全 文 ：根癌农杆菌介导的植物遗传转化方法是植物转
基因中较常见的、 普遍应用的方法， 迄今所获得的
近 200种转基因植株中， 通过该方法获得的约为
80%[1]。 采用该方法在进行遗传转化前， 对受体材
料进行抗生素敏感性试验十分必要， 抗生素主要包
括抑菌抗生素和筛选阳性转化子的抗性筛选剂， 前
者主要是抑制农杆菌生长， 并且不影响受体的正常
分化和生长， 目前使用较多的主要有头孢霉素和羧
苄青霉素； 后者则根据菌株所携带的抗生素抗性标
记基因使用不同种类的抗生素作为抗性筛选剂， 其
抗生素对剑麻愈伤组织生长和植株再生的影响①
张燕梅② 李俊峰 周文钊③ 林映雪
(中国热带农业科学院南亚热带作物研究所/海南省热带作物营养重点实验室(筹)
广东湛江 524091)
摘 要 研究卡那霉素、 潮霉素、 头孢霉素和羧苄青霉素对剑麻愈伤组织生长、 不定芽分化及生根的影响， 并确
定抑制农杆菌生长的头孢霉素、 羧苄青霉素的质量浓度。 结果表明： 潮霉素明显抑制剑麻愈伤组织生长和不定
芽分化， 卡那霉素次之， 头孢霉素和羧苄青霉素相对较小； 4种抗生素均能抑制剑麻生根， 其抑制效果依次为
头孢霉素＞卡那霉素＞羧苄青霉素＞潮霉素。 头孢霉素和羧苄青霉素的浓度大于 200mg/L时， 农杆菌生长完全
被抑制。 在筛选剑麻转化体时， 卡那霉素和潮霉素的使用浓度分别以 100、50mg/L为宜， 羧苄青霉素和头孢霉
素的使用浓度均为 200mg/L。
关键词 剑麻 ； 抗生素 ； 愈伤生长 ； 植株再生
分类号 S563.9
Effects of Antibiotics on Callus Growth and Shoot Regeneration of Sisal
ZHANG Yanmei LI Junfeng ZHOU Wenzhao LIN Yingxue
(South Subtropical Crops Research Institute / Hainan Provincial Key Laboratory for Tropical Crops
Nutrition (To be set up) , Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,
Zhanjiang, Guangdong 524091)
Abstract The dose response assay was performed to insight into the effects of kanamycin, hygromycin,
cefotaxime, and carbenicillin on the callus growth, adventitious buds regeneration and root induction of
sisal. The optimum concentrations of cefotaxime and carbenicillin inhibiting Agrobacterium was
determined. The results showed that the callus growth and adventitious buds regeneration were greatly
inhibited by hygromycin, followed by kanamycin, cefotaxime and carbenicillin. Root induction was
inhibited by each of the four antibiotics, with the order of cefotaxime > kanamycin > carbenicillin >
hygromycin. The growth of Agrobacterium was completely inhibited by 200 mg/L cefotaxime or
carbenicillin. In conclusion, 100 mg/L kanamycin, 50 mg/L hygromycin, 200 mg/L cefotaxime or
carbenicillin was recommended to screen transformed tissue in Agrobacterium-mediated transformation of
sisal.
Keywords sisal ; antibiotic ; callus growth ; plant regeneration
① 基金项目： 中央级公益性科研院所基本业务费专项(No.sscri200802， No.1251022011010)； 现代农业产业技术体系建设
专项资金资助(No.CARS-19)。
收稿日期： 2012-06-19； 责任编辑/黄东杰； 编辑部 E-mail： rdnk@163.com。
② 张燕梅(1975～)， 女， 博士， 助理研究员， 主要研究方向为作物育种。
③ 通讯作者： 周文钊(1965～)， 博士， 副研究员， 主要研究方向为作物育种； E-mail: zwenzhao@163.com。
Vol．33, No．1
2013年1月 热 带 农 业 科 学
CHINESE JOURNAL OF TROPICAL AGRICULTURE
第33卷第1期
Jan． 2013
5- -
2013年1月 第33卷第1期热带农业科学
中卡那霉素和潮霉素是转化体筛选较为常用的抗生
素。
剑麻是我国主要的热带纤维作物， 其纤维具有
拉力强、 抗撕裂、 耐磨、 防腐等特性， 广泛应用于
国防、 航海、 交通运输、 石油、 冶金等领域[2]。 目前
利用农杆菌介导法开展剑麻转基因研究已有成功的
报道[3-4]， 并且Silvia等[3]也开展了卡那霉素对普
通剑麻敏感性试验研究， 但不同受体类型对抗生素
的敏感程度存在差异[5-6]， 而且不同载体所携带的
抗性标记基因也不同。 本研究室已成功建立了剑麻
agave hybrid cv No.11648再生体系[7]和表达载体，
下一步将开展剑麻遗传转化的研究。 为了保证在剑
麻遗传转化过程中有效的抑制农杆菌的生长而不影
响转化受体的正常生长和分化， 减少假阳性转化体
的出现， 提高转化效率。 本试验系统研究了卡那霉
素、 潮霉素、 头孢霉素和羧苄青霉素等对剑麻茎尖
愈伤组织生长和植株再生的影响， 并针对抑菌抗生
素对农杆菌EHA105的抑菌效果作了探讨， 旨在为剑
麻遗传转化的研究提供参考。
1 材料与方法
1. 1 材料
剑麻(Agave hybrid cv No.11648)的无菌试管苗
由本实验室建立并保存， 农杆菌为EHA105； 卡那霉
素(Kanamycin, Km)、 头孢霉素(Cefotaxime, Cef)和
羧苄青霉素(Carbenicillin, Carb)购自Amresco公司，
潮霉素(Hygromyoin, Hyg)购自Roche公司， 其它试
剂均购自广东健阳生物科技有限公司。
1. 2 抗生素敏感性试验
以剑麻无菌苗茎尖为材料诱导愈伤组织， 取黄
豆大小的黄绿色球状或块状愈伤组织接种于加有抗
生素的愈伤生长和分化培养基上进行培养， 愈伤生
长培养基为MS＋6-BA(2.0mg/L)＋NAA(0.2mg/L)＋
抗生素＋蔗糖(30g/L)＋卡拉胶(7.5g/L)； 不定芽
分化培养基为SH＋6-BA(3.0mg/L)＋NAA(0.2mg/L)
＋IBA(0.1mg/L)＋抗生素＋蔗糖(30g/L)＋卡拉胶
(7.5g/L)； 生根培养基为MS＋抗生素＋蔗糖(30g/L)
＋卡拉胶(7.5g/L)。 在愈伤组织生长和不定芽分化
阶段， 每种抗生素各取6个浓度梯度， 其中卡那霉
素的质量浓度为 25、 50、 80、 100、 200、 300mg/L；
潮霉素的质量浓度为5、 10、 25、 50、 80、 100mg/L；
头孢霉素和羧苄青霉素的质量浓度为 100、 200、
300、 500、 800、 1000mg/L； 在生根阶段， 每种抗
生素各取4个浓度梯度， 其中卡那霉素的质量浓度
为 25、 50、 100、 200 mg/L； 潮霉素的质量浓度为
10、 25、 50、 100mg/L； 头孢霉素和羧苄青霉素的质
量浓度为200、 300、 500、 800mg/L； 以上试验均设
置相应的对照。 每个处理10瓶， 每瓶接种4个外植
体。 培养条件为： 温度(26±2)℃， 光照12h/d， 光
强40μmol/(m2·s)， 每2周继代1次。
抑菌试验的头孢霉素和羧苄青霉素的质量浓度
为 200、 300、 500、 800 mg/L， 外植体经农杆菌浸
染、 共培养后， 分别接种在加入以上浓度的头孢霉
素和羧苄青霉素的不定芽诱导培养基上， 2周后观
察农杆菌的生长情况， 培养条件同上。
1. 3 数据处理
愈伤组织在添加抗生素的培养基上培养 45 d
后， 观察愈伤生长、 不定芽分化及生根情况， 并统
计愈伤组织生长情况、 愈伤组织白化率、 愈伤组织
死亡率、 不定芽分化率、 分化系数、 根长和生根
数。 愈伤生长情况用 “＋” 表示， “＋” 越多则表
明愈伤团块生长越大。
愈伤组织白化率＝(白化的愈伤组织数/接种的
愈伤组织总数)×100%。
愈伤组织死亡率＝(死亡的愈伤组织数/接种的
愈伤组织总数)×100%。
不定芽分化率＝(分化出不定芽的愈伤组织数/
接种的愈伤组织总数)×100%。
分化系数＝所有分化出的不定芽总数/分化不
定芽的愈伤组织数。
所有数据均采用SAS分析软件进行统计， 并进
行差异显著性分析。
2 结果与分析
2. 1 抗生素对剑麻愈伤组织生长的影响
4种抗生素对剑麻愈伤组织的生长都有一定影
响， 见 表1， 其中潮霉素影响最为显著， 当潮霉素
浓度为10mg/L时， 其愈伤生长明显受抑制， 10d
后出现褐化死亡， 随着浓度的增加， 其死亡率明显
加大； 当潮霉素浓度大于 80 mg/L时， 死亡率在
6- -
张燕梅 等 抗生素对剑麻愈伤组织生长和植株再生的影响
(89.29± .09)%以上。 低浓度卡那霉素对愈伤生长
有一定的促进作用， 当浓度为 200mg/L时， 愈伤
组织出现白化， 随着卡那霉素浓度的增加， 白化比
例升高； 当卡那霉素浓度为 300mg/L时， 白化率
为(96.57±0.79)%， 白化的愈伤组织有部分可分化
再生植株， 但多表现白化， 并且在后续继代中死亡
(图1E)。 在100～500mg/L浓度范围内， 头孢霉素
和羧苄青霉素对愈伤生长几乎无显著影响， 当两者
浓度大于 500mg/L时， 对愈伤生长有一定抑制作
用； 当浓度为 800mg/L时， 愈伤组织出现少量褐
化死亡， 其褐化死亡率分别为(10.83±1.67)%和
(9.17±2.20)%， 随着浓度的增加， 褐化比率升高。
2. 2 抗生素对剑麻不定芽分化的影响
潮霉素对不定芽分化的影响最大， 详见表2。 当
潮霉素浓度为5mg/L时， 分化率为(83.33±0.87)%，
分化系数为(7.83±1.19)， 均显著低于对照和其它
抗生素水平， 随着潮霉素浓度的增加， 分化率和分
化系数显著下降； 当潮霉素浓度为100mg/L时， 分
化率仅为(14.77±1.46)%， 分化系数为(2.50±
0.56)， 再生植株生长严重受到抑制， 有的在后续
培养中褐化死亡(图 1H)。 低浓度的卡那霉素对剑
麻不定芽的分化影响不大， 但随着卡那霉素浓度的
增加， 分化率、 分化系数均明显降低， 白化苗比率
显著升高， 玻璃化增加。 当卡那霉素浓度大于100
mg/L时， 白化苗比率均在96%以上， 白化的再生植
株大多数在继代中慢慢死亡(图 1D)。 头孢霉素对
剑麻不定芽分化的影响较低， 在所试浓度范围内，
分化率均在 90.83%以上， 与对照无显著差异， 分
化系数略低于对照水平， 随着头孢霉素浓
度的增加， 有少量白化苗出现。 当头孢霉
素的浓度为 1 000 mg/L时， 分化系数为
(11.33±0.83)， 白化苗(图 1J)比率为
(10.56±0.48)%。 羧苄青霉素对不定芽分
化影响最小， 当羧苄青霉素的浓度小于
300mg/L时， 与对照无显著差异， 随着浓
度的升高， 分化系数略有下降； 当羧苄青
霉素的浓度为1000mg/L时， 分化系数为
(13.95±1.05)， 白化苗(图 1I)比率为
(8.89±0.10)%。
2. 3 抗生素对剑麻不定芽生根的影响
与对照相比， 未加入抗生素的不定芽
在生根培养基上培养 10～15 d后就有根
长出， 加入一定浓度的抗生素对剑麻生根
均有不同程度的影响(表3)。 头孢霉素影
响最严重， 既影响生根， 又抑制根的伸长，
当头孢霉素浓度为800mg/L时， 生根率为
(47.22±3.13)%， 根长为(2.28±0.24)cm，
平均生根数为(2.01±0.53)条。 卡那霉素
对剑麻组培苗生根的影响仅次于头孢霉素，
并且随着浓度的增加， 抑制越明显， 当卡
那霉素浓度为 200 mg/L时 ， 生根率为
(64.76±2.90)%， 生根数为(2.61±0.41)
条， 根长为(2.91±0.25)cm。 羧苄青霉素为300～
500mg/L时， 抑制根的伸长； 但当羧苄青霉素浓度
过低或过高时， 生根率明显下降， 生根数减少， 根
的生长受到抑制， 均显著低于对照水平。 当羧苄青
抗生素
类型
浓度
/(mg·L-1)
愈伤
生长
愈伤死亡率
/%
愈伤白化率
/%
卡那霉素
25 +++ 0 0
50 +++ 0 0
80 ++ 0 (17.44±1.17)A
100 ++ 0 (28.28±0.7 )B
200 ++ (23.24±0.88)E (55.83±0.8 )C
300 ++ (50.92±1.71)D (96.57±0.79)D
潮霉素
5 ++ 0 0
10 +/- (19.07±1.57)E 0
25 +/- (55.00±1.44)D 0
50 - (71.31±2.17)C 0
80 - (89.29±2.09)B 0
100 - (95.83±0 4)A 0
头孢霉素
100 ++ 0 0
200 ++ 0 0
300 ++ 0 0
500 ++ 0 0
800 +/- (10.83± .67)F 0
1000 +/- (21.67±0.83)E 0
羧苄青霉素
100 ++ 0 0
200 ++ 0 0
300 ++ 0 0
500 ++ 0 0
800 +/- (9.17±2.20)F 0
1000 +/- (14.17±0.84)F 0
表 1 抗生素对剑麻愈伤组织生长的影响
说明： “+” 表示愈伤增殖； “-” 表示抑制生长或死亡； “+/-” 表示部分死亡；
同列数据后不同大写字母表示0.01水平上的差异显著性， 下同。
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2013年1月 第33卷第1期热带农业科学
霉素浓度为 200、 800 mg/L时 ， 生根率分别为
(79.58±2.32)%和(80.00±2.89)%， 生 根 数 为
(3.92±0.53)和(4.22±0.34)条 ， 根长为(3.79±
0.19)、 (4.02＋0.13)cm。 潮霉素影响根的伸长， 并且
随着潮霉素浓度的增加， 影响越明显， 当潮霉素浓度
为200mg/L时， 平均根长为(5.73±0.20)cm， 显著低
于对照(8.44±0.25)cm； 但对剑麻组培苗生根率和
生根数影响不大， 在所试浓度范围内， 生根率均在
92.12%以 上 ， 平 均 生 根 数 在(4.91±0.40)与
(5.32±0.49)条之间， 与对照无显著差异。
2. 4 抗生素对农杆菌生长的抑制效果
结果表明， 在所试头孢霉素和羧苄青霉素的质
表 2 抗生素对剑麻不定芽分化的影响
抗生素类型对照 浓度/(mg·L-1) 分化率/% 分化系数 白化苗比率/%
卡那霉素
0 (95.33±3.00)AB (20.52±1.79)A -
10 (95.83±0.83)AB (14.67±1.63)BC (10.44±0.55)E
25 (84.80±2.41)DE (12.89±2.39)BCDE (30.49±0.38)D
50 (71.67±2.2)F (12.78±1.77)BCDE (76.25±0.79)C
100 (65.83±1.67)FG (10.20±1.31)CDEF (96.79±0.79)B
200 (68.07±2.94)F (6.67±2.43)FGHI (98.67±1.09)A
300 (66.10±0.74)FG (6.23±1.18)FGHI (99.42±0.58)A
潮霉素
5 (83.33±0.87)CDE (7.83±1.19)FGH -
10 (60.83±3.63)HG (6.15±0.67)FGHI -
25 (57.50±3.82)H (5.00±0.73)GHI -
50 (42.33±2.89)I (4.29±0.59)GHI -
80 (31.57±3. 2)I (3.06±0.52)HI -
100 (14.77±1.46)J (2.50±0.56)I -
头孢霉素
200 (95.83±0.83)AB (13.76±0.95)BC -
300 (98.33±0.83)A (14.39±0.9 )BC -
400 (97.50±1.44)AB (13.18±1.04)BCD -
500 (98.33±0.83)A (13.15± .09)BCD -
800 (94.17±0.83)ABC (12.79±0.98)BCDE (8.26±2.7)FG
1 000 (90.83± )BCD (11.33±0.83)CDE (10.56±0.48)E
羧苄霉素
200 (96.67±0.83)AB (16.88±1.12)AB -
300 (99.17±0.83)A (16.94± .06)AB -
400 (98.33±0.83)A (14.85± .26)BC -
500 (97.50±2.50)AB (14.50±1.18)BC -
800 (90.83±1.67)BCD (14.13±0.90)BC (6.92±0.27)G
1 000 (88.33±0 8 )CDE (13.95±1.05)BC (8.89±0.10)EF
说明： 表中数据为 “平均值±标准差”， “-” 表示正常。
图 1 抗生素对剑麻愈伤组织诱导不定芽的影响
说明： A： 愈伤组织； B： 愈伤组织分化不定芽； C～E： 愈伤组织分别在添加10、 100、 300mg/L卡那霉素培养基上分化不定芽； F～
H： 愈伤组织分别在添加5、 50、 100mg/L潮霉素培养基上分化不定芽； I～J： 愈伤组织分别在添加 1000mg/L羧苄青霉素和1000mg/L
头孢霉素培养基上分化不定芽。
8- -
张燕梅 等 抗生素对剑麻愈伤组织生长和植株再生的影响
量浓度200～800mg/L范围内， 农杆菌生长均被完
全抑制。
3 讨论与结论
本研究结果显示， 以生长2周左右黄豆大小的
剑麻茎尖愈伤组织为受体开展遗传转化研究时， 卡
那霉素和潮霉素的使用浓度分别以100、 50mg/L为
宜， 头孢霉素和羧苄青霉素的浓度均为 200mg/L。
以上研究结果与Silvia等[3]和丁静等[4]的研究结果
存在差异。 Silvia等[3]在以农杆菌LBA4404介导的
Agave salmiana遗传转化研究中， 以叶片和胚性愈伤
为受体， 使用的卡那霉素浓度为50mg/L， 头孢霉素
为 250mg/L； 丁静等[4]以 Agave americana Linnaeus
叶片基部为受体， 潮霉素的浓度为25mg/L。 这可能
与不同的外植体或基因型对抗生素的敏感性不同有
关。 法国 Blanc等[6]使用巴龙霉素作为巴西橡胶树
内珠被胚性愈伤遗传转化的筛选抗生素， 且获得了
转基因植株； 但黄天带等[5]利用巴西橡胶树的花药
胚性愈伤为受体， 巴龙霉素则没有选择压力。
研究同时表明， 抗生素的浓度与愈伤组织大小
和继代次数存在一定关系。 黄璐等[8]研究认为， 继
代次数增加， 愈伤组织的分化频率明显下降， 甚至
根本不能分化出芽苗， 可能与愈伤组织本身的活力
和生理状态有关。 研究还发现， 低浓度的卡那霉素
可促进愈伤组织的生长， 随着浓度的增加， 白化死
亡率逐渐增加， 并且出现了玻璃化现象。 彭金库等[9]
在芦竹的研究中发现， 与对照相比， 10～100mg/L
卡那霉素对芦竹外植体不定芽的诱导有极显著促进
作用， 但随着浓度的升高出现了白化现象。
不同浓度的卡那霉素和潮霉素均抑制剑麻生根，
前者比后者明显。 丁焱等[10]的研究认为， 潮霉素对
甘菊生根的影响比卡那霉素大。 韦大器等[11]研究发
现， 当卡那霉素质量浓度为4mg/L时， 尾巨桉不定
芽不能生根。 欧阳乐军等[12]研究认为， 培养基中潮
霉素浓度大于15mg/L， 卡那霉素浓度大于25mg/L
时， 尾巨桉不定芽诱导生根困难。 而郭利军等[13]的
研究结果表明， 400mg/L的卡那霉素才可完全抑制
巨桉无性系Eg5的生根。 因此， 在实际操作中， 抗
生素浓度的确定要依照具体材料或基因型而定。
相对而言， 头孢霉素和羧苄霉素对剑麻愈伤组
织的毒害相对较小， 并且低浓度的头孢霉素和羧苄青
霉素可促进愈伤组织的生长， 随着抗生素浓度的增
加， 对愈伤组织的促进作用减弱。 在200～500mg/L
浓度范围内， 对剑麻愈伤组织生长和不定芽诱导均
无显著影响。 并且 200mg/L的头孢霉素和羧苄青
霉素能很好的抑制农杆菌 EHA105的生长。 早在20
表 3 抗生素对剑麻组培苗生根的影响
抗生素类型对照 浓度/(mg·L-1) 生根率/% 生根数/条 根长/cm
卡那霉素
0 (95.83±2.20)A (5.81±0.69)A (8.44±0.25)A
25 (86.07±0. 4)BCD (3.76±0.32)BC (4.39±0.26)EF
50 (73.61±2.00)E (3.67±0.39)BC (3.96±0.26)FG
100 (81.39±3.09)CDE (3.89±0.46)BC (3.00±0.27)H
200 (64.76±2.90)F (2.61±0.41)C (2.91±0.25)H
潮霉素
10 (92.12±2.44)AB (5.29±0.3 )AB (7.31±0.2 )B
25 (93.85±3.19)AB (5.32±0.49)AB (6.36±0.18)C
50 (95.63±1.57)A (5.26±0.54)AB (6.44±0.18)C
100 (90.48±1.87)AB (4.91±0.40)AB (5.73±0.20)CD
头孢霉素
200 (65.64±3.44)F (2.86±0.54)C (5.05±0.45)DE
300 (85.83±3.00)BCD (2.21±0.43)C (2.91±0.25)H
500 (59.44±2.94)F (3.08±0.87)C (3.21±0.28)GH
800 (47.22±3.13)G (2.01±0.53)C (2.28±0.24)H
羧苄霉素
200 (79.58±2.32)DE (3.92±0.53)BC (3.79±0.19)FG
300 (89.38±3.66)ABC (5.83±0.46)A (5.14±0.14)DE
500 (96.67±2.20)A (5.95±0.43)A (4.93±0.15)DE
800 (80.00±2.89)DE (4.22±0.34)AB (4.02+0.13)DE
说明： 表中数据为 “平均值±标准差”。
9- -
2013年1月 第33卷第1期热带农业科学
世纪末， Maheswaran等和James等[14-15]就提出， 低
浓度的头孢霉素对外植体的再生有促进作用， Lin
等 [16]也认为头孢霉素和羧苄青霉素与生长素
2,4-D、 NAA等有相似的化学结构， 适当浓度的该
类抗生素能促进愈伤组织的分化与生长， 并且在木
瓜[17]、 橡胶[5]等多种植物中都有类似的报道。 刘淑
芳等[18]也认为， 头孢霉素的浓度在500mg/L以内，
对梨叶片的出愈率和不定梢诱导率均无显著影响。
综上所述， 建议在以农杆菌介导的剑麻遗传转
化研究中， 卡那霉素和潮霉素的使用浓度以 100、
50mg/L为宜， 头孢霉素和羧苄青霉素的使用浓度
均为200mg/L， 同时卡那霉素和潮霉素可根据受体
大小和类型作适当调整。
参考文献
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