条件如“1.2”节所述 ,
每次进样 500 μL ,分别收集 A , B , C , D部分(见图 1-
a)。再将 Fr-Ⅰ-2 洗脱液浓缩至干 ,用流动相 Ⅰ溶
解后 ,从液相色谱分析(分析条件见“1.2”节所述)的
色谱图中各峰面积来看其含量很少 ,因此没有继续
进行制备液相色谱的分离 。将 Fr-Ⅰ-1供试品溶液
用制备液相色谱分离 ,收集到 FrB和 FrD两部分 ,
对它们进一步用制备液相色谱精制 、纯化 ,经冷冻干
燥后 ,分别得到单一化合物 B(保留时间为 12.25
min ,见图 1-b)和化合物 D(保留时间为 16.71 min ,
见图 1-c)。为了验证得到的两个化合物是否为单一
成分 ,分别改变流动相系统为乙腈-水(体积比为 90
∶10)并用 Waters 公司的色谱柱 Nova-Pak C18(25
cm×4.6 mm i.d., 5 μm)分析后 ,证明化合物 B和
D(保留时间分别为 9.18和 12.23 min)仍然为单一
的色谱峰 ,再经气相色谱(分析条件如“1.2”节所述)
分析 ,化合物 B 和 D(保留时间分别为 11.71 和
13.01 min)仍然为单一的色谱峰 ,进一步验证了化
合物 B和 D均为单一的成分 。
图 1　供试品溶液(a)及图 1-a中成分 B(b)和成分 D(c)的色谱图
Fig.1　Chromatograms of sample solution(a), and prepared components B(b)andD(c)in Fig.1-a
2　结果与讨论
2.1　化合物 B和 D的结构鉴定
　　经红外光谱 、高分辨率的 GC-MS、NMR的进一
步鉴定 ,化合物 B为(-)-cubebol 、化合物 D为(+)-
2 ,7(14), 10-bisabolatrien-1-ol-4-one。
2.1.1　化合物 B
　　外观:白色结晶性粉末。旋光度[ α] 20D :-48.4°
(溶剂 CHCl3)。GC-MS , t R:8.44 min;m/z:222
(M+ ,相对丰度 7.9%), 207(相对丰度 95.3%), 204
(相对丰度 54.2%),189(相对丰度 9.1%), 179(相
对丰度 13%), 161(相对丰度 100%),121(相对丰度
·86· 色 谱 第 23卷
21.7%), 119(相对丰度 29.4%), 105(相对丰度
35.0%), 91(相对丰度20.8%)。 IR(νmax/cm-1)(液
膜法):3 380(OH), 1 680 (C O)。 1H-NMR(CD-
Cl3), δ:1.84(1H , ddd , H-2a), 1.66(1H ,m , H-10),
0.97(3H ,d , H-13), 0.94(3H , d , H-14), 0.91(3H , d ,
H-12), 0.87(1H , d , H-5), 0.83(1H , dd , H-6), 0.82
(1H , m , H-8b), 0.52(1H , dddd , H-9b)。 13C-NMR
(CDCl3), δ:80.3(s , C-4),44.1(d , C-7), 39.0(d , C-
5),36.3(t ,C-3), 33.6(d ,C-11), 33.4(s , C-1), 31.7
(t , C-9), 30.8(d , C-10), 29.5(t , C-2), 27.9(q , C-
15), 26.5(t , C-8), 22.5(d , C-6), 20.1(q , C-14),
19.6(q , C-13), 18.7(q , C-12)。其1H-NMR 和 13C-
NMR数据以及旋光度值均与文献[ 8 ～ 11] 中(-)-
cubebol值一致 。此化合物为首次从杉材中获得。
2.1.2　化合物 D
　　外观:无色的油状液体。旋光度[ α] 20D :+130.0°
(溶剂 MeOH)。GC-MS , t R:12.26 min;m /z:234
(M+ ,相对丰度 24.4%),173(相对丰度 33.9%),124
(相对丰度 15.9%), 109(相对丰度 22.8%),98(相对
丰度 60.9%), 93(相对丰度 13.6%), 70(相对丰度
19.8%), 69(相对丰度 100%), 41(相对丰 度
63.4%)。IR(νmax/cm-1)(液膜法):3 400(OH),
1 680 (C O)。 1H-NMR(CDCl3), δ:6.71(1H ,dq ,
H-2), 5.10(1H , tqq , H-10), 5.03(2H , br.s , H-14),
4.50(1H , br , dd , H-1), 2.68(1H , ddd , H-6), 2.55
(1H ,dd ,H-5b),2.36(1H ,dd , H-5a),2.17(2H ,m ,H-
9), 2.10(1H , br.s , OH), 2.09(2H , m , H-8), 1.80
(3H , dd , H-15), 1.69(3H , br.d , H-12), 1.62(3H ,
br.d , H-13)。 13C-NMR(CDCl3), δ:198.4(s ,C-4),
147.5(s , C-7),147.3(d , C-2),135.1(s , C-3), 132.6
(s ,C-11),123.4(d ,C-10), 112.7(t ,C-14), 69.3(d ,
C-1),52.0(d , C-6),41.6(t ,C-5),33.3(t ,C-8),26.3
(t ,C-9), 25.7(q , C-12), 17.8(q , C-13), 15.3(q , C-
15)。其1H-NMR和13C-NMR数据以及旋光度值均
与文献[ 12] 中(+)-2 , 7(14), 10-bisabolatrien-1-ol-
4-one值一致 。
2.2　讨论
2.2.1　提取条件的选择
　　本实验利用制备液相色谱从杉材中得到两个半
萜类化合物:(-)-cubebol和(+)-2 , 7(14), 10-bis-
abolatrien-1-ol-4-one , 纯 度 分 别 为 98.7% 和
99.1%。
　　由于提取的成分为半萜类化合物 ,为了避免分
离成分在前处理时影响其稳定性 ,药材的提取采用
冷浸法。本实验溶剂蒸发的全过程均在 40 ℃以下
进行。
2.2.2　流动相 、进样量的优化
　　本实验的目标化合物为非极性的萜类化合物 ,
制备液相色谱的条件曾采用正相色谱法 ,用示差检
测器检测;因所用试剂正己烷较贵 ,考虑到经济性和
实用性 ,又摸索了反相制备色谱的条件 。最初选择
甲醇-水溶液作流动相 ,目标化合物在 C18柱上的保
留作用非常强 ,因而常规的甲醇-水二元流动相溶剂
强度较弱 ,不适合这类化合物的分离 。本研究在甲
醇-水体系中加入异丙醇 、正己烷调节洗脱强度 。实
验表明 ,该流动相系统能够满足分离要求 ,保留时间
适宜。
　　为了获得高纯度的化合物单体 ,提高产率 ,便于
收集 ,本制备方法中的样品浓度可稍高些 ,但进样体
积不宜过大 。
　　本实验的杉材来源于日本四国地区 ,中国本属
的杉材活性成分的研究以及各成分的含量与日本产
杉材的比较正在研究中 。
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·87·　第 1期 陈晓辉等:制备反相高效液相色谱法用于从杉材中分离制备倍半萜类化合物