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海藻铁钉菜抑制α-葡萄糖苷酶活性部位的筛选及其反应动力学研究



全 文 :附作用。中国药典的试剂衍生过程复杂、检测灵敏
度及重现性受人为因素影响较大。本实验采用光化
学衍生技术,以流动相中的水作为衍生剂,对黄曲霉
毒素进行衍生化处理,使流动相中的水与黄曲霉毒
素作用,生成荧光特性更强、更稳定的化合物,从而
解决了黄曲霉毒素在水溶液中发生荧光淬灭的问
题,而且增加了黄曲霉毒素的荧光强度[11],没有任
何毒害作用。同时蛤蚧定喘丸中以原粉直接入药,
处方中共有14味药材,药味较多,组成较复杂,会出
现假阳性的情况,因此进一步的确证实验就显得非
常必要。先采用 HPLC-柱后光化学衍生法直接测
定,出现阳性样品时,再用LC-MS/MS法进行对阳
性结果进行确证,可保证结果的准确、可靠。
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[收稿日期]2015-05-28
[基金项目]福建省自然科学基金海洋经济发展专项重点项目(编号:2014N0017);泉州市科技计划项目(编号:2014Z129)资助,泉州市第二批
科技项目(编号:2013Z126);福建省大学生创新创业计划项目(编号:201410399027) [作者简介]黄晓冬,男,副教授,硕士,研究方向:天然产
物化学与资源植物学研究,E-mail:hxd602@163.com
海藻铁钉菜抑制α- 葡萄糖苷酶活性部位的筛选及其反应动力学研究
黄晓冬,蔡琼瑶,王远花,蔡建秀,戴聪杰  (泉州师范学院近海资源生物技术福建省高校重点实验室,福建 泉州
362000)
[摘要] 目的:探讨海藻铁钉菜提取物对α-葡萄糖苷酶活性的影响及其反应动力学。方法:萃取法获得铁钉菜甲醇提取物的
石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位等5个部位,采用PNPG筛选其中具有α-糖苷酶酶抑制的活
性部位,通过酶促动力学方法与Lineweaver-Burk曲线,推断酶抑制类型。结果:包括甲醇提取物在内的6种铁钉菜提取物均
具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性,其中乙酸乙酯部位、石油醚部位、正丁醇部位、二氯甲烷部位的抑制活性均较强,IC50分别
为3.4,4.4,5.1,7.8μg·mL
-1,均远强于阳性对照阿卡波糖Acarbose(IC501 075.8μg·mL
-1)。抑制动力学分析显示,乙酸乙
酯部位、石油醚部位、正丁醇部位、二氯甲烷部位等对α-葡萄糖苷酶抑制作用均属于混合Ⅰ型抑制类型。结论:铁钉菜提取物
具有作为新型α-葡萄糖苷酶抑制剂的药用开发价值,特别是乙酸乙酯部位。
[关键词] 铁钉菜;提取物;α-葡萄糖苷酶抑制;活性部位;抑制动力学
[中图分类号]R931.71 [文献标识码]A [文章编号]1001-5213(2016)01-0016-05 DOI:10.13286/j.cnki.chinhosppharmacyj.2016.01.05
Screening of fraction with inhibiting activity againstα-glucosidase fromIshige okamurai and its
inhibition kinetics
HUANG Xiao-dong,CAI Qiong-yao,WANG Yuan-hua,CAI Jian-xiu,DAI Cong-jie(Fujian Advanced Educa-
tion Key Laboratory of Inshore Resources Biotechnology,Quanzhou Normal University,Fujian Quanzhou 362000,China)
ABSTRACT:OBJECTIVE To study the influence of seaweed Ishige okamurai onα-glucosidase activity and its reaction kinet-
ics.METHODS Five solvent fractions,including petroleum ether fraction,dichloromethane fraction,ethylacetate fraction,n-bu-
tanol fraction and water fraction,were extracted from methanol extract of Ishige okamurai.Among them,α-glucosidase inhibi-
ting extracts were screened by PNPG method,their inhibitory types were inferred by enzymatic dynamics and Lineweaver-Burk
·61· 中国医院药学杂志2016年1月第36卷第1期Chin Hosp Pharm J,Jan 2016,Vol 36,No.1
curve methods.RESULTS Six kinds of extracts,including methanol extract fromIshige okamurai,had certainα-glucosidase in-
hibiting activity,in which ethyl acetate fraction,petroleum ether fraction,dichloromethane fraction and n-butanol fraction had
strong inhibitory activity with IC50values of 3.4,4.4,5.1,7.8μg·mL
-1,respectively,more potent than acarbose(IC501075.8
μg·mL
-1),the positive control of this study.Inhibition dynamics analysis showed that the enzyme inhibitions of ethyl acetate
fraction,petroleum ether fraction,dichloromethane fraction and n-butanol fraction were al close to mixed typeⅠinhibition.
CONCLUSION The extracts of Ishige okamurai have medicinal development values as newα-glucosidase inhibitors,especialy
ethyl acetate fraction.
KEY WORDS:Ishige okamurai;extract;α-glucosidase inhibition;active fraction;inhibitory kinetics
  近年来,糖尿病的发病率随着人们生活水平的提
高和饮食结构的变化逐年增加,已然成为一个日益严
重的公共卫生问题[1]。2型糖尿病是人群中糖尿病
的主要类型,以餐后高血糖为重要体征[2]。在控制糖
尿病发展及并发症发生的医疗实践中,降低餐后血糖
浓度是重要的有效的措施。研究[3]发现,位于小肠绒
毛上的α-葡萄糖苷酶由于是碳水化合物消化为葡萄
糖的关键酶,可作为降低餐后血糖的分子靶点,通过
抑制α-葡萄糖苷酶活性,可延缓和阻碍碳水化合物的
消化,延迟葡萄糖的吸收[4],并且该作用过程温和持
久、毒副作用小。因此,α-葡萄糖苷酶抑制剂被推荐
为降餐后血糖的首选药物,如阿卡波糖、伏格列波糖
等[5]。寻找新的更为安全、有效的α-葡萄糖苷酶抑制
剂的研究受到广泛的关注,其中,植物源α-葡萄糖苷
酶抑制剂的筛选越来越受到学者的青睐[6-7]。
大型海藻自古以来是海峡两岸沿海居民药食两
用的食材,作为一种生长于海洋中的低等隐花植物,
由于生境的特殊性使其具有与陆岸植物差异较大的
化学组成,如海藻多糖、海藻多酚等。研究[8]发现,
许多大型海藻提取物具有较强的α-葡萄糖苷酶抑
制活性。褐藻铁钉菜(Ishige okamurai Yendo)系
北太平洋西部特有的亚热带性海藻,广泛分布于我
国东南沿海的中、高潮带岩礁,民间用于喉炎、淋巴
结炎、甲状腺肿等的治疗[9-10]。研究发现铁钉菜具
有海藻甾醇[11]、多糖[12]、凝集素[13]、糖脂类与脂肪
酸类[14]等化学成分,其80%甲醇提取物可通过改变
肝葡萄糖代谢酶活性、改善胰岛素抵抗起到降低血
糖的作用[15]。然而,对铁钉菜α-葡萄糖苷酶抑制活
性部位的研究尚未见文献报道。本文以福建围头湾
铁钉菜为材料,制备铁钉菜甲醇提取物以及石油醚、
二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水等5个萃取部位,
通过体外抑制α-葡萄糖苷酶活性法分别检测这些
提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性,并进行抑制动力
学分析,揭示铁钉菜提取物作为α-葡萄糖苷酶抑制
剂开发利用的药用价值。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂 主要仪器:JJ-2组织捣碎机
(金坛市城东新瑞仪器厂),连续波长酶标仪(ASYS
UVM340)。主要试剂:α-葡萄糖苷酶(α-glucosi-
dase)、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)均购自
Sigma公司,对硝基苯酚(PNP)标准品(纯度≥
99.5%),阿卡波糖(Acarbose)(含量 HPLC≥98%,
成都瑞芬思生物有限公司);二甲基亚砜(DMSO)等
其他试剂均为国产分析纯。
1.2 铁钉菜提取物制备 取去杂的新鲜海藻,洗净
沥干后剪碎,用组织捣碎机搅碎,取甲醇按1∶10(g∶
mL)料液比浸泡提取3次,每次3 d,合并滤液,用
0.22μm滤膜超滤,得甲醇提取液。提取液经小于
40℃旋转浓缩,干制后得到铁钉菜甲醇提取物。取
部分甲醇提取物以纯化水混悬,混悬液依次用石油
醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇充分萃取,各萃取液
旋转浓缩并干制得到石油醚部位、二氯甲烷部位、乙
酸乙酯部位、正丁醇部位以及水部位等5个部位的
铁钉菜提取物,作为供测样本。
1.3 铁钉菜提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性的测定
底物(PNPG)可被α-葡萄糖苷酶催化分解为对硝基
苯酚(PNP)和葡萄糖,PNP是一种有色物质,最大
吸收峰在波长405 nm左右。当加入样品后,样品
的酶抑制能力可根据反应体系的颜色深浅与吸光值
变化加以评价,体系颜色越浅、吸光值越低说明其酶
抑制活性越强[16]。本实验参照Li等[17]的微孔板方
法测定α-葡萄糖苷酶抑制活性,略加修改。具体方
法如下:在96孔微孔板上先加入112μL pH6.8的
0.1 mol·L-1PBS,然后再加入20μL0.2 U·mL
-1α-
glucosidase(以pH6.8的0.1 mol·L-1PBS配制),8
μL样液(DMSO为溶媒),37℃恒温15 min后加入
2.5 mmol·L-1PNPG(以pH6.8的0.1 mol·L-1PBS
配制)20μL,继续37℃恒温反应15 min,随后加入
80μL0.2 mol·L
-1的Na2CO3溶液。反应体系终体
积为240μL,其中含DMSO3.33%,酶标仪405 nm
波长下测样液组吸光值(A1)。以阿卡波糖为阳性
对照;PBS溶液代替酶溶液测样液组背景吸光度
(A2);以 DMSO 代替样液测空白对照组吸光度
(A3);以DMSO代替样液与PBS溶液代替酶溶液
·71·中国医院药学杂志2016年1月第36卷第1期Chin Hosp Pharm J,Jan 2016,Vol 36,No.1
测空白对照组背景吸光度(A4)。酶抑制率(I%)按
公式I%=[1-(A1-A2)/(A3-A4)]×100%计
算,重复实验3次,取平均值。测定不同浓度样液对
α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响,以抑制率对浓度作
图并进行回归方程拟合,求得半数抑制浓度(IC50)。
1.4 铁钉菜提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制动力学
分析 参照Li等[17]的的方法稍加修改。具体步骤
为:将铁钉菜提取物分别取抑制率低于50%的3个
不同浓度,改变底物PNPG的浓度[s]使其分别为
0.625,1.25,2.5,5.0,10.0mmol·L-1,按“1.3”的
方法分别测定不同浓度样液在不同底物浓度条件下
对α-葡萄糖苷酶活性的影响,以吸光度(A=A1-
A2)表征反应速率v。将1/v对1/[s]进行 Lin-
eweaver-Burk双倒数作图分析,求得米氏常数Km
和酶促反应最大速率vm,由此判断酶抑制类型。
1.5 数据统计分析 采用 Microsoft Excel 2003
软件进行数据处理与统计分析,实验数据均为3次
重复的平均值。
2 结果与分析
2.1 铁钉菜提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用 
铁钉菜6种提取物的α-葡萄糖糖苷酶抑制活性见表
1。由表1可知,铁钉菜各提取物的α-葡萄糖苷酶抑
制活性表现不一,甲醇提取物和水部位的α-糖苷酶
抑制活性相对较弱。以IC50来看,α-糖苷酶抑制活
性由 高 到 低 依 次 为 乙 酸 乙 酯 部 位 (IC503.4
μg·mL
-1)、石油醚部位(IC504.4μg·mL
-1)、正丁
醇部位(IC505.1μg·mL
-1)、二氯甲烷部位(IC50
7.8μg·mL
-1),活性均远远高于 Acarbose(IC50
1 075.8μg·mL
-1)。
2.2 铁钉菜提取物的α-葡萄糖苷酶抑制动力学 
在测酶活反应体系中,分别测定改变底物PNPG浓
度条件下,具有较高α-葡萄糖苷酶活性的铁钉菜乙
酸乙酯部位、石油醚部位、正丁醇部位、二氯甲烷部
位等不同浓度样液对α-葡萄糖苷酶活力的影响,结
果以1/v对1/[s]进行Lineweaver-Burk双倒数作
图(图1~4),相应的动力学参数见表2。
A.石油醚部位的Lineweaver-Burk作图;B.斜率对样液浓度作图;
C.截距对样液浓度作图
A.Lineweaver-Burk curve of petroleum ether fraction;B.curve of
slope and sample solution concentrations;C.curve of intercept and
sample solution concentrations
图1 铁钉菜石油醚部位对α-葡萄糖苷酶活性抑制的动力学分析
Fig 1 Inhibition kinetics ofα-glucosidase by the petroleum ether
fraction fromIshige okamurai
A.二氯甲烷部位的 Lineweaver-Burk作用;B.斜率对样液浓度作
用;C.截距对样液浓度作图
A.Lineweaver-Burk curve of dichloromethane fraction;B.Curve of
slope and sample solution concentrations;C.Curve of intercept and
sample solution concentrations
图2 铁钉菜二氯甲烷部位对α-葡萄糖苷酶活性抑制的动力学分析
Fig 2 Inhibition kinetics ofα-glucosidase by the dichloromethane
fraction fromIshige okamurai
表1 铁钉菜提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性
Tab 1 Inhibitory activity of different extracts fromIshige okamurai againstα-glucosidase
样品 提取物
抑制率/%
1μg·mL-1  2μg·mL-1  4μg·mL-1  6μg·mL-1  10μg·mL-1  60μg·mL-1
IC50
石油醚部位 10.90±2.59  27.37±7.92  51.99±3.05  75.76±3.44  82.52±0.30  97.15±2.95  4.4
二氯甲烷部位 17.50±5.30  29.95±3.66  38.70±7.87  42.70±5.44  58.63±0.74  96.16±2.61  7.8
铁钉菜 乙酸乙酯部位 14.37±3.34  35.52±6.19  69.16±1.83  90.50±1.89  92.70±3.59  97.29±3.94  3.4
正丁醇部位 12.86±2.45  22.97±8.41  33.41±3.52  65.79±1.76  93.59±2.26  98.78±4.64  5.1
水部位 未测 未测 未测 未测 -0.98±5.56  9.80±6.25 未测
甲醇提取物 未测 未测 未测 未测 8.35±3.47  12.26±0.01 未测
阿卡波糖 1 075.8
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A.乙酸乙酯部位的 Lineweaver-Burk作图;B.斜率对样液浓度作
图;C.截距对样液浓度作图
B.Lineweaver-Burk curve of ethyl acetate fraction;B.Curve of slope
and sample solution concentrations;C.Curve of intercept and sample
solution concentrations
图3 铁钉菜乙酸乙酯部位对α-葡萄糖苷酶活性抑制的动力学分析
Fig 3 Inhibition kinetics ofα-glucosidase by the Ethyl acetate frac-
tion fromIshige okamurai
A.正丁醇部位Lineweaver-Burk作图;B.斜率对样液浓度作图;C.
截距对样液浓度作图
A.Lineweaver-Burk curve of n-butanol fraction;B.Curve of slope
and sample solution concentrations;C.Curve of intercept and sample
solution concentrations
图4 铁钉菜正丁醇部位对α-葡萄糖苷酶活性抑制的动力学分析
Fig 4 Inhibition kinetics ofα-glucosidase by the n-butanol fraction
fromIshige okamurai
  分析发现,铁钉菜不同极性部位的Lineweaver-
Burk曲线均是一组相交于第二象限的直线,抑制动
力学参数均表现为随样液质量浓度增加 Km值增
大、vm值减小,这与可逆的混合Ⅰ型抑制的特点相
符[18-19]。进而以Lineweaver-Burk双倒数图的斜率
与截距对相应的样液浓度二次作图分析(图1~4),
发现各提取物相应的二次作图曲线均呈直线(图1
~4),经线性回归计算出各提取物对游离酶的抑制
常数Ki与对酶-底物络合物的抑制常数Kis,结果如
表3。由表3可知,各提取物的Ki均小于Kis,说明
不同极性的铁钉菜提取物与游离酶(E)的亲和力均
大于其与酶-底物络合物(ES)的亲和力。
表2 铁钉菜提取物对α-葡萄糖苷酶抑制的动力学参数
Tab2 Kinetic parameters ofα-glucosidase inhibition by dif-
ferent extracts fromIshige okamurai
样液
样液浓度
/μg·mL-1
Lineweaver-Burk
方程
Km
/μg·mL-1
vm
石油醚部位 0.0  1/v=1.426[s]+0.511  2.791  1.957
4.0  1/v=1.630[s]+0.572  2.850  1.748
6.0  1/v=1.945[s]+0.649  2.992  1.538
8.0  1/v=2.401[s]+0.778  3.086  1.285
二氯甲烷部位 0.0  1/v=1.426[s]+0.511  2.791  1.957
4.0  1/v=1.651[s]+0.572  2.886  1.748
6.0  1/v=2.164[s]+0.702  3.083  1.425
8.0  1/v=2.435[s]+0.775  3.142  1.290
乙酸乙酯部位 0.0  1/v=1.426[s]+0.511  2.791  1.957
2.0  1/v=1.813[s]+0.631  2.873  1.585
4.0  1/v=2.321[s]+0.772  3.215  1.385
6.0  1/v=2.722[s]+0.903  3.014  1.107
正丁醇部位 0.0  1/v=1.426[s]+0.511  2.791  1.957
2.0  1/v=1.936[s]+0.572  3.385  1.748
4.0  1/v=2.339[s]+0.609  3.754  1.616
6.0  1/v=3.100[s]+0.710  4.366  1.408
表3 铁钉菜提取物对游离酶的抑制常数 Ki 与对酶-底物
络合物的抑制常数Kis
Tab 3 Inhibition constants for free enzyme(Ki)and en-
zyme-subtrate(Kis)of different extracts fromIshige okamu-
rai
提取物 Ki Kis Kis/Ki
石油醚部位 0.011  0.015  1.36
二氯甲烷部位 0.010  0.014  1.40
乙酸乙酯部位 0.006  0.008  1.32
正丁醇部位 0.005  0.016  3.15
3 讨论
应用α-葡萄糖苷酶抑制剂降低餐后血糖是预
防糖尿病,减少并发症和降低死亡率的重要措施之
一。目前,α-葡萄糖苷酶抑制剂主要有天然动植物、
微生物的提取物,微生物代谢物和人工合成等3种
来源途径[20]。以PNPG为底物测定天然产物提取
物抑制α-葡萄糖苷酶活性的大小是目前最常用的
经典的α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选方法[21],李宪璀
等[8]应用此方法发现青岛沿海20种常见大型海藻
的脂溶性提取物(79.6μg·mL
-1)对α-葡萄糖苷酶
均有一定的抑制活性,其中,红藻提取物的酶抑制活
性相对较强,褐藻提取物相对较弱。在此研究中,褐
藻铁钉菜并没有纳入研究对象。本实验采用体外
α-葡萄糖苷酶抑制的微孔板筛选模型对铁钉菜甲醇
提取物及其石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部
位、正丁醇部位、水部位的α-葡萄糖苷酶抑制活性
进行比较,发现6种提取物均具有一定的α-葡萄糖
苷酶抑制活性,其中,乙酸乙酯、正丁醇、石油醚、二
氯甲烷部位对α-葡萄糖苷酶活性的抑制呈现明显
的量效正相关,IC50均远低于阳性对照Acarbose,尤
·91·中国医院药学杂志2016年1月第36卷第1期Chin Hosp Pharm J,Jan 2016,Vol 36,No.1
以乙酸乙酯部位的α-葡萄糖苷酶抑制活性最为突
出,IC50为3.4μg·mL
-1。
酶抑制剂类型根据抑制剂与酶作用的特点可分
为可逆抑制与不可逆抑制,前者包括竞争性抑制、非
竞争性抑制、反竞争抑制与混合型抑制等4种类型,
而混合型抑制又分为混合Ⅰ型与Ⅱ型。已有研究发
现,植物源α-葡萄糖苷酶抑制剂的抑制机理大多表
现为竞争性抑制、非竞争性抑制和混合性抑制等类
型[21]。铁钉菜提取物对α-葡萄糖苷酶抑制的动力
学分析表明铁钉菜乙酸乙酯部位、石油醚部位、二氯
甲烷部位、正丁醇部位等提取物的酶抑制类型均为
混合Ⅰ型,均表现出与底物竞争游离酶、与酶-底物
络合物(ES)亲和的双重作用,兼具竞争性和非竞争
性作用的双重特点;分析发现各提取物对酶-底物络
合物的抑制常数Kis均高于其对游离酶的抑制常数
Ki,提示各提取物对酶促反应的抑制以对游离酶的
抑制作用为主,作用强于其对酶-底物络合物的亲
和作用。综上所述,铁钉菜提取物具有作为一种海
藻源α-葡萄糖苷酶抑制剂的潜在开发价值,后续的
研究可对相应活性部位进行活性追踪,分离鉴定出
高效治疗糖尿病的活性组分或单体成分。
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[收稿日期]2015-06-17
[基金项目]广东省中医药强省科研课题研究项目(编号:20151200);广州中医药大学创新基金研究项目(编号:11CX069) [作者简介]李得
堂,男,主管中药师,硕士研究生,研究方向:中药新制剂的开发与评价,电话:15918727697,E-mail:lidetang2002@163.com
应用电导率 -含水量曲线法研究广东王不留行提取物为模型药物的O/
W型微乳
李得堂1,张丽娟2,唐洪梅1,蔡庆群1,丘振文1,司徒杰3,房财富4  (1.广州中医药大学第一附属医院,广东 广州
510405;2.广州中医药大学附属中山医院,广东 中山528400;3.广州中医药大学,广东 广州510405;4.中山大学附属肿瘤医
院,广东 广州510060)
[摘要] 目的:建立广东王不留行提取物为模型药物的O/W 型微乳处方筛选及制备成型的一种方法。方法:选取文献及本
实验室15个处方空白微乳建立电导率-含水量曲线,同时与目测法进行对比研究,选取其中4个稳定的微乳处方,分别建立以
广东王不留行提取物为模型药物的O/W型微乳的电导率-含水量曲线,进行其方法学考察及微乳质量评价。结果:O/W 型空
白及含药微乳成型的临界点均是电导率-含水量曲线的顶点,进一步验证其值显著高于目测法测定的临界值,目测法所测定的
O/W型微乳临界值在双连续区域内,通过电导率-含水量曲线确定的空白及含药O/W 型微乳方法学实验RSD<1%,空白及
·02· 中国医院药学杂志2016年1月第36卷第1期Chin Hosp Pharm J,Jan 2016,Vol 36,No.1