全 文 ：收稿日期:2004-08-16
基金项目:江西省自然科学基金资助项目(0430014).
作者简介:朱柏芳(1976-),男 ,江西丰城人 ,硕士生 , 主要从事植物生态学研究.
文章编号:1000-5862(2005)02-0142-04
RAPD法研究穗花杉遗传多样性
的反应条件优化
朱柏芳1 , 2 , 　朱　笃1 , 　李思光2 , 　刘如龙1 , 　邓荣根1
(1.江西师范大学 生命科学学院 ,江西 南昌　330027;2.南昌大学生物工程系 ,江西 南昌　330047)
摘要:以改进 CTAB 法抽提的中国特有濒危植物穗花杉嫩叶总 DNA 为模板 , 进行随机扩增多态性 DNA
(RAPD)最佳条件优化 , 结果表明:RAPD分析最佳反应体系为 10×Buffer缓冲液 2 μL, 模板 70 ng ,Mg2+
2.0 mmol/L , dNTPs 0.2 mmol/ L ,引物 0.60μmol/ L, Taq酶 1.5 U , PCR反应体积为20 μL.最佳扩增程序为 94
℃ 5 min , 1 个循环;94 ℃ 1 min、37 ℃1 min、72 ℃2 min , 40 个循环;72 ℃ 10 min , 1个循环.
关键词:穗花杉;RAPD;反应参数;优化
中图分类号:Q 948.1　　　文献标识码:A
穗花杉〔Amentotaxus argotaenia (Hance)Pilger〕属红豆杉科穗花杉属植物 ,为我国特有国家三级保护植
物 、第三世纪残余物种 ,对研究我国南方植物区系的发生 、演化有重要的价值[ 1] .由于穗花杉形态特殊 、树姿
优美 、种子成熟时具鲜红色的假种皮以及材质优良 ,可作为优良的庭园观赏树种以及上等的用材树种.
随机扩增多态 DNA(Random amplified polymirphism DNA , RAPD)分析是建立在 PCR反应基础上的一种的
分子生物学技术 ,它具有引物可以随机设计 、所需 DNA量少 、操作技术简单 、快速等优点[ 2] ,近年来已被广泛
应用于分析物种的遗传多样性.但由于其重复性 、稳定性较差 ,因此必须对其扩增反应条件进行优化.本实
验对穗花杉 RAPD反应条件进行了优化 ,旨在为后续遗传多样性的分析建立一个最优的 RAPD扩增体系.
1　材料与方法
1.1　供试材料　实验用穗花杉叶片采自江西宜丰官山.采后立即冰冻 ,带回实验室洗净 、晾干后置于-70
℃超低温冰箱中保存备用.
1.2　实验试剂及仪器　TaqDNA聚合酶购自 TaKaRa公司 ,Mg2+、dNTPs 、随机引物 、λDNA/Hind III +EcorRI
Marker和GeneRuler/100bp DNA Ladder Plus Marker均购自上海生工公司;PCR仪为 PTC-200型(美国MJ Re-
search公司);电泳仪及电泳槽均由北京六一厂生产;UPV-8000凝胶成像系统为 Ultra-Violet Products Ltd生
产;2000型 &UV-型分光光度计为尤尼柯(上海)仪器有限公司生产.
1.3　模板 DNA的制备与定量　参照 CTAB改良法[ 3] ,称0.125 g新鲜叶片 ,用液氮研磨成粉状 ,转入 1.5mL
离心管中.加入 1 mL 、-20 ℃的丙酮 ,轻轻震荡 1 min后于 5 000 rpm离心 10 min ,去上清后再重复上述丙酮
处理一次.向管中加入预热 60 ℃的 CTAB 1 mL ,60℃温育4 h ,后加入 500μL 氯仿∶异戊醇(24∶1),抽提 10min
后以 13 000 rpm 离心 10 min ,取上清重复上述抽提直至不见蛋白沉淀.取上清加入2/3体积的冷异丙醇 ,轻轻
混匀后 ,于 2 000 ～ 3 000 rpm 离心3 min.沉淀用 70%的乙醇在室温洗涤 20min后 ,1 000 rpm 离心 10 min.沉淀
于室温干燥后用 50 μL TE缓冲液溶解.采用紫外可见分光光度计测定 DNA纯度和含量.
1.4　RAPD扩增反应实验中各影响因素的选择　本实验选用引物S41(ACCGCGAAGG)对各反应因素进行优化.
(1)模板 DNA含量对 RAPD扩增反应的影响:实验中设置模板含量梯度分别为 15 ,25 ,35 ,50 ,70 , 100 , 130
第 29 卷第 2期
2005 年 3 月　
江西师范大学学报(自然科学版)
JOURNAL OF JIANGXI NORMAL UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE)
Vol.29 No.2
　Mar.2005
DOI :10.16357/j.cnki.issn1000-5862.2005.02.014
ng.(2)TaqDNA聚合酶含量对 RAPD扩增反应的影响:实验中设置酶含量梯度分别为 0.5 ,0.8 ,1.0 ,1.5 , 2.0 ,
2.5 U.(3)Mg2+浓度对 RAPD扩增反应的影响:实验中设置Mg2+浓度梯度分别为 1.0 , 2.0 , 2.5 ,3.0 ,3.5 ,4.0
mmol/L.(4)dNTP 浓度对 RAPD扩增反应的影响:实验中设置 dNTP 的浓度梯度分别为 0.15 , 0.20 , 0.25 ,
0.30 ,0.35 mmol/L.(5)引物浓度对 RAPD扩增反应的影响:实验中设置引物浓度梯度分别为 0.15 , 0.30 ,
0.45 ,0.60 ,0.75 , 0.90 μmol/L.
以上除扩增反应变量外 ,其余试剂的用量及反应条件为:模板量 70 ng 、2×Taq酶 buffer 2μL , 0.2 mmol/
LdNTP 、2.5mmol/L Mg2+浓度 、1.5 UTaq酶 、0.45μmol/L引物.扩增反应完成后 ,取 10μL的产物在 1.4%的琼
脂糖凝胶上 ,1×TBE缓冲液中电泳 ,稳压电泳 2 h左右 ,Marker作分子量标准 ,用凝胶成相仪拍照检测.
2　结果与分析
2.1　基因组 DNA的检测　用改良 CTAB 对穗花杉基因组进行提取 ,经电泳分析显示其大小为 23 kb 左右
(图1 ,M为标准分子量参照物 ,以下同).通过紫外分光光度计测定基因组DNA含量和纯度.本实验对比了几
种处理方法对基因组 DNA提取的影响 ,结果表明:与未用丙酮进行前处理相比 ,提取穗花杉基因组 DNA采
用丙酮前处理去除色素 ,所得提取产物基因组 DNA物纯度较高 ,故在提取基因组 DNA前用丙酮进行处理.
同时研究表明 ,在 2 ～ 4 h范围内 ,CTAB抽提时间的长短对提取的基因组DNA产量和纯度影响不大.
2.2　模板含量对 RAPD扩增反应的影响　据文献报道 ,在 RAPD分析时 ,不同植物所需的模板 DNA量各不
相同.为确定穗花杉 RAPD扩增反应所需最适模板 DNA量 ,本实验共设置了 7个模板 DNA含量梯度进行优
化.由 PCR扩增结果可知(图 2),在模板含量为 15 ng和 25 ng时 ,电泳图谱未见有扩增条带.在 35 ,50 ,70 ng
时 ,电泳图谱可见清晰稳定的扩增条带.随着模板 DNA量继续增加 ,电泳图谱上扩增条带弥散不清晰.一般
认为模板浓度在一定范围内不会影响扩增条带的数量 ,即不会导致扩增位点的增减 ,但对扩增产量有影
响[ 4] ,本实验结果与此一致.因此根据上述结果 ,确定穗花杉 RAPD反应采用 50 ～ 70 ng 的模板即可.
2.3　TaqDNA聚合酶含量对 RAPD扩增反应的影响　RAPD扩增产物的质和量与 Taq DNA聚合酶的含量密
切相关 ,酶含量的高低直接影响扩增反应的效果.TaqDNA聚合酶含量过高时会有小片段产生 ,从而使电泳带
型呈现弥散状态 ,背景非常严重;TaqDNA 聚合酶含量过低则导致扩增条带太弱.在本实验中 ,当酶含量为
0.5 U ,电泳图谱上没出现扩增产物条带;在 0.8 ～ 2.5 U ,电泳图谱上扩增产物条带稳定 ,清晰;随着酶浓度的
增加 ,电泳图谱上扩增产物条带数不清晰(图 3).从实验效果及节约实验费用的角度考虑 ,穗花杉 RAPD反
应体系宜采用酶含量为 1.5 U.
图 1　穗花杉基因组凝胶电泳结果　　　　　　　　图 2　模板 DNA 含量对 RAPD扩增的影响
　　　1.丙酮处理后抽提 4 h;2.未用丙酮处理 ,抽提 2 h;　　　　　　1～ 7:DNA模板含量分别为 15 , 25 , 35, 50 ,70 , 100, 130 ng.
　　　3.未用丙酮处理 ,提抽 4 h.
2.4　Mg2+浓度对 RAPD扩增反应的影响　在本实验中 ,Mg2+浓度在 1.0 ～ 2.5 mmol/L 时 ,电泳图谱上扩增
产物条带清晰且稳定 ,但在 2.0 mmol/L 扩增产量最大 .随着Mg2+浓度的增大 ,扩增产物量较少(图 4).产生
此现象的原因可能为:(1)Mg2+是 TaqDNA聚合酶的激活剂 ,其浓度的变化将影响酶活性 ,在Mg2+的浓度较
低时 ,Taq酶可结合的游离Mg2+相对来说较少 ,酶活力较低 ,因而扩增反应的产物较少.(2)Mg2+可和 RAPD
143第 2期 朱柏芳 , 等:RAPD 法研究穗花杉遗传多样性的反应条件优化
扩增反应混合物中 DNA模板 、引物和 dNTP 的磷酸基团相结合 ,当 Mg2+浓度高到一定程度时 ,会拮抗 dNTP
和模板的有效含量 ,最终影响扩增结果[ 5 ,6] .
图 3　Taq 酶单位对 RAPD扩增的影响　　　　　　　　图 4　Mg2+浓度对 RAPD扩增的影响
　　　　　1～ 6:Taq酶单位分别为 0.50.8, 1 , 1.5 , 2.0 , 2.5 U. 　　　　1～ 6:Mg2+浓度分别为 1.0 , 2.0 , 2.5 , 3.0, 3.5 ,4.0 mmol.
2.5　dNTP 浓度对 RAPD扩增反应的影响　dNTP 作为 PCR反应的原料 ,其浓度的大小直接影响扩增反应的
产量和稳定性.在 0.15 ～ 0.25 mmol/L 时 ,扩增产物量较高 ,可见明显的扩增条带 ,这与一般文献报道的 dNTP
适宜浓度为0.20 mmol/L相一致.随着 dNTP 浓度增加 ,条带模糊不清.产生此现象的原因可能为:dNTP 是反
应中磷酸的主要来源 ,能与镁离子相结合.当 dNTP 浓度较低时 ,由于与镁离子的结合而使其本身有效浓度
更低 ,导致扩增量减少;当 dNTP浓度较高时 ,dNTP 与镁离子相结合又会降低反应液中游离镁离子的浓度 ,从
而影响酶的有效活力.本实验确定 dNTP 浓度为 0.25 mmol/L.
2.6　引物浓度对 RAPD扩增的影响　设置 6个引物浓度梯度进行了分析(图 6).当引物浓度较低时 ,扩增产
物量少;在 0.30 ～ 0.60μmol/L时带型清晰 ,背景较浅;随着引物浓度的增加 ,非特异性扩增表现非常明显 ,电
泳条带变得模糊.这是因为引物浓度过低 ,无法与所有的模板 DNA 结合位点结合 ,导致扩增结果不理想;引
物浓度过高时 ,会促使引物错误地引导非特异性产物的合成 ,非特异性产物和引物二聚体均为 PCR反应的
底物 ,与靶序列竞争 DNA聚合酶和底物 dNTP ,均使靶序列扩增量降低 ,而出现非特异条带.本实验确定引物
浓度应采用0.60 μmol/L.
图 5　不同 dNTP浓度对 RAPD扩增的影响　　　　　　　　图 6　不同引物浓度对 RAPD扩增的影响
1～ 5:dNTP浓度分别为 0.15 ,0.20, 0.25 , 0.30 , 0.35 mmol/ L.　1～ 6:引物含量分别为 0.15, 0.30 , 0.45 , 0.60 ,0.75, 0.90μmol/ L.
2.7　扩增程序对 RAPD扩增反应的影响　(1)退火温度对 RAPD扩增反应的影响:本实验对 RAPD扩增反应
中的退火温度进行了优化 ,设置了 4种退火温度(分别为33 ,35 ,37和40 ℃).只有在37 ℃时扩增产物条带稳
定而清晰 、重复性好.33 ℃和35 ℃时 ,扩增产物条带模糊不清 ,产量也低(图 7).当退火温度为 40 ℃,电泳图
谱上基本不见扩增产物条带.因此确定退火温度为 37 ℃.
(2)预变性时间对 RAPD扩增反应的影响:本实验对模板 DNA扩增前的预变性时间也设置了梯度比较 ,在 94
℃条件下 ,对模板预变性时间处理 1 ,2 ,3 ,4 ,5和 6 min , 扩增效果见图 8.模板预变性时间为 4 ～ 5 min时 ,扩
144 江西师范大学学报(自然科学版) 2005 年
增产物电泳条带清晰明亮.模板预变性时间为 6 min时 ,扩增产物电泳条带缺失 ,可能由于高温时间过长 ,
TaqDNA聚合酶的活性造成损失.本实验确定预变性时间为 5 min.
2.8　引物的筛选　在以上优化的条件下 ,本实验利用 6个样本对引物S40 ～ S160共 120条引物进行了筛选.
其中引物 S41 、S42 、S59 、S60 、S67 、S68 、S77 、S91 、S92 、S99 、S100 、S102 、S103 、S104 、S110 、S111 、S114 、S126 、S136 、
S137等引物扩增结果表现出较丰富的多态性 ,带型清晰.
图 7　退火温度对 RAPD扩增的影响　　　　　　　　图 8　预变性时间对 RAPD扩增的影响
　　　　　　　　1～ 4:退火温度分别为 30 、33 、37、40 ℃; 　　　1～ 6:预变性时间分别为 1, 2 , 3 ,4 , 5 , 6min.
　　由以上分析结果可知 ,穗花杉 RAPD扩增反应的最佳体系(20 μL反应体系):10×Buffer 缓冲液 2 μL ,模
板70 ng ,Mg2+ 2.0 mmol/L ,dNTPs 0.2 mmol/L ,引物0.60 μmol/L ,Taq酶1.5 U.最佳扩增程序为:94 ℃5 min ,
1个循环;94 ℃1 min 、37 ℃1 min 、72 ℃2 min ,40个循环;72 ℃10 min ,1个循环.
参考文献:
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Optimal Choice for Amplification Conditions on RAPD for Amentotaxus Argotaenia
ZHU Bai-fang1 , 2 , 　ZHU Du1 , 　LI Si-guang2 , 　LIU Ru-long1 , 　DENG Rong-gen1
(1.Life Science College , Jiangxi Normal University , Nanchang 330027 , China;2.Department of Biotechnology , Nanchang University , Nanchang 330047 ,China)
Abstract:The DNA templates extracted from young leaf of Amentotaxus argotaenia were amplified by RAPD.The optimal
reaction system of RAPD for Amentotaxus argotaenia was determined as follows:2μL 10×Taq polymerase corresponding
buffer , template DNA 70ng , Mg2+ 2.0 mmol/L , dNTP 0.2 mmol/L , primer 0.60 μmol/L and Taq DNA polymerase
1.5 U separately intotal 20μL reaction volume.The optical amplification program was also obtained:94 ℃5 min ,1 cy-
cle;94 ℃1 min , 36 ℃1 min , 72 ℃2 min , 40 cycles;72 ℃10 min , 1 cycle.
Key words:Amentotaxus argotaenia;RAPDAmplification conditions;optimal choice
(责任编辑:刘显亮)
145第 2期 朱柏芳 , 等:RAPD 法研究穗花杉遗传多样性的反应条件优化