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第 37 卷第 9 期
2013 年 9 月
水 产 学 报
JOURNAL OF FISHERIES OF CHINA
Vol． 37，No． 9
Sep．，2013
文章编号:1000 － 0615(2013)09 － 1313 － 06 DOI:10． 3724 /SP． J． 1231． 2013． 38634
收稿日期:2013-03-24 修回日期:2013-04-27
资助项目:国家“八六三”高技术研究发展计划(2012AA10A412-8) ;海南大学植物学国家重点学科(071001) ;海南省重点科技项目
(080137) ;国家自然科技基金项目(41176084) ;国家科技支撑计划项目(2009BADB2B0404-02) ;海洋公益行业科研专项
(201105008-7) ;中医药行业科研专项(201207002-03)
通信作者:黄 勃，E-mail:huangbohb1@ 163． com
琼枝野生群体与养殖群体的 EST-SSR分析
胡吟胜1， 段泽林2， 黄 勃1* ， 于淑楠1， 王 婷3
(1．海南大学海洋学院，海南 海口 570228;
2．华东师范大学生命科学学院，上海 200241;
3．中国科学院海洋研究所，山东 青岛 266071)
摘要:为研究野生琼枝与养殖琼枝的遗传差异，利用 EST-SSR 技术分析了海南东北部地区 9
株野生和 9 株养殖琼枝的遗传差异性。结果显示，用 5 对 EST-SSR引物对 18 个个体的基因组
进行扩增，扩增出的片段大小为 250 ～ 2 500 bp，琼枝野生群体和养殖群体的多态性比例分别
为 74． 29%和 70． 00%;野生群体之间的平均遗传距离为 0． 46，养殖琼枝群体之间的平均遗传
距离为 0． 22。聚类分析图显示，在相似系数 0． 49 处，18 株群体按野生与养殖分为 2 大类，在
相似系数 0． 66 附近，野生群体分成 3 类，养殖琼枝群体分为 2 类，在相似系数 0． 73 附近，野生
琼枝群体分成 5 类，而养殖群体为 3 类，相似系数越高，野生群体比养殖群体分类单元越多。
研究表明，野生琼枝群体的遗传多样性比养殖琼枝群体高。
关键词:琼枝;EST-SSR;野生;养殖
中图分类号:S 968． 4 文献标志码:A
琼枝 (Betaphycus gelatinae)属于红藻门
(Rhodophyta) ，杉藻目(Gigartinales) ，红翎菜科
(Solieriaceae) ，琼枝藻属(Betaphycus)。琼枝具不
规则的羽枝，分枝可对生，互生，向四面伸展［1］。
藻体表面多现紫红色或黄绿色，腹面大部分为紫
红色。琼枝具有食用及药用价值，是生产卡拉胶
的重要热带养殖经济红藻［2］。近年来，由于环境
污染及琼枝连续多代养殖，使琼枝的种质资源多
样性降低，与野生群体相比，养殖群体的种质下降
明显，主要表现为琼枝生长速度降低，白化病多
发，养殖成本增加。
EST-SSR是在 SSR上发展起来的一种分子标
记技术［3］，具有很好的稳定性和多态性［4］。目前
EST-SSR技术在海洋动物的野生群体与养殖群体
的遗传差异的研究中被广泛运用，如企鹅珍珠
贝［5］、凡纳滨对虾［6］，在海洋大型藻类方面，也广
泛应用于野生群体与养殖群体的遗传差异的研
究，如海带的野生与养殖遗传分析［7］、坛紫菜野
生种群的遗传多样性［8］，江蓠属的 SSR 标记［9］，
龙须菜野生与选育品种间 SSR 差异［10］的研究。
本实验利用 EST-SSR技术，对琼枝的野生与养殖
群体进行分析，以期为我国琼枝的遗传改良及养
殖技术的改进提供遗传数据。
1 材料与方法
1． 1 实验材料
18 株琼枝采自海南东北部的翁田，其中 9 株
取自翁田养殖区，编号为 1 ～ 9，9 株野生琼枝采自
翁田自然海区，编号为 10 ～ 18。
1． 2 基因组的提取
取琼枝藻株幼嫩部位，每种材料分别在无菌
蒸馏水中清洗，去掉藻株上含带的海水及杂物，吸
干水后用于 DNA 的提取。DNA 的提取分别采用
Omega公司生产的 D2485-01 植物提取试剂盒以
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及赵素芬等［11］的 CTAB 方法和 Hu 等［12］的 SDS
法。试剂盒法具体步骤如下:取 100 mg 研磨成粉
末的样品于 1． 5 mL 的离心管中，加入 500 μL
Buffer CPL，65 ℃水浴 15 min后，加 500 μL氯仿 /
异戊醇(24 ∶ 1)快速混匀 30 s，10 000 × g 离心 1
min后吸取 300 μL 上清液到套有收集管的硅胶
柱中，再加入 150 μL Buffer CXD 和 300 μL 无水
乙醇，混匀后 10 000 × g 离心 1 min，将硅胶柱换
装到另一个收集管中，加入 650 μL SPW 进行洗
涤，10 000 × g离心 1 min后将硅胶柱转移到一个
新的 1． 5 mL 离心管中，加入 50 ～ 100 μL 的
Elution Buffer，65 ℃水浴 3 min，10 000 × g 离心 1
min，离心管中所得的液体即为基因组 DNA 提取
液。提取 DNA后，用 1%琼脂糖凝胶电泳并在凝
胶成像系统拍照检测，查看 DNA提取质量。
1． 3 引物及 PCR
通过麒麟菜 EST序列为模板进行引物设计，
然后从设计的引物中再筛选出其中 5 对引物，进
行 PCR扩增实验。5 对引物信息见表 1。PCR 反
应体系总体系为 20 μL，其中 2 × PCR mix 10 μL，
DNA模板为 1 μL，引物 Primer-F 和 Primer-R 各
1 μL，加超纯水补足体积至 20 μL。扩增条件为
94 ℃预变性 5 min，再进行 25 个循环(变性 94 ℃
30 s，复性 49 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 1 min) ，最后
72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存，采用 3%琼脂糖凝胶
检测，并在凝胶成像系统拍照下拍照。
表 1 引物信息
Tab． 1 Information of primer
引物编号
no． of primer
引物序列(5-3)
primer sequences
DNA 熔解温度 /℃
Tm
1
-AATGTTCGACCGATCTCA-
-CTCTTATGCGGCCAAGTA-
49． 7
2
-ATGTCGCCAGGCAGTCAG-
-CCAACACGCCCATCCATC-
54． 5
3
-ATGTCGCCAGGCAGTCAG-
-GCTTGGCTGAGCTACACG-
46． 2
4
-TCGGAGTTGGGTTGTGAT-
-GAAAGGCAGCCAGAGCAT-
52． 2
5
-CTTTGCTGCTGGGCTGAC-
-GGGAACAATGGACGAGGC-
53． 1
1． 4 数据处理
根据 PCR 产物的电泳图，统计扩增条带，条
带不管强弱，只要出现即记为 1，未出现的则记为
0，将电泳结果转换成数据矩阵，用 NTSYS 2． 10e
软件计算出相似性系数，并做出聚类分析图。
2 结果
2． 1 提取基因组方法选择
对于含糖较多的植物来说，提取高质量的
DNA 难度较大［13］。实验经过试剂盒法、CTAB
法、SDS法 3 种不同的方法来提取琼枝的基因组
DNA，经电泳后得到的电泳结果如图 1。图中 1
号为试剂盒法，2 号为 CTAB 法，3 号为 SDS 法。
图 1 表明 3 种实验方法都可以提取出 DNA，但
CTAB法及 SDS 法提取时间太长，而且蛋白质或
杂糖多，不好去除干净等。用试剂盒法提取
DNA，有操作时间短的优势，而且操作步骤少，可
减少提取过程中的污染机会。综合考虑上述因
素，实验采用试剂盒提取基因组 DNA。
图 1 DNA电泳结果图
Fig． 1 DNA electrophoresis figure
2． 2 条带多态性扩增结果
PCR产物电泳后，结果如图 2 所示，扩增的条
带统计见表 2。
用 5 个引物对 18 个个体进行了扩增，扩增
条带片段大小为 250 ～ 2 500 bp。每个引物对野
生琼枝个体扩增的片段数为 1 ～ 50 个，平均扩增
的条带为 21 条，共扩增出了 105 条片段，其中多
态性条带为 63 条，平 均 多 态 位 点 比 例 为
74． 29%;每个引物对养殖琼枝个体扩增的片段
为 1 ～ 33 个不等，平均扩增的片段为 18 条，一共
扩增出了 90 条片段，其中多态性条带为 78 条，
平均多态位点的比例为 70． 00%。野生琼枝群
体扩增出的片段数及多态性比例均高于养殖琼
枝群体。
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图 2 18 株琼枝的扩增电泳图
Fig． 2 18 strains of amplification electrophoresis map of B． gelatinae
表 2 野生与养殖琼枝扩增条带信息
Tab． 2 Wild and farmed B． gelatinae amplification bands information
群体
population
条带类型
kinds
引物 1
primer 1
引物 2
primer 2
引物 3
primer 3
引物 4
primer 4
引物 5
primer 5
条带总数
total
多态比例 /%
proportion
养殖
wild
扩增条带
amplification bands
1 21 14 21 33 90
多态条带
polymorphic bands
1 12 14 12 24 63
70
野生
farmed
扩增条带
amplification bands
1 34 1 19 50 105
多态条带
polymorphic bands
1 25 1 19 32 78
74． 29
2． 3 遗传相似系数
用 NTSYS 2． 10e 软件分析得到 18 种琼枝间
的相似性系数(表 3)。由表 3 可知，18 份琼枝群
体之间的遗传相似系数GS为0 ． 20 ～ 0 ． 93，平均
表 3 18 种琼枝之间的相似系数
Tab． 3 Similarity coefficient between 18 kinds of B． gelatinae
C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 C13 C14 C15 C16 C17 C18
C1 1． 00
C2 0． 80 1． 00
C3 0． 73 0． 80 1． 00
C4 0． 80 0． 60 0． 80 1． 00
C5 0． 73 0． 93 0． 86 0． 67 1． 00
C6 0． 67 0． 60 0． 53 0． 53 0． 67 1． 00
C7 0． 67 0． 73 0． 53 0． 60 0． 67 0． 86 1． 00
C8 0． 67 0． 73 0． 67 0． 73 0． 80 0． 87 0． 87 1． 00
C9 0． 73 0． 80 0． 73 0． 67 0． 86 0． 67 0． 67 0． 80 1． 00
C10 0． 66 0． 60 0． 67 0． 60 0． 67 0． 46 0． 33 0． 46 0． 53 1． 00
C11 0． 67 0． 46 0． 40 0． 60 0． 40 0． 60 0． 60 0． 60 0． 40 0． 46 1． 00
C12 0． 73 0． 53 0． 46 0． 53 0． 46 0． 53 0． 53 0． 53 0． 46 0． 53 0． 93 1． 00
C13 0． 73 0． 53 0． 46 0． 67 0． 47 0． 53 0． 53 0． 53 0． 46 0． 67 0． 80 0． 73 1． 00
C14 0． 60 0． 40 0． 33 0． 53 0． 33 0． 40 0． 40 0． 40 0． 33 0． 67 0． 67 0． 60 0． 87 1． 00
C15 0． 53 0． 46 0． 40 0． 60 0． 53 0． 60 0． 46 0． 60 0． 67 0． 73 0． 46 0． 40 0． 67 0． 67 1． 00
C16 0． 40 0． 46 0． 40 0． 33 0． 40 0． 20 0． 33 0． 33 0． 40 0． 60 0． 46 0． 40 0． 67 0． 80 0． 60 1． 00
C17 0． 67 0． 46 0． 40 0． 60 0． 40 0． 47 0． 47 0． 46 0． 53 0． 73 0． 60 0． 53 0． 80 0． 80 0． 86 0． 73 1． 00
C18 0． 60 0． 53 0． 46 0． 40 0． 46 0． 26 0． 40 0． 40 0． 60 0． 67 0． 53 0． 60 0． 73 0． 73 0． 67 0． 80 0． 80 1． 00
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为 0． 58;在养殖琼枝群体中，遗传相似性系数为
0． 53 ～ 0． 93，6 号、7 号两个样与 3 号样的遗传相
似性系数最低，都为 0． 53，5 号和 2 号样遗传相似
性最高，高达 0． 93，养殖群体的平均相似性系数
为 0． 78，平均遗传距离为 0． 22;在野生琼枝群体
中，遗传相似系数为 0． 4 ～ 0． 93，15、16 号两个样
与 12 号样遗传相似性最低，都为 0． 40，遗传相似
性最高的是 11 号和 12 号样，为 0． 93，野生群体平
均相似性系数为 0． 53，平均遗传距离为 0． 47。野
生琼枝群体的平均相似性系数低于养殖琼枝
群体。
2． 4 聚类分析
根据遗传相似性系数，利用 NTSYS 软件做出
聚类分析见图 3。
图 3 18 株琼枝的聚类分析树状图
Fig． 3 The cluster analysis of B． gelatinae
从聚类图可以看出，在相似系数为 0． 49 时，
18 株琼枝分成野生琼枝群体与养殖琼枝群体 2
大类;相似系数为 0． 56 时，野生琼枝群体分为 2
类，11 和 12 号野生琼枝群体聚为一类，其余野生
琼枝群体聚为一类;相似系数为 0． 66 时，养殖琼
枝群体分为 2 类，野生琼枝群体被分成 3 类;相似
系数为 0． 71 时，养殖群体分为 3 类，野生群体分
为 4 类;相似系数为 0． 73 时，野生琼枝群体被分
成 5 类，养殖琼枝群体聚类程度不变，仍为 3 类。
相似系数越高，野生琼枝群体的分类单元比养殖
群体的分类单元越细。说明野生琼枝群体之间的
遗传差异比养殖琼枝群体之间的差异要大。
3 讨论
在大型藻类研究中，关于养殖群体与野生群
体遗传多样性比较研究的报道不多。张全胜
等［14］用 AFLP研究了海带的遗传多样性，发现野
生群体出现明显的退化，李世国等［15］对海带的栽
培品种和自交品种的遗传研究发现栽培种的遗传
差异比自交种的遗传差异要低。主要是由于多代
连续的人工养殖造成了群体遗传多样性的下
降［16 － 17］。琼枝营养价值丰富，是重要的食用药用
藻类，也是生产卡拉胶的主要原料，其养殖业蓬勃
发展。但由于连续的人工养殖，造成种质不断退
化。实验利用 EST-SSR 技术对海南东北部海域
的野生琼枝群体与养殖琼枝群体的遗传多样性进
行比较，发现野生琼枝群体的遗传多样性比养殖
琼枝群体遗传群体多样性高，其结果与国内外相
关的研究结果一致。
本实验通过 EST-SSR 技术分析野生琼枝群
体与养殖琼枝群体的遗传差异，发现养殖群体的
遗传多样性比野生琼枝群体的多样性要低，EST-
SSR分析表明，野生群体的多态性条带及多态性
比例均高于养殖琼枝群体;相似性系数表及聚类
的结果也表明野生琼枝群体之间的遗传差异比养
殖琼枝群体之间的差异要大。造成这样的原因主
要是养殖环境条件均匀，养殖琼枝繁殖方式是单
一的无性营养繁殖，经过多代连续的养殖后，养殖
琼枝群体的遗传多样性降低，种质资源退化。与
此相反，生长在自然海区的野生琼枝，其海洋环境
条件复杂，繁殖有无性繁殖和有性繁殖两种途
径［18］，野生区的琼枝群体遗传差异大，其多样性
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9 期 胡吟胜，等:琼枝野生群体与养殖群体的 EST-SSR分析
高。因此，经过多代繁殖后，形成了养殖群体遗传
多样性降低，野生群体遗传多样性增加的格局。
本文得到杨文杰师兄前期的引物设计及实验
的指导，以及后续于淑楠师妹的鼎力相助，在此一
并感谢!
参考文献:
［1］ 夏邦美，张峻甫．中国海藻志［M］．北京:科学出版
社，1999:118 － 132．
［2］ 曾呈奎．中国经济海藻类［M］．北京:科学出版社，
1962:144 － 148．
［3］ Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda G D． Genome finger
printing by simple sequence repeats(SSR)anchored
polymerase chain reaction amplification ［ J］．
Genomics，1994，20(2) :176 － 183．
［4］ Fang D Q，Roose M L． Identification of closely related
citrus cultivars with inter simple sequence repeat
markers［J］． Theoretical and Applied Genetics，1997，
95(3) :408 － 471．
［5］ 王永丽，王梅芳，王爱民，等．基于近缘 EST-SSR 引
物的企鹅珍珠贝养殖和野生群体的遗传标记［J］．
广东海洋大学学报，2011，31(3) :7 － 11．
［6］ 张琼，李喜莲，薛淑雯，等．凡纳滨对虾 EST-SSR 标
记的筛选及遗传多态性检测［J］．海洋学报，2011，
33(1) :121 － 126．
［7］ 刘福利，段德麟． 海带群体遗传分析及叶片长、宽
性状 QTL 研究［D］． 北京:中国科学院研究生
院，2011．
［8］ 陈昌生，谢朝添，纪德华，等． 野生坛紫菜种群遗传
多样性的 ISSR 分析［J］． 水产学报，2008，32(5) :
717 － 724．
［9］ 孙雪，张学成，茅云翔，等．几种江蓠属海藻的 ISSR
标记分析［J］．高技术通讯，2003，13(9) :89 － 93．
［10］ 李文红，姚建亭，王继成，等． 龙须菜选育品系及其
野生型的 ISSR指纹分析［J］．海洋与湖沼，2005，36
(3) :241 － 247．
［11］ 赵素芬，何培民． 长心卡帕藻 ISSR-PCR 反应体系
的正交优化研究［J］．中国生物工程杂志，2008，28
(6) :163 － 167．
［12］ Hu Z M，Zeng X Q，Wang A H． An efficient method
for DNA isolation from red algae［J］． Journal of
Applied Phycology，2004，16(3) :161 － 166．
［13］ 丁晓东，吕柳新．从顽拗植物荔枝中提取基因组技
术的研究［J］． 应用与环境生物学报，2006，6(2) :
142 － 145．
［14］ 张全胜，石媛媛，丛义周，等．我国引种海带和栽培
海带源配子体克隆的 AFLP 分析［J］． 中国海洋大
学学报:自然科学版，2008，38(3) :429 － 435．
［15］ 李世国，单体锋，侯和胜，等． 9 个海带栽培品种自
交系后代遗传多样性和亲缘关系的 AFLP 分系
［J］．中国水产科学，2009，16(2) :214 － 220．
［16］ Sunden S L F，Davis S K． Evaluation of genetic
variation in a domestic population of Penaeus
vannamei(Boone) :a comparison with three natural
populations［J］． Aquaculture，1991，97 (2 － 3) :
131 － 142．
［17］ Wolfus G M，Garcia D K，WarrenA A． Application of
the microsatellite technique for analyzing genetic
diversity in shrimp breeding programs ［ J］．
Aquaculture，1997，152(1 － 4) :35 － 47．
［18］ 匡梅，曾呈奎，夏邦美． 中国麒麟菜族的分类研究
［J］．海洋科学集刊，1999，41:168 － 236．
7131
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水 产 学 报 37 卷
EST-SSR analysis of wild and farmed Betaphycus gelatinum
HU Yinsheng1，DUAN Zelin2，HUANG Bo1* ，YU Shunan1，WANG Ting3
(1． Ocean College，Hainan University，Haikou 570228，China;
2． School of Life Sciences，East China Normal University，Shanghai 200241，China;
3． Institute of Oceanology，Chinese Academy of Sciences，Qingdao 266071，China)
Abstract:EST-SSR was used to detect the hereditary difference in wild and cultured populations of the
Betaphycus gelatinae，the result showed that nine individuals from each population were used of the 5 EST-
SSR primers amplified，a total of 195 reproducible loci ranging from 250 to 2 500 bp were amplified from all
the 18 individuals． The average percentages of polymorphic loci in wild and cultured populations were
74． 29% and 70% ． The intra-population genetic distance was 0． 46 in wild population and 0． 22 in cultured
population． The cluster analysis showed that 18 individuals were clustered into two groups base on 0． 49 of
GS;wild populations were divided into 3 branches and cultured populations were divided into 2 branches
base on 0． 66;wild populations were divided into 5 branches and cultured populations were divided into 3
branches base on 0． 73． The higher the value，the more branches the wild populations have． The research
shows that genetic diversity of wild populations ampler than cultured
Key words:Betaphycus gelatinae;EST-SSR;wild;farmed
Corresponding author:HUANG Bo． E-mail:huangbohb1@ 163． com
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