全 文 :生 物 技 术 通 讯LETTERS IN BIOTECHNOLOGY Vol.25 No.6 Nov., 2014
不同浓度卡那霉素、潮霉素对楸树试管苗生长的影响
于永明 1,2,王军辉 1,麻文俊 1,马建伟 2,张宋智 2,李平英 2,韩云花 2
1. 中国林业科学研究院 林业研究所,国家林业局 林木培育重点实验室,北京 100091;
2. 甘肃省小陇山林业科学研究所,甘肃 天水 741022
[摘要] 目的:将不同质量浓度的卡那霉素、潮霉素加入楸树培养基中,研究卡那霉素、潮霉素对楸树组培苗生长的
影响,以确定抗生素对楸树茎段分化与生根的敏感质量浓度。方法:待楸树继代、生根培养基灭菌后温度降至 30~
50℃,将不同质量浓度的卡那霉素、潮霉素经抽滤式灭菌加入培养基中,在培养基中接入楸树组培无菌茎段培养,观
测茎段继代(增殖芽数、芽长、叶数等)、生根(发根数、根长、芽长等)生长指标并统计分析。结果:楸树组培继代培养
基添加卡那霉素质量浓度为 100 mg/L时组培瓶苗生长缓慢,浓度为 150 mg/L时叶片大部分发白并干枯,茎段基部无
愈伤组织形成,瓶苗基本停止生长,楸树继代瓶苗对卡那霉素耐受性范围为 100~150 mg/L;添加潮霉素质量浓度为
5 mg/L时瓶苗生长较为缓慢,浓度为 10 mg/L时叶片开始干枯,茎段基部愈伤组织较小,瓶苗基本停止生长,楸树继
代瓶苗对潮霉素耐受性范围为 10 mg/L左右。楸树组培生根培养基添加卡那霉素质量浓度为 100 mg/L时大部分茎
段干枯,少部分为绿但未分化芽与根,浓度为 150 mg/L时大部分茎段干枯,极少上部为绿,基部干枯,但未分化芽与
根,楸树组培瓶苗生根培养苗对卡那霉素耐受性范围为 100~150 mg/L;添加潮霉素质量浓度为 5 mg/L时少部分茎段
干枯,浓度为 10 mg/L时大部分茎段干枯,少部分为绿,茎段未出现芽的分化与根的萌发现象,楸树组培瓶苗生根培
养苗对潮霉素耐受性范围为 5~10 mg/L。结论:卡那霉素、潮霉素对楸树组培苗生长有明显的抑制作用且与抗生素
浓度呈负相关,但低质量浓度(1 mg/L)的潮霉素对楸树继代分化芽数有促进作用;同一抗生素对楸树不同无性系间
组培苗生长的影响无显著差异。
[关键词] 楸树;抗生素;试管苗;遗传转化
[中图分类号] Q945 [文献标识码] A [文章编号] 1009-0002(2014)06-0832-05
Effect of the Kanamycin and Hygromycin on Catalpa bungei in Vi⁃
tro Culture
YU Yong-Ming1,2, WANG Jun-Hui1*, MA Wen-Jun1,
MA Jian-Wei2, ZHANG Song-Zhi2, LI Ping-Ying2, HAN Yun-Hua2
1. Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry; Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation,
State Forestry Administration, Beijing 100091; 2. Xiaolongshan Research Institute of Forestry, Tianshui 741022; China
*Corresponding author,E-mail: wangjh808@sina.com
[Abstract] Objective: To study the effect of kanamycin and hygromycin on the growth of tissue culture seedling
of Catalpa bungei, the different concentrations of kanamycin and hygromycin were added into the subculture and
rooting medium. We determined the concentration of antibiotic sensitivity of C.bungei subculture and rooting of
stem segment. Methods: The different concentrations of kanamycin and hygromycin were added into the medium
of the C.bungei subculture with filtration sterilization. The sterile stems were cultured in the medium, and the
growth index such as bud length, bud number, leaf number etc. in subculture, and root number, root length, shoot
length and so on in root were observed and statistical analyzed. Results: Experiments showed that C.bungei plant⁃
let grew slowly when kanamycin concentration was 100 mg/L in subculture medium. When the kanamycin concen⁃
tration was 150 mg/L, most of the leaves turned white and dried up, and the stem base was without callus, so tol⁃
erance range of appropriate concentration to subculture was 100~150 mg/L. 5 mg/L hygromycin was added into
subculture medium, C.bungei plantlet grew slowly. When the concentration reached 10 mg/L, the leaves dried up
and stem base callus was smaller and plantlets stoped grow, thus tolerance range of hygromycin appropriate concen⁃
tration to subculture was about 10 mg/L. Most C.bungei stem dried and a few green but not differentiation bud
doi: 10.3969/j.issn.1009-0002.2014.06.019 研究报告
收稿日期:2014-06-16
基金项目:国家科技支撑课题(2012BAD01B05);甘肃省小陇山林业实验局局列科研计划(2012)
作者简介:于永明(1979- ),男,工程师
通信作者:王军辉,(E-mail)wangjh808@sina.com
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and root when 100 mg/L kanamycin was added into root medium. When kanamycin concentration was 150 mg/L, C.
bungei stems were basic dead and no differentiation bud and root, and rooting seedlings on kanamycin tolerance
range of 100~150 mg/L tissue culture plantlets of C.bungei. When hygromycin concentration was 5 mg/L, a few
stem dried, at the concentration of 10 mg/L, most stem dried, some turned green, stems were without bud differen⁃
tiation and root germination, seedlings of hygromycin tolerance range was 5~10 mg/L in rooting culture of C.
bungei. Conclusion: Experiments showed that, kanamycin and hygromycin had a significant effect on the growth of
C.bungei in vitro culture. Kanamycin and hygromycin inhibited and negatively related to the growth of tissue cul⁃
tured seedlings of C.bungei, but low hygromycin concentration(1 mg/L) could promote differentiation buds in C.
bungei subculture. The same antibiotics on different clones of C.bungei influence the growth of tissue culture seed⁃
ling had no significant difference.
[Key words] Catalpa bungei; antibiotics; plantlet; genetic transformation
楸树(Catalpa bungei C.A.Mey.)材质优良,树干
挺拔,花色淡红素雅,观赏性高,是珍贵用材及绿化
树种,在我国丰富的树木资源中,惟其“材”貌双全,
自古素有“木王”之美称。近年来,在楸树生物学特
性、开花结实习性、种质资源现状、良种选择、繁殖技
术、造林技术等方面都有较为系统的研究。“十一五”
期间,珍贵阔叶树种种质创新课题组对楸树种源和
无性系选择、目标树选择和培育、立地选择、干形培
育、混交林结构调整、密度控制和水肥调控等关键技
术进行了深入研究,建立了珍贵用材林定向单株培
育的科技创新平台,提高了我国珍贵用材林培育的
技术创新能力 [1-4]。在楸树组培研究领域,已有研究
者对楸树器官的体细胞胚胎发生进行探讨,并取得
一定的研究结论[5],但普遍以楸树嫩芽为材料。本珍
贵阔叶树种种质创新课题组根据研究结果,已制定
了《楸树无性系组培快繁技术规程》地方标准[6]。
抗生素是由微生物或高等动植物在生活过程中
产生的具有抗病原体或其他活性的一类次级代谢产
物,能干扰其他生活细胞的发育功能。卡那霉素是
一种蛋白质生物合成抑制剂,通过与 30S核糖体结
合而使mRNA密码误读,若细菌产生一种破坏卡那
霉素的酶,则该菌可变为抗性株,卡那霉素抗性质粒
常被作为选择基因或标记基因用于分子克隆[7-8]。潮
霉素是一种常用的抗性筛选药物,其抗性基因表达
产物是一种蛋白激酶,通过磷酸化潮霉素使其丧失
活性。由于在真核和原核生物中潮霉素筛选假阳性
率低,重复性好,现在通过潮霉素对转基因生物进行
筛选已被广泛应用 [9-12]。卡那霉素和潮霉素是目前
遗传转化体系广泛应用的 2种抗生素。我们进行了
卡那霉素和潮霉素对楸树无性系试管苗生长的影响
研究,以确定抗生素对楸树茎段分化和生根的敏感
质量浓度,建立有效的遗传转化体系,为楸树特性良
种的选育与转化提供重要理论和实践指导。
1 材料与方法
1.1 材料
河南洛阳楸树优良无性系 2-8、1-4组培苗由本
课题组筛选;卡那霉素与潮霉素均购自 Sigma公司。
1.2 楸树无性系生长分化培养
选择生长一致的楸树组培苗,转接到增殖分化
培养基上。增殖培养茎段带 1个腋芽,确保诱导分
化在同一水平。继代增殖分化培养基为DKW+BA
(苄氨基腺嘌呤)1.0 mg/L+IBA(吲哚丁酸)0.2 mg/
L+蔗糖 25 g/L+琼脂 4.5 g/L(pH5.8),以楸树无性系
2-8组培继代瓶苗为材料,在培养基中分别加入 0、
25、50、100、150 mg/L的卡那霉素,1、5、10 mg/L的
潮霉素,共 8个处理质量浓度;以楸树无性系 1-4、2-
8组培继代瓶苗为材料,在培养基中分别加入 0、1、
5、10 mg/L的潮霉素,共 4个处理质量浓度。每个处
理设置 3个重复,每重复接种 10瓶,每瓶接种 3株。
所有材料都置于组培室内,组培苗培养温度 22~
26℃,光照2000 lx,光照时间为 14 h/d。
1.3 楸树试管苗生根培养
生根茎段长度为 1.5 cm,确保插入培养基茎段
部位没有腋芽,以免影响根系的诱导。生根培养基
为 1/2MS+IBA 0.1 mg/L+NAA(萘乙酸)0.01 mg/
L+蔗糖 10 g/L+琼脂 5.0 g/L(pH5.8),以楸树无性
系 2-8组培继代瓶苗为材料,在培养基中分别加入
0、25、50、100、150 mg/L的卡那霉素,1、5、10 mg/L
的潮霉素,共 8个处理质量浓度;以楸树无性系 1-4、
2-8组培继代瓶苗为材料,在培养基中分别加入 0、
25、50、100、150 mg/L的卡那霉素,共 5个处理质量
浓度。每个处理设置 3个重复,每重复接种 10瓶,每
瓶接种 3株。所有材料都置于组培室内,培养条件
同上。
1.4 生长指标的测定
增殖培养 40 d后,统计增殖培养指标,包括增
殖芽数、芽长、叶数、接入茎段愈伤组织横向及纵向
膨大情况。增殖系数以各处理增殖芽数与芽长的积
除以转接茎段长度(1 cm)而得。
生根培养 30 d后统计生根培养指标,包括接入
茎段发根数、根长、发芽数、芽长、叶数。
于永明等:不同浓度卡那霉素、潮霉素对楸树试管苗生长的影响 833
生 物 技 术 通 讯LETTERS IN BIOTECHNOLOGY Vol.25 No.6 Nov., 2014
2 结果
2.1 抗生素对楸树继代瓶苗生长的影响
2.1.1 抗生素对楸树无性系 2-8继代瓶苗生长的影
响 方差分析显示,经不同质量浓度的抗生素处理,
楸树无性系 2-8瓶苗的增殖芽数(P=0.008)、芽长
(P=0.000)、愈伤组织横向膨大(P=0.000)、增殖系数
(P=0.000)、叶数(P=0.000)、愈伤组织纵向膨大(P=
0.000)的差异极显著。多重比较显示(表 1),不同质
量浓度的抗生素处理对各指标间的差异不同。在培
养基中添加抗生素,楸树诱导增殖分化芽均低于对
照(质量浓度为 0 mg/L);随着质量浓度的增大,呈
现出逐渐降低的变化趋势,与对照相比,变化呈负相
关。卡那霉素与潮霉素的作用基本相同,随着添加
质量浓度的增大都呈负相关。与对照相比,在培养
基中添加低质量浓度的潮霉素(1 mg/L)对 2-8的分
化指标增殖芽数、叶数及茎段基部愈伤组织的膨大
有一定的促进作用,但对分化芽的生长有一定的抑
制作用。添加卡那霉素质量浓度为 50 mg/L时叶片
开始发黄;当浓度为 100 mg/L时叶片开始发白,叶
尖开始干枯,茎段基部愈伤组织基本停止膨大,瓶苗
生长缓慢;当浓度为 150 mg/L时叶片大多发白,叶
片干枯,茎段基部无愈伤组织形成,瓶苗基本不生
长。依此,楸树继代瓶苗的分化芽对卡那霉素的耐
受范围为 100~150 mg/L。添加潮霉素质量浓度为
1 mg/L时叶片开始发黄;当浓度为 5 mg/L时叶片开
始发白,叶片小,茎段基部愈伤组织较小,瓶苗生长
缓慢;当浓度为 10 mg/L时叶片开始干枯,茎段基部
愈伤组织较小,瓶苗基本不生长。依此,楸树继代瓶
苗的分化芽对潮霉素的耐受范围为 10 mg/L左右。
2.1.2 潮霉素对楸树无性系 1-4继代瓶苗生长的影
响 方差分析显示,经不同质量浓度的潮霉素处理,
1-4瓶苗的增殖芽数(P=0.009)、芽长(P=0.001)、愈
伤组织横向膨大(P=0.005)、增殖系数(P=0.002)、叶
数(P=0.000)、愈伤组织纵向膨大(P=0.009)的差异
极显著。多重比较显示(表 2),不同浓度处理对各指
标间的差异不同。与对照相比,低质量浓度(1 mg/
L)潮霉素对楸树无性系 1-4分化芽数有促进作用,
而对其他指标有明显的抑制作用;随着潮霉素质量
浓度(5、10 mg/L)的加大,对各指标出现明显的抑
制,与对照相比,变化趋势呈负相关。在促进增殖分
化芽数方面,潮霉素对无性系 1-4与 2-8的影响一
致,说明低质量浓度(1 mg/L)的潮霉素对楸树无性
系的继代分化芽数有一定的促进作用。
2.1.3 潮霉素对无性系 1-4、2-8分化差异的影响
见表 3,同一抗生素对不同无性系间继代分化指标
的影响差异不显著,在同等培养条件下,无性系间分
化指标的差异主要取决于无性系遗传因素的制约。
2.2 抗生素对楸树生根瓶苗生长的影响
2.2.1 抗生素对楸树无性系 2-8生根瓶苗生长的影
表1 不同质量浓度的潮霉素和卡那霉素对 2-8组培苗继代分化的影响
抗生素浓度
(mg/L)
对照0
潮霉素1
潮霉素5
潮霉素10
卡那霉素25
卡那霉素50
卡那霉素100
卡那霉素150
性状指标采用 x±s;多重比较采用Ducan法,同一列不同字母表示有显著差异(α=0.05)
增殖芽数
3.428±1.076 a
3.667±0.835 a
2.233±0.115 bc
1.933±0.115 b
3.293±0.616 a
2.867±0.702 ab
2.258±0.169 ab
1.833±0.351 b
增殖芽长(cm)
1.483±0.380 a
1.297±0.317 a
0.389±0.013 b
0.199±0.021 b
1.382±0.163 a
1.271±0.314 a
1.080±0.124 a
0.136±0.006 b
叶数
7.979±0.605 a
8.783±0.615 a
6.168±0.301 b
3.660±0.113 c
7.310±0.343 ab
6.922±0.591 bc
6.244±0.345 b
2.598±0.231 c
茎段基部愈伤组织
横向膨大(cm)
0.952±0.127 a
1.136±0.212 a
0.350±0.046 b
0.388±0.123 b
0.345±0.109 b
0.171±0.043 c
0.067±0.115 c
0.000±0.000 c
茎段基部愈伤组织
纵向膨大(cm)
0.866±0.052 a
0.936±0.145 a
0.448±0.033 b
0.437±0.040 b
0.656±0.106 a
0.300±0.087 b
0.167±0.289 bc
0.000±0.000 c
增殖系数
4.975±1.381 a
4.811±1.672 a
0.869±0.073 b
0.386±0.060 b
4.486±0.379 a
3.726±1.711 ab
2.458±0.197 b
0.249±0.036 c
表2 不同质量浓度的潮霉素对 1-4组培苗继代分化的影响
潮霉素浓度
(mg/L)
0
1
5
10
性状指标采用 x±s;多重比较采用Ducan法,同一列不同字母表示有显著差异(α=0.05)
增殖芽数
2.733±0.306 ab
3.476±0.500 a
2.230±0.323 bc
1.738±0.625 c
增殖芽长(cm)
1.792±0.353 a
1.469±0.433 a
0.514±0.406 b
0.127±0.024 b
叶数
8.869±0.867 a
8.848±1.203 a
4.944±1.569 b
2.676±0.434 c
茎段基部愈伤组织
横向膨大(cm)
0.822±0.096 a
0.795±0.093 a
0.525±0.180 b
0.394±0.053 b
茎段基部愈伤组织
纵向膨大(cm)
0.847±0.106 a
0.837±0.178 a
0.520±0.133 b
0.431±0.098 b
增殖系数
4.841±0.564 a
5.243±2.096 a
1.233±0.048 b
0.213±0.050 b
表3 不同质量浓度的潮霉素对楸树无性系 2-8、1-4生根苗培养性状的影响方差分析(P值)
潮霉素浓度(mg/L)
0
1
5
10
增殖芽数
0.343
0.751
0.989
0.623
增殖芽长
0.360
0.607
0.622
0.017
叶数
0.218
0.938
0.255
0.019
茎段基部愈伤
组织横向膨大
0.230
0.064
0.177
0.945
茎段基部愈伤
组织纵向膨大
0.791
0.494
0.417
0.935
增殖系数
0.884
0.794
0.612
0.019
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响 方差分析显示,在楸树无性系 2-8生根培养基
中添加不同浓度的抗生素,对楸树根系诱导有明显
的抑制作用,各处理(卡那霉素 25、50、100、150 mg/
L,潮霉素 1、5、10 mg/L)与对照相比,差异极显著
(P 发根数=0.000、P 根长=0.000、P 发芽数=-、P 芽长=0.000、P 叶数
=0.000、P生根率=0.000)。随卡那霉素与潮霉素质量浓
度的升高,生根率及其他指标生长呈下降趋势。潮
霉素质量浓度达 5 mg/L时,生根苗已出现不良生长
状况,少部分茎段干枯;浓度为 10 mg/L时,大部分
茎段干枯,少部分为绿,茎段未出现芽的分化与根的
萌发现象。依此,楸树组培瓶苗生根苗对潮霉素的
耐受范围为 5~10 mg/L。卡那霉素质量浓度达 50
mg/L时,生根苗已出现不良生长状况,生根诱导率
基本是对照的一半;浓度为 100 mg/L时,大部分茎
段干枯,少部分为绿但未分化芽与根;浓度为 150
mg/L时,大部分茎段干枯,极少部分上部为绿,基部
干枯,但未分化芽与根。依此,楸树组培瓶苗生根苗
对卡那霉素的耐受范围为 100~150 mg/L。
2.2.2 卡那霉素对楸树无性系 1-4生根瓶苗生长的
影响 在楸树无性系 1-4生根培养基中添加卡那霉
素 25、50、100、150 mg/L,与对照相比,差异极显著
(P 发根数=0.000、P 根长=0.000、P 发芽数=-、P 芽长=0.000、P 叶数
=0.000、P 生根率=0.000),影响趋势与 2-8类似,随抗生
素质量浓度的升高,各生长指标受到明显抑制。当
卡那霉素浓度达 100 mg/L时,茎段部分为绿,部分
干枯,茎段无发根发芽情况;浓度为 150 mg/L时,茎
段基本全部干枯,仅极少数为绿,但未分化芽与根。
2.2.3 卡那霉素对无性系 1-4、2-8生根差异的影
响 由表 6可知,不同质量浓度的卡那霉素对楸树
无性系 2-8、1-4生根苗培养性状的影响相同,不同
无性系间并无差异,说明在楸树无性系生根培养基
中添加卡那霉素对生根培养性状的抑制有普适性。
3 讨论
生物体对周围环境都有一定的适应性,当环境
处于逆境时,生物体会对逆境产生一定的抗性,逆境
强度决定了生物体能否生存。抗生素与盐胁迫、低
温胁迫、病害等的发生类似,也是一种逆境胁迫。在
植物遗传转化体系中,不同植物、不同材料对抗生素
的敏感性不同。因此,进行选择性抗生素的抗性试
验并筛选出适宜浓度,是转基因进行的前提 [13]。在
抗生素的选择上,卡那霉素与潮霉素较为常用,卡那
霉素的应用更为普及。
本试验结果表明,卡那霉素对楸树组培苗生长
有明显的抑制作用,且与作用浓度呈负相关。潮霉
素与卡那霉素对楸树瓶苗的影响基本类似,但低质
量浓度(1 mg/L)的潮霉素对继代芽的分化有促进作
用,抗生素对植物组培材料的分化有促进作用还未
见报道。潮霉素对楸树无性系 2-8、1-4组培继代分
表4 不同质量浓度的潮霉素和卡那霉素对楸树无性系 2-8生根苗培养性状的影响
抗生素浓度(mg/L)
对照0
潮霉素1
潮霉素5
潮霉素10
卡那霉素25
卡那霉素50
卡那霉素100
卡那霉素150
性状指标采用 x±s;多重比较采用Ducan法,同一列不同字母表示有显著差异(α=0.05)
发根数
2.585±1.160 a
1.736±0.468 ab
0.606±0.261 c
0.000±0.000 c
1.555±0.574 b
0.567±0.208 c
0.000±0.000 c
0.000±0.000 c
根长(cm)
0.668±0.104 ab
0.742±0.064 a
0.440±0.139 c
0.000±0.000 d
0.640±0.094 ab
0.561±0.106 bc
0.000±0.000 d
0.000±0.000 d
发芽数
1.000±0.000
1.000±0.000
1.000±0.000
0.000±0.000
0.000±0.000
1.000±0.000
0.000±0.000
0.000±0.000
芽长(cm)
0.789±0.296 a
0.562±0.098 ab
0.244±0.038 cd
0.000±0.000 d
0.527±0.194 b
0.290±0.108 c
0.000±0.000 d
0.000±0.000 d
叶数
5.607±0.879 a
4.648±0.530 ab
2.287±0.478 c
0.000±0.000 d
4.030±0.602 b
2.933±1.102 c
0.000±0.000 d
0.000±0.000 d
生根率(%)
69.630±19.448 a
61.110±24.058 a
38.423±5.612 b
0.000±0.000 c
56.667±5.774 ab
36.667±11.547 b
0.000±0.000 c
0.000±0.000 c
表5 不同质量浓度的卡那霉素对楸树无性系 1-4生根苗培养性状的影响
卡那霉素浓度(mg/L)
0
25
50
100
150
性状指标采用 x±s;多重比较采用Ducan法,同一列不同字母表示有显著差异(α=0.05)
发根数
1.093±0.100 a
0.924±0.392 b
0.682±0.191 b
0.000±0.000 c
0.000±0.000 c
根长(cm)
0.816±0.093 a
0.744±0.222 a
0.671±0.162 a
0.000±0.000 b
0.000±0.000 b
发芽数
1.000±0.000
1.000±0.000
1.000±0.000
0.000±0.000
0.000±0.000
芽长(cm)
0.677±0.055 a
0.402±0.061 b
0.504±0.163 b
0.000±0.000 c
0.000±0.000 c
叶数
5.242±1.005 a
4.133±0.231 b
3.545±0.127 b
0.000±0.000 c
0.000±0.000 c
生根率(%)
73.940±6.824 a
44.850±8.400 b
31.817±12.822 b
0.000±0.000 c
0.000±0.000 c
表6 不同质量浓度的卡那霉素对楸树无性系 2-8、1-4生根苗培养性状的影响方差分析(P值)
卡那霉素浓度(mg/L)
0
25
50
100
150
发根数
0.368
0.191
0.519
—
—
根长
0.139
0.493
0.382
—
—
发芽数
—
—
—
—
—
芽长
0.577
0.346
0.132
—
—
叶数
0.661
0.796
0.393
—
—
生根率
0.736
0.115
0.652
—
—
于永明等:不同浓度卡那霉素、潮霉素对楸树试管苗生长的影响 835
生 物 技 术 通 讯LETTERS IN BIOTECHNOLOGY Vol.25 No.6 Nov., 2014
化各生长指标影响相同,说明试验结论并非偶然,楸
树无性系继代培养过程中,培养前期主要为茎段基
部的愈伤组织膨大,随着愈伤组织的形成与膨大,其
他指标也开始迅速增长,当愈伤组织膨大到一定程
度(一般在培养 30~40 d)时开始褐化干枯,潮霉素
可能阻止了愈伤组织释放的酚类物质的氧化,延缓
楸树茎段基部愈伤组织的褐化干枯,提高芽的分化,
其内在机理还有待深入研究。楸树供试无性系对卡
那霉素与潮霉素的耐受浓度一致,同等质量浓度的
抗生素对 2种无性系的作用无显著差异,敏感浓度
相同,在杨树[14]研究中涉及了不同树种,表明耐受浓
度不同,无性间还未见有其他研究报道。
近年来,关于植物抗生素耐受性研究应用取得
了一定的进展,以组培手段选择抗生素耐受浓度在
菊花、烟草、杨树、川芎、黄瓜、大豆、苹果[13-22]等植物
中有研究报道,选择的抗生素主要为卡那霉素与潮
霉素。研究表明,抗生素对植物组培生长有明显的
抑制作用,本试验结果与之吻合。不同植物、不同材
料、不同培养阶段的耐受浓度不同,大多植物材料对
卡那霉素的敏感浓度为 5.0~100 mg/L。30 mg/L卡
那霉素能够明显抑制菊花茎段的分化,10 mg/L能
够抑制生根 [15];卡那霉素与潮霉素对烟草叶片的分
化抑制浓度均为 30 mg/L[16];杨树叶片、茎段对潮霉
素的敏感浓度为 1.0~6.0 mg/L[14,17],叶片对卡那霉素
素的敏感浓度为 20~40 mg/L[14,17-18];川芎的根、茎、叶
对卡那霉素的耐受浓度为 20~40 mg/L[13];以黄瓜种
子为供试材料,魏爱民等研究认为,200 mg/L的卡
那霉素能够抑制黄瓜幼苗的生长。本试验研究材料
为楸树茎段,研究结论与大多研究报道基本一致。
综合来看,种子与茎段对抗生素的耐受性质量浓度
稍高,叶片较低;植物对卡那霉素的耐受浓度高于潮
霉素,这也说明潮霉素对楸树组培苗的毒性较大。
卡那霉素是目前应用较为广泛的选择抗生素,在植
物组培应用筛选技术基本成熟的同时,也逐渐应用
于田间转基因植株的筛选,这在苜蓿、棉花、大豆、番
茄、水稻、小麦等作物中有研究报道[19]。
蒋卫东 [13]等认为,遗传转化体系中的筛选剂必
须是植物细胞的抑制剂,但不可杀死细胞,转化体系
过程中低毒性化合物的选择效果优于高毒性化合
物,当选择剂对植物细胞具有强毒害时,细胞将快速
死亡,死亡或将死细胞对邻近的细胞将产生抑制作
用,使邻近转化细胞也受到抑制[20]。依此机理,作为
选择性抗生素,卡那霉素的毒性远远低于潮霉素,王
丹 [14]等对杨树的研究也得到同样结论,这也与本试
验结论一致。不同植物对抗生素的敏感性不同,这
只是在少部分植物研究中有结论,大部分研究报道
在抗生素选择上局限于同一抗生素不同浓度的筛
选,很少有不同抗生素针对同一植物的选择研究。
有必要拓展相关研究领域,为植物遗传转化体系奠
定扎实的理论基础与实践经验。
参考文献
[1] 于永明, 王军辉, 马建伟, 等. LaCl3对楸树无性系试管苗生长
的影响[J]. 东北林业大学学报, 2011,39(1):31-33.
[2] 于永明, 王军辉, 张宋智, 等. 二次回归正交设计在楸树离体
生根培养中的应用[J]. 南京林业大学学报(自然科学版), 2011,
35(4):47-50.
[3] 于永明, 王军辉, 马建伟, 等. 楸树无性系离体培养特性差异
研究[J]. 西北植物学报, 2012,32(1):199-204.
[4] 于永明, 王军辉, 麻文俊, 等. 同一离体培养下梓树属不同种
的反应差异[J]. 东北林业大学学报, 2013,41(12):17-20.
[5] 江荣翠, 彭方仁, 谭鹏鹏, 等. 楸树体细胞胚胎发生的研究[J].
南京林业大学学报(自然科学版), 2010,34(2):15-18.
[6] 甘肃省质量技术监督局. 楸树无性系组培快繁技术规程 [S].
DB62/T 2013-2011, 2011-01-11.
[7] 王坤波, 张香娣, 刘方, 等. 子叶期卡那霉素快速鉴定转基因
棉花[J]. 中国棉花, 2001,(2):20-21.
[8] 王紫萱, 易自力. 卡那霉素在植物转基因中的应用及其抗性基
因的生物安全性评价[J]. 中国生物工程杂志, 2003,23(6):9-13.
[9] Pettinger R C, Wolfe R N, Hoehn M M, et al. Preliminary
studies on the production and biological activity of a new an⁃
tibiotic[J]. Antibiot Chemother, 1953,3:1268-1278.
[10] Gritz L, Davies J. Plasmid-encoded hygromycin B resistance:
the sequence of hygromycin B phosphotransferase gene and
its expression in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisi⁃
ae[J]. Gene, 1983,25(2-3):179-188.
[11] Kaster K R, Burgett S G, Rao R N, et al. Analysis of a bac⁃
terial hygromycin B resistance gene by transcriptional and
translational fusions and by DNA sequencing[J] Nucleic Acids
Res, 1983,11(19):6895-6911.
[12] Rao R N, Allen N E, Hobbs J N Jr, et al. Genetic and enzy⁃
matic basis of hygromycin B resistance in Escherichia coli[J].
Antimicrobial Agents Chemother, 1983,24(5):689-695.
[13] 蒋卫东, 唐琳, 杨苍劲, 等. 卡那霉素对川芎愈伤组织诱导和
生长的影响[J]. 河南农业科学, 2007,(11):85-87.
[14] 王丹, 邹莉, 王义, 等. 杨树对潮霉素的敏感性研究[J]. 吉林农
业大学学报, 2010,32(1):47-50.
[15] 王沛, 周洲, 尹新明, 等. 不同质量浓度抗生素对菊花‘绿鹦
哥’茎段组织培养的影响 [J]. 河南农业大学学报, 2010,44(1):
96-99.
[16] 李胜彬, 胡根海, 王清连. 烟草叶片直接再生植株及抗生素耐
受性研究[J]. 种子, 2010,29(4):38-39.
[17] 邹莉, 王丹, 赵光洁, 等. 单倍体小黑杨对潮霉素的敏感性研
究[J]. 林业科技, 2008,33(4):7-9.
[18] 程贵兰, 蔡智军. 卡那霉素对小黑杨花粉植株叶片分化及试管
苗生根的影响[J]. 辽宁农业职业技术学院学报, 2010,12(2):3-4.
[19] 燕丽萍, 夏阳, 梁慧敏, 等. 卡那霉素叶片涂抹法田间筛选转
基因苜蓿的研究[J]. 中国农学通报, 2009,25(14):22-26.
[20] 魏爱民, 张文珠, 杜胜利, 等. 黄瓜花粉管通道法抗虫基因导
入及卡那霉素抗性筛选[J]. 华北农学报, 2008,23(6):54-57.
[21] 袁鹰, 刘德璞, 王玉民, 等. 卡那霉素对大豆生长的抑制及筛
选试验研究[J]. 大豆科学, 2003,22(4):261-263.
[22] 梁海永, 姚伟明, 杜鸿云, 等. 苹果叶片再生体系建立研究[J].
河北林果研究, 2005,20(3):247-249.
836