全 文 ：第 25卷　第 2期 中　南　林　学　院　学　报 Vol. 25　 No. 2
　 2005年 4月 JOU RN AL OF CENT RAL SOUT H FO RESTRY UNIV ERSITY Apr. 2005　

[文章编号 ] 1000- 2502( 2005) 02- 0055- 04
穗花杉组织培养初探
喻晓雁 1 , 刘克旺2 ,梁文斌 2
( 1.浙江医药高等专科学校 ,浙江 宁波 315100; 2.中南林学院 , 湖南株洲 412006)
[摘　要 ]　 穗花杉雌雄异株 ,繁殖率低 ,属珍稀濒危植物 .为了实现试管保存穗花杉种质资源 ,以其嫩茎为材料 ,探讨了穗花杉试管
芽生芽方法 ,即试管微型扦插方法。 结果表明:腋芽分化的最适培养基为 MB( 1 /2MS+ B5)+ KT1. 5 mg /L+ N AA0. 5 m g /L+ 蔗
糖 2. 0% + 琼脂 0. 8% ,腋芽诱导率可达 60% ;诱导不定根最适培养基为 1 /4M S+ IBA4 mg /L+ N AA2 mg /L+ 琼脂 0. 8% + 蔗糖
2. 0% .
[关键词 ]　生物技术 ; 穗花杉 ; 试管微型扦插 ; 芽生芽 ;组织培养
[中图分类号 ]　 S791. 52; Q943. 1　　　　 [文献标识码 ]　 A
A Brief Study of Cuttage in Vitro of Amentotaxus argotaenia
YU Xiao-yan
1 , L IU Ke-wang
2 , L IAN G Wen-bing
2
( 1. Zh ejiang Ph armaceu tical College, Ningbo 315100, Zhejiang , Ch ina; 2. Cen t ral Sou th Fores t ry Univ ersi ty, Zhuzh ou 412006, Hunan, China)
Abstract: Amentotax us argotaenia li es only in China, and i ts population is red uced so sh arply th at i t f aces the danger of extinction.
Its rapid reproduction is s tudied for pres erving th e species in vi t ro. Through th e p roces s of sterili zing the Cut tag e of Amen totaxus
argo taenia wi th mul tiple meth od s, making i t in dif f erent li ght and temperatu re, inducing axillary buds in dif ferent medium,
st rength ening th e b uds and inducing i t s root s in vit ro, w e g et s ome ful l s eedings succes sfully. Th e result s show that axi llary bud s can
be induced succes sfully f rom yearly shoot cu tt ing in cul ture and th e opt imum medium is: MB ( 1 /2M S+ B5)+ KT1. 5 mg /L +
N AA0. 5 mg /L + sucrose 2. 0% + agar 0. 8% . Th e rate of succes s i s abou t 60% . The seedling s in vi t ro tak e root success fully in
th e medium 1 /4M S+ IBA4 mg /L+ N AA2 mg /L + agar 0. 8% + sucros e 2. 0% .
Key words: biotechnolog y; Amentota xus a rgotaenia ; cu ttag e; in vi t ro; ti ss ue cul ture
穗花杉 Amentotaxus argotaenia属红豆杉科 Taxaceae穗花杉属 Amentotaxus ,是第三纪残遗植物 ,为我国特
有种 ,现正处于濒危状态 ,已被列为国家三级保护植物 [1 ] .据刘克旺 [2, 3 ]和孙同兴 [4 ]的研究 ,穗花杉濒临灭绝的
原因如下: 雌雄异株 ,雌少雄多 ;结实量少且不稳定 ,有大小年之分 ,逢小年几乎不结实 ;种子休眠期长 ;幼苗易
受干旱而致全株死亡 ;异地扦插成活率低 ;生境要求较为严格 ,而生境受到严重的人为破坏 .鉴于穗花杉原产地
破坏严重 ,异地繁殖困难 ,本研究从组织培养着手 ,探讨穗花杉有效的繁殖方法 .若能通过微型扦插培育穗花
杉 ,并进行有效的快速繁殖 ,对于保存穗花杉这一珍稀植物将具有重大意义: 填补穗花杉组织培养研究的空白 .
为此 ,从 1998年 10月～ 2001年 3月 ,利用穗花杉的带节茎段作为外植体进行了无菌的组织培养试验 ,取得了初
步成效 .
1　材料与方法
1. 1材料
从保护区移入苗圃的穗花杉实生苗 ,取茎段进行组织培养 ;当年发芽苗 ,取嫩茎试验 .
[收稿日期 ] 2004-09-06
[基金项目 ] 国家林业局指南项目“珍稀濒危植物穗花杉群落学特性及保护技术的研究” (项目代号 97- 05)的部分内容 .
[作者简介 ] 喻晓雁 ( 1975- ) ,女 ,湖北武汉人 ,讲师 ,硕士 ,主要从事园林植物、药用植物、濒危植物研究 .
1. 2　方法
1. 2. 1　材料处理　 4月下旬～ 11月上旬 ,采集嫩枝 ,自来水及洗涤液处理过后 ,切分成约 0. 8～ 1 cm的带节茎
段作外植体接种 .因红豆杉科植物组培污染和褐化是大问题 ,试验采用了 KMnO4、 70%酒精、 0. 1%升汞 3种药
品不同处理时间共 9组合进行正交试验 ,对茎段进行综合消毒处理 [5 ] .每组 20瓶培养基进行比较试验 ,培养 30
d后记载污染数、褐化数、存活数 .
1. 2. 2　培养基的制备　基本培养基有 1 /2M S和 MB共 2种 ,添加蔗糖前者为 2. 5 g /100 g , 后者为
2. 0 g /100 g ,琼脂 0. 8 g /100 g , pH值 5. 8, 活性炭 0. 3 g /100 g , 并附加不同浓度的激素 ,如 NAA、 6-BA( BA)
、 ZT 、 KT 、 IBA等 . 128℃高温蒸气灭菌 15 min.
1. 2. 3　不同温度与光照对茎段培养的影响比较　培养基为 1 /2M S(基 )+ 蔗糖 2. 5 g /100 g + 琼脂
0. 8 g /100 g+ 活性炭 0. 3 g /100 g+ BA3 mg /L+ N AA2 mg /L, 依不同温度 ( 21、 25℃ )及光照 (明、暗 )情况
分 4组交叉试验 . 30 d后观察愈伤组织诱导情况 , 50 d后观察腋芽诱导情况 .
1. 2. 4　腋芽的诱导　利用中南林学院重点实验室的设备进行穗花杉茎段腋芽的诱导 ,每瓶培养基接 1个茎
段 ,温度 ( 25± 1)℃ ,光照人为控制进行对照实验 .采用带节茎段 ,经不同激素配比的组合实验 , 1～ 2次转接后 ,
诱导腋芽萌发 .基本培养基有两种:一种为 MB,附加激素 NAA4水平和 K T3水平 ,采用全面试验法 ;另一种为
1 /2M S,附加活性炭 , N AA、 BA、 K T3激素 3水平采用正交试验法 ,进行腋芽诱导试验 .
1. 2. 5　腋芽增壮与循环取材　诱导出的腋芽苗转入壮苗培养基 ,一部分待苗长至 2 cm长以后 ,切取试管苗带
节茎段 ,循环取材再培养 ,诱导腋芽 ,一部分则诱导不定根 .采用 1 /2M S基本培养基 , 3种配方: 壮 1加 NAA
0. 1 mg /L;壮 2加 IBA 0. 1 mg /L;壮 3为基本培养基 .记录发叶数和茎的长度 .
1. 2. 6　根的诱导　待壮苗培养基中的苗长至 8片叶以上 ,若高度不及 2 cm,茎较粗 ,基部有大团愈伤组织 ,即
可转移到含不同植物激素 IBA、NAA、 K T、 ZT的 1 /4M S培养基 ( M S大量元素减为 1 /4,其它减为 1 /2) ,附加蔗
糖 2. 0%、琼脂 0. 8%、 pH值 5. 8,诱导不定根 .
表 1　不同处理方法灭菌效果比较
　　　　 Table 1　 Comparison of sterilizing ef fect among dif ferent
ways of dealing with stems
组合
消毒剂处理时间 /min
0. 1% KMnO 4 70%酒精 0. 1%升汞
污染数
/个 污染率% 褐化数/个 存活率/%
01 5 0. 1 5 14 70 0 30
02 5 0. 5 10 6 30 6 40
03 5 1. 0 15 8 40 6 30
04 8 0. 1 10 7 35 6 35
05 8 0. 5 15 6 30 8 30
06 8 1. 0 5 9 45 4 35
07 10 0. 1 15 9 45 5 20
08 10 0. 5 5 13 65 1 30
09 10 1. 0 10 11 55 3 30
表 2　不同温度及光照条件对腋芽和愈伤组织诱导的影响
Table 2　 Inf luences of dif ferent temperature and light combination
on induct ion of axillary buds and callus
温度 光照 无污瓶数 出愈瓶数 愈伤形成率/% 腋芽瓶数 出芽率/%
21℃ 暗 17 12 70. 6 4 23. 5
21℃ 明 25 19 76. 0 6 24. 0
25℃ 暗 18 7 38. 9 7 38. 9
25℃ 明 34 17 50. 0 11 32. 4
2　结果与分析
2. 1　不同的材料处理方法灭菌效果
处理 30 d后 , 20瓶中有部分外植体污
染 ,没有污染的也有部分褐化 ,存活下来的一
部分产生愈伤组织 ,一部分基本无变化 ,一部
分节上膨大 ,可望产生腋芽 .具体处理方法及
结果见表 1.
从表 1可知 ,控制污染效果较好的有组
合 2( KM nO40. 1%处理 5 min+ 70%酒精处
理 0. 5 min+ 0. 1%升汞处理 10 min)和组合
5( KM nO4 0. 1%处理 8 min + 70%酒精处理
30 s + 0. 1%升汞处理 15 min) ,污染率皆为
30% ,但后者褐化较严重 ;防止褐化效果最好
的有组合 1( KM nO4 0. 1%处理 5 min + 70%
酒精处理 0. 1 min + 0. 1%升汞处理 5 min) ,
但是污染率较高 ;综合污染数和褐化数分析
存活率 ,材料最佳处理方法为组合 2,外植体
存活率为 40% .
2. 2　不同温度与光照对茎段培养的影响
不同温度及光照培养 30 d愈伤组织情
况、 50 d腋芽诱导情况见表 2.
56 中　南　林　学　院　学　报 第 25卷
表 3　不同激素组合对穗花杉腋芽诱导的影响
Table 3　 Influence of dif f erent hormones combinat ion
on induction of buds
组合 基本培养基
附加成分 /( mg· L- 1 )
N AA BA KT 活性炭 /%
无污瓶数 出芽瓶数 出芽率/%
01 M B 0. 1 0. 1 25 0 0. 0
02 M B 0. 1 1. 0 26 4 15. 4
03 M B 0. 1 1. 5 24 6 25. 0
04 M B 0. 5 0. 1 25 5 20. 0
05 M B 0. 5 1. 0 31 8 25. 8
06 M B 0. 5 1. 5 25 15 60. 0
07 M B 1. 0 0. 1 30 0 0. 0
08 M B 1. 0 1. 0 25 11 44. 0
09 M B 1. 0 1. 5 23 0 0. 0
10 M B 5. 0 0. 1 26 0 0. 0
11 M B 5. 0 1. 0 24 0 0. 0
12 M B 5. 0 1. 5 27 0 0. 0
13 1 /2MS 1. 0 1. 0 0. 1 0. 3 29 0 0. 0
14 1 /2MS 1. 0 2. 0 0. 5 0. 3 34 0 0. 0
15 1 /2MS 1. 0 3. 0 1. 0 0. 3 28 0 0. 0
16 1 /2MS 2. 0 1. 0 1. 0 0. 3 25 4 16. 0
17 1 /2MS 2. 0 2. 0 0. 1 0. 3 23 0 0. 0
18 1 /2MS 2. 0 3. 0 0. 5 0. 3 26 13 50. 0
19 1 /2MS 3. 0 1. 0 0. 5 0. 3 27 0 0. 0
20 1 /2MS 3. 0 2. 0 1. 0 0. 3 25 5 20. 0
21 1 /2MS 3. 0 3. 0 0. 1 0. 3 24 6 25. 0
22 1 /2MS 0. 1 24 0 0. 0
23 M B 1. 0 24 0 0. 0
24 1 /2MS 0. 1 25 0 0. 0
25 1 /2MS 5. 0 24 0 0. 0
　　从表 2可知 ,不同温度 ( 21、 25℃ )对愈伤组织和
腋芽的诱导效果有差异 ,其中 21℃对于茎段愈伤组织
的发生率更高些 ,而 25℃下培养有利于诱导腋芽发
生 ;光照下愈伤组织略比暗培养下易发生 ,但对腋芽
诱导没有明显影响 .故在穗花杉组织培养中重点要注
意温度 ,光照可以不用考虑 .
2. 3　不同激素配比对腋芽诱导的影响
在芽的诱导过程中成功分化了腋芽 .组别 1～ 12
采用 MB基本培养基 ,附加不同激素 ;组别 13～ 21采
用 1 /2M S基本培养基 ,附加不同激素 ,进行腋芽诱导
试验 ,结果见表 3、图 1.
表 3中组合 22～ 25表明 , 仅用生长素和细胞分
裂素单独进行诱导都是难以成功的 ;组合 1～ 12说
明 ,腋芽诱导以 MB基本培养基 + N AA 0. 5 mg /L
+ KT 1. 5 mg /L为最适 ,成功率为 60% (第 6组 ) ;
1 /2M S基本 培养基 + BA 3. 0 mg /L + N AA
2. 0 mg /L + K T 0. 5 mg /L + 活性炭 0. 3% (第 18
组 )效果也较好 ,腋芽诱导率为 50% .
2. 4　不同激素对腋芽生长的影响
腋芽初步诱导出来后 ,似绿豆大小突起 ,在原培养
基上生长缓慢 ,故转至壮苗培养基 ,促进腋芽生长 ,利
于生根 .进行此项试验时 ,共有无污染腋芽 84瓶 ,每组
合都试验 28瓶 ,每瓶 23～ 24 mL.培养结果见表 4.
图 1　穗花杉试管腋芽苗的萌发
　　　 Fig. 1　 Occurrence of axillary bud in vitro
从表4可知 ,附加激素 IBA 0. 1 mg /L的壮苗培养
基壮 2上生长的试管苗发叶最多 ,而不加任何激素的
培养基壮 3上生长的试管苗茎伸长最多 .若想扩大繁
殖系数 ,循环取材 ,可将腋芽苗转接入不加激素的培
养基中促其茎伸长 ,长至 2 cm以后 ,可切除上半部约
1 cm茎段转接到腋芽诱导培养基中 ,使之芽生芽或
“以芽还芽” ;若直接促其生根 ,则先将其转入附加
IBA0. 1 mg /L的壮苗培养基壮 2上促进发叶、强壮 ,
而后转入生根培养基 .
2. 5　不定根的诱导
共 28瓶 ,转入生根培养基 .添加激素 IBA、 NAA、
KT、 ZT.结果见表 5、图 2.
表 4　不同激素对腋芽生长的影响
　　　　 Table 4　 Inf luence of dif ferent hormones on growth of buds
序号
激素 /( mg· L- 1 )
N AA IBA
发叶瓶数
0～ 3叶 4～ 9叶 10叶以上
茎长瓶数 / cm
0～ 0. 9 1. 0～2. 0 1. 9以上
壮 1 0. 1 0. 0 17 9 2 18 7 3
壮 2 0. 0 0. 1 13 10 5 21 5 2
壮 3 19 5 4 14 9 5
从表 5可知 ,穗花杉试管
苗在适当的生长素配比下
( IBA 4 mg /L + N AA
2 mg /L)可以生根 ,而且根生
长良好 ,培养基中不宜加入分
裂素 .实验中 ,根是在愈伤组织
团上形成 ,属于不定根 .这是裸子植物组织培养上的一项成果 ,也是珍稀保护植物种质资源保存的一项成果 [6 ] .
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表 5　不同激素组合对试管苗不定根的诱导
　　　 Table 5　 Action of dif ferent hormones combinat ion on
induction of advent itious roots
序号
激素含量 / ( mg· L- 1)
IBA NAA K T ZT
根瓶数 根的生长情况
01 1 4 1 0 1～ 3根产生于愈伤组织团 ,
02 4 2 4 向下伸 ,长约 0. 8～ 1. 5 cm,
03 4 1 0 直径约 0. 2 mm,白色
3　讨论
( 1)腋芽分化的最适培养基为 MB ( 1 /2M S+
B5)+ KT 1. 5 mg /L + N AA 0. 5 mg /L+ 蔗糖
2. 0% + 琼脂 0. 8% ,腋芽诱导率可达 60% .培养基
1 /2M S + 6-BA 3. 0 mg /L + N AA 2. 0 mg /L +
KT 0. 5 mg /L+ 活性炭 0. 3% + 蔗糖 2. 5% + 琼
脂 0. 8%效果也不错 ,腋芽发生率可达 50% .
图 2　诱导出不定根的试管苗
　 Fig. 2　 The seedling in vitro with adventitious roots
( 2)最适试管苗发叶壮苗培养基为 1 /2M S +
IBA 0. 1 mg /L+ 琼脂 0. 8% + 蔗糖 2. 0% .不加任
何激素的 1 /2 M S培养基上生长的试管苗茎伸长最
多 .若要诱导生根 ,可采用前者 ;若想循环取材繁殖 ,
可以采用后者 .
( 3)成功诱导不定根的培养基为 1 /4M S+ IBA
4 mg /L+ N AA 2 mg /L + 琼脂 0. 8% + 蔗糖
2. 0% .
( 4)材料最佳处理组合为 KMnO4 0. 1%处理
5 min + 70%酒精处理 0. 5 min + 0. 1%升汞处理
10 min.在 21℃下茎段愈伤组织的发生率比 25℃下
更高 ,而 25℃下培养有利于诱导腋芽发生 ;光照下愈
伤组织略比暗培养下易发生 ,但对腋芽发生没有明
显影响 .
( 5)试验中碰到的最大问题是污染和褐化 ,这也
是红豆杉科植物组织培养碰到的普遍问题 .若能找
到合适的材料消毒方法和褐化控制方法 ,本文中所
探讨的微型扦插 (试管 )芽生芽方法将有重大的意义 .
[参　考　文　献 ]
[1 ]　杨成华 ,邓朝义 . 珍稀树种 -云南穗花杉 [ J ]. 贵州林业科技 , 1998, 26( 3): 33- 35.
[2 ]　刘克旺 ,肖乾德 . 湖南绥宁县神坡山穗花杉群落特性初步研究 [ J] . 武汉植物研究 , 1999, 17( 2): 137- 145.
[3 ]　刘克旺 ,肖乾德 ,薛生国 .穗花杉种群接种规律探讨 [ J] .中南林学院学报 , 2002, 22( 3): 68- 70.
[4 ]　孙同兴 ,林金兴 . 中国特有植物穗花杉的生物学特性及其保护 [ J] . 广西植物 , 1996, 16( 4): 353- 358.
[5 ]　郑光植 ,甘烦远 . 欧洲红豆杉细胞培养的研究 [ J ]. 应用与环境生物学报 , 1996, 2( 3): 220- 224.
[6 ]　甘烦远 ,郑光植 . 红豆杉的细胞工程学研究进展 [ J ]. 国外医药 -植物药分册 , 1994, 9( 4): 156- 159.
[本文编校:胡曼辉 ]
58 中　南　林　学　院　学　报 第 25卷