全 文 ：网络出版时间:2013 － 12 － 20 06:19 网络出版地址:http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /34． 1086． Ｒ． 20131220． 0619． 022． html
三叶青黄酮对肺癌 A549细胞生长抑制与MAPKs通路关系的研究
钟良瑞1，魏克民2
(1．浙江中医药大学附属省立同德医院肿瘤科，浙江 杭州 310053;2．浙江省中医药研究院，浙江 杭州 310007)
doi:10． 3969 / j． issn． 1001 － 1978． 2014． 01． 022
文献标志码:A 文章编号:1001 － 1978(2014)01 － 0101 － 04
中国图书分类号:Ｒ284． 1;Ｒ329． 24;Ｒ329． 25;Ｒ734. 2;
Ｒ979. 1
摘要:目的 探讨三叶青黄酮对人非小细胞肺癌 A549 细胞
增殖抑制、凋亡作用及其机制。方法 采用 CCK-8 检测三
叶青黄酮对 A549 细胞增殖的抑制作用;荧光显微镜观察
Hoechst 33258 染色的细胞凋亡形态变化;流式细胞仪检测
细胞凋亡率;Western blot 法检测 p-p38、p-EＲK，p-JNK 蛋白
表达变化。结果 体外实验 CCK-8 检测显示三叶青黄酮各
浓度组作用不同时间点细胞的抑制率比较，差异有显著性;
呈剂量、时间依赖性。荧光显微镜观察经 Hoechst 33258 染
色的细胞凋亡形态变化，显示细胞减少，细胞核改变和凋亡
小体形成。流式细胞仪检测结果显示细胞凋亡率呈明显的
量 －效关系。Western blot法检测表明三叶青黄酮可以上调
A549 细胞中 p-p38 和 p-EＲK蛋白表达，且与浓度呈正相关。
结论 三叶青黄酮对人非小细胞肺癌 A549 细胞具有明显
抑制增殖，促进凋亡作用，其机制可能与激活 p38MAPK途径
和 EＲK途径有关。
关键词:三叶青;人肺癌细胞;凋亡;MAPKs 通路;p38MAPK;
EＲK
收稿日期:2013 － 07 － 19，修回日期:2013 － 09 － 08
基金项目:浙江省科技计划项目(No 2008F3036) ;浙江省科技厅科
研院所专项基金资助项目(No 2011F10068)
作者简介:钟良瑞(1982 －) ，男，博士，主治医师，研究方向:肿瘤学，
E-mail:julary@ 163． com;
魏克民(1938 －) ，男，研究员，教授，博士生导师，通讯作
者，Tel:0571-88849080，E-mail:wkmcyzy@ 163． com
肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，发病率逐年上
升，严重危害人类的健康;因此，开发安全有效的新
药具有重要意义。三叶青属于葡萄科崖爬藤属植物
(Tetrastigma hemsleyanum Dielset) ，具有清热解毒、
祛风化痰、活血止痛的作用［1］。近年来，三叶青的
抗肿瘤作用备受关注;前期研究表明三叶青具有明
显的抗肿瘤作用［2 － 3］。有研究表明［4］三叶青对肺癌
A549 细胞有抑制增殖和促凋亡作用，但其机制有待
进一步研究。因此，本实验探讨三叶青黄酮(radix
tetrastigma hemsleyani flavone，ＲTHF)对人肺癌 A549
细胞促凋亡及其作用机制具有可行性，为三叶青进
一步开发研究提供理论依据。
1 材料
1． 1 细胞株 A549 细胞株由浙江省医学科学院提
供，浙江中医药大学细胞实验室培养传代，实验所用
为生长状况良好的细胞。
1． 2 药品与试剂 三叶青:购自浙江省中医药研究
院，由浙江省中药新药研发重点实验室提取制备;ＲP-
MI 1640培养液:杭州吉诺生物医药技术有限公司;
Hyclone 胎牛血清;CCK-8:日本同仁化学研究所;Ho-
echst 33258染色液:碧云天生物技术研究所;Annexin
V-FITC细胞凋亡检测试剂盒:南京凯基生物技术有
限公司;p-p38、p-EＲK、p-JNK:美国 CST公司。
1． 3 仪器 3111 型 CO2 细胞培养箱:美国 Thermo
公司;3001 型酶标仪:美国 Thermo 公司;IX71 型荧
光显微镜:日本 OLYMPUS 公司;流式细胞仪:美国
BD公司;蛋白印记检测系统:美国 Bio-Ｒad公司。
2 方法
2． 1 细胞培养 细胞培养液含 10%胎牛血清的
ＲPMI 1640 培养液，条件为 37℃、含 5% CO2 的培养
箱内。待细胞长至瓶底 80%左右，用胰酶消化，传
代，取对数生长期细胞用于实验。
2． 2 CCK-8 检测生长抑制率 取对数生长期的
A549 细胞，用 0． 25%胰酶消化，制备成 5 × 107·
L －1的细胞悬液，按每孔 100 μl 接种于 96 孔板，贴
壁后更换培养液并加不同浓度三叶青黄酮(0、0. 5、
1、5、10 g·L －1)分 5 组，每组 6 复孔;分别在 24、48、
72 h检测，450 nm处测定各孔吸光度 A值。根据公
式:抑制率 /% =(1 －加药组 A 值 /对照组 A 值)×
100%，计算不同浓度三叶青黄酮对 A549 细胞的抑
制率。
2． 3 荧光显微镜观察细胞凋亡形态 A549 细胞经
不同浓度的三叶青黄酮(0、1、5、10 g·L －1)处理 48
h后，吸除培养液;加入 4%多聚甲醛固定 15 min，
PBS漂洗，加入 Hoechst 33258 避光染色 5 min;PBS
漂洗，荧光显微镜观察细胞核的形态。
2． 4 流式细胞仪分析细胞凋亡率 取对数生长期
A549 细胞，以 2 × 105 个 /孔细胞悬液接种于 6 孔
·101·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2014 Jan;30(1) :101 ～ 4
板;细胞贴壁后，加不同浓度三叶青黄酮(0、1、5、10
g·L －1)。作用 48 h 后收集细胞，PBS 洗涤，加入
500 μl的结合缓冲液 Bind Buffer 悬浮细胞，先后加
入 5 μl Annexin V-FITC和 5 μl PI，混匀后室温避光
孵育 15 min，上流式细胞仪检测分析，激发波长为
488 nm。
2． 5 Western blot 检测 MAPKs 通路相关蛋白的
影响 冰上操作，刮下细胞，移至 1. 5 ml 离心管。
每瓶细胞加 250 ～ 500 μl ＲIPA 裂解液，1200 r·
min －1离心 5 min，收获蛋白，测定蛋白浓度。用
SDS-PAGE电泳分离蛋白，将蛋白转移至 PVDF 膜
上。5%脱脂奶粉室温下封闭 1 h，一抗室温孵育 2
～3 h，二抗室温孵育 1 h。室温下，ECL混合液滴加
在 PVDF膜上，避光反应 3 ～ 5 min，放入蛋白印记检
测系统的暗箱内，在暗室中，曝光、显影、定影。以
β-actin作为内参进行分析。
2． 6 统计学方法 用 SPSS 13. 0 统计软件分析处
理。统计描述:计量资料数据用 珋x ± s 表示。组间比
较采用方差分析。
3 结果
3． 1 三叶青黄酮对 A549 细胞生长抑制率 不同
浓度三叶青黄酮作用于 A549 细胞 24、48、72 h 后，
CCK-8 检测显示三叶青黄酮对 A549 细胞有明显抑
制作用，随浓度的增加、时间延长，抑制率逐渐增高，
呈剂量、时间依赖性。见 Tab 1。
Tab 1 Inhibitory ratio of ＲTHF at different concentrations
on growth of A549(%，珋x ± s，n = 6)
Time
ＲTHF concentration /g·L － 1
0． 5 1 5 10
24 h 4． 56 ± 0． 69 9． 62 ± 1． 35 26． 00 ± 2． 30＊＊ 55． 77 ± 2． 30＊＊
48 h 9． 97 ± 1． 16* 24． 49 ± 1． 91＊＊ 44． 69 ± 1． 80＊＊ 67． 50 ± 1． 60＊＊
72 h 24． 17 ± 2． 04＊＊ 45． 34 ± 1． 77＊＊ 68． 14 ± 0． 78＊＊ 71． 57 ± 0． 92＊＊
* P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01 vs control group．
3． 2 三叶青黄酮对 A549 细胞凋亡形态的影响
不同浓度三叶青黄酮作用于 A549 细胞 48 h 后，经
Hoechst 33258 染色结果表明:对照组细胞呈均匀蓝
色荧光(Fig 1a) ;1 g·L －1低浓度组细胞核颜色稍亮
(Fig 1b) ;5 g·L －1中浓度组部分细胞核呈致密浓
染，颜色变亮(Fig 1c) ;10 g·L －1高浓度组细胞凋亡
最明显，完整细胞核结构少见 (Fig 1d)。随着药物
浓度增加，细胞凋亡形态逐渐明显。
3． 3 流式细胞仪检测三叶青黄酮对 A549 细胞凋
亡率 与空白对照组相比，经药物处理 48 h 后细胞
凋亡的比例均有明显升高，且呈现一定的剂量 －效
Fig 1 Microscopic images of A549 cultured with
ＲTHF for 48h(Hoechst 33258，200 ×)
a:Control group;b:1 g·L －1;c:5 g·L －1;d:10 g·L －1
Fig 2 Flow cytometric testing apoptosis of A549 cultured with
ＲTHF at different concentrations for 48h
＊＊P ＜ 0. 01 vs control group．
应关系。差异有统计学意义(P ＜ 0. 01)。见 Fig 2。
3． 4 不同浓度三叶青黄酮对 A549 细胞MAPKs通
路相关蛋白表达的影响 Western blot 结果显示，不
同浓度三叶青黄酮处理细胞后，随着药物浓度增加，
p-p38、p-EＲK 蛋白表达明显升高，p-JNK 蛋白表达
无明显变化。见 Fig 3。
4 讨论
本实验通过 CCK-8 证实:三叶青黄酮对人肺癌
细胞株 A549 的生长有明显抑制作用，且有浓度、时
间依赖性，其中三叶青黄酮浓度为 10 g·L －1、作用
72 h时，对细胞的抑制率最高。细胞凋亡是一种程
·201· 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2014 Jan;30(1)
Fig 3 Expression of apoptosis-related MAPKs signal pathway
proteins of A549 cultured with ＲTHF
a:Control group;b:1 g·L －1;c:5 g·L －1;d:10 g·L －1 ．
序性细胞死亡，通过分子水平进行调控，在肿瘤发生
发展中起重要作用。本实验通过荧光显微镜观察经
Hoechst 33258 染色后的 A549 细胞出现形态学改
变，凋亡细胞的细胞核呈致密浓染，颜色变亮，出现
增强的蓝色荧光，部分细胞核出现新月状亮蓝色荧
光边集于核膜下;高浓度时几乎无完整的细胞核结
构。流式分析 Annexin V-FITC和 PI双染，显示三叶
青黄酮可诱导肺癌 A549 细胞凋亡，且与浓度呈正
相关。诱导凋亡是多数抗肿瘤药物的主要机制，本
研究证实三叶青黄酮可以明显诱导肺癌 A549 细胞
的凋亡。
MAPK(mitogen-activated protein kinase)是丝裂
原活化蛋白激酶，MAPKs信号通路是真核细胞内重
要信号转导系统，调节细胞的增殖、分化、凋亡等过
程［5］。包含 3 条并行的 MAPKs 信号通路:①EＲK
信号转导通路(extracellular signal regulated protein
kinases)即 Ｒas-to-MAPK通路，包括 EＲKl 和 EＲK2，
是 MAPKs系统经典通路;②JNK /SAPK 信号转导通
路;③p38-MAPK通路。
EＲK 是被克隆并鉴别最早的 MAPK 家族成
员［6］，EＲK级联反应主要作用于细胞的增殖分化，
在癌症中常被激活。有研究发现［7］EＲK 通路在肺
腺癌形成早期阶段已被激活。JNK又被称为应激活
化蛋白激酶(SAPK) ，JNK信号传导途径在细胞应激
反应中起重要作用［8］。研究发现［9］JNK 途径在肺
癌细胞的生长和凋亡方面起着重要作用。p38 蛋白
激酶为 38 ku酪氨酸磷酸化蛋白激酶，p38 通路既可
影响肺癌的发生发展［10］，又可作为评估肺癌预后指
标，p38 表达阳性的患者预后较差。Mu 等［11］研究
发现二氢青蒿素诱导肺癌 PC-14 细胞凋亡的作用与
激活 p38 通路相关。本实验通过 Western blot 检测
结果显示与对照组相比，随三叶青黄酮浓度增加，p-
p38 和 p-EＲK蛋白表达水平升高，p-JNK 表达无明
显变化，提示三叶青黄酮可能通过激活 p38MAPK
途径和 EＲK途径诱导 A549 细胞凋亡。
综上所述，三叶青黄酮对肺癌 A549 细胞具有
抑制增殖和促进凋亡作用，通过增加 p-p38 和 p-
EＲK蛋白表达，激活 p38MAPK 途径和 EＲK 途径可
能是其凋亡机制之一。
参考文献:
［1］ 陈丽芸，郭素华．三叶青的化学成分及药理作用研究进展［J］．
浙江中医药大学学报，2012，36(12) :1368 － 70．
［1］ Chen L Y，Guo S H． Progress in studies of chemical composition
and pharmacological effects of tetrastigmatis hems leyani［J］． J
Zhejiang TCM Univ，2012，36(12) :1368 － 70．
［2］ 魏克民，丁刚强，浦锦宝，等．中草药三叶青抗肿瘤作用机制实
验研究和临床应用［J］．医学研究杂志，2007，36(11) :41 － 3．
［2］ Wei K M，Ding G Q，Pu J B，et al． Study on the anti-tumor
mechanism and the clinical application of tetrastigma hemsleyanum
Diels et． Gilg［J］． J Med Ｒes，2007，36 (11) :41 － 3．
［3］ 徐彩菊，吴平国，姚亚萍，等． 三叶青提取物对白血病 HL60 细
胞增殖抑制作用研究［J］．浙江预防医学，2011，23(4) :20 － 2．
［3］ Xu C J，Wu P G，Yao Y P，et al． A study on inhibitory effect of
extracts from tetrastigma hemsleyanum diels et． Gilg on prolifera-
tion of HL60 cell line［J］． Zhejiang Prev Med，2011，23 (4) :
20 － 2．
［4］ 曾 娟，周 婷，童雪晴，等．三叶青提取物诱导肺癌 A549 株
细胞凋亡的研究［J］．临床肺科杂志，2012，17(4) :682 － 3．
［4］ Zeng J，Zhou T，Tong X Q，et al． Influence of clover extract on
human colon cancer cellular A549 apoptosis［J］． J Clinic Pulm，
2012，17(4) :682 － 3．
［5］ 袁 辉，杨 胜，周文霞，张永祥． MAPK 级联信号通路与长时
程增强［J］．中国药理学通报，2006，22(7) :769 － 74．
［5］ Yuan H，Yang S，Zhou W X，Zhang Y X． MAPK cascade signa-
ling and long-term potentiation［J］． Chin Pharmacol Bull，2006，
22 (7) :769 － 74．
［6］ Boulton T G，Nye S H，Ｒobbins D J，et al． EＲKs:a family of
protein-serine / threonine kinases that are activated and tyrosine
phosphorylated in response to insulin and NGF［J］． Cell，1991，
65 (4) :663 － 75．
［7］ Lopez-Malpartida A V，Ludena M D，Varela G，Garcia PJ． Dif-
ferential ErbB receptor expression and intracellular signaling activi-
ty in lung adenocarcinomas and squamous cell carcinomas［J］．
Lung Cancer，2009，65 (1) :25 － 33．
［8］ 易 岚，谭 晖，吉晓霞，等． 二烯丙基二硫通过活性氧介导的
JNK信号通路诱导人白血病 K562 细胞凋亡［J］． 中国药理学
通报，2013，29(4) :473 － 7．
［8］ Yi L，Tan H，Ji X X，et al． Diallyl disulfide induces apoptosis of
human leukemia K562 cells through activation of JNK mediated by
reactive oxygen［J］． Chin Pharmacol Bull，2013，29(4) :473 －7．
［9］ An J，Gao Y，Wang J，et al． Flavokawain B induces apoptosis of
non-small cell lung cancer H460 cells via Bax-initiated mitochon-
drial and JNK pathway［J］． Biotechnol Lett，2012，34 (10) :
1781 － 8．
·301·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2014 Jan;30(1)
网络出版时间:2013 － 12 － 20 06:19 网络出版地址:http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /34． 1086． Ｒ． 20131220． 0619． 023． html
新型褪黑素受体激动剂 Neu-P11 激活
AMPK减轻心肌细胞缺氧 /复氧损伤
黄 靓1，2，王汉群2，张 弛1，高勇强2，向 琼2，王平平1，尹卫东1
(南华大学 1． 心血管疾病研究所、2． 外科学总论教研室，湖南 衡阳 421001)
doi:10． 3969 / j． issn． 1001 － 1978． 2014． 01． 023
文献标志码:A 文章编号:1001 － 1978(2014)01 － 0104 － 04
中国图书分类号:Ｒ322． 11;Ｒ329． 25;Ｒ845． 22;Ｒ977. 3;
Ｒ977. 1
摘要:目的 研究新型褪黑素受体激动剂 Neu-P11 对心肌细
胞缺氧 /复氧损伤的作用及分子机制。方法 实验分为对照
组、缺氧 /复氧模型组(H/Ｒ 组)、H/Ｒ + Neu-P11 组、H/Ｒ +
Compound C 组、H/Ｒ + Neu-P11 + Compound C 组。构建
收稿日期:2013 － 08 － 03，修回日期:2013 － 10 － 08
基金项目:湖南省教育厅资助科研项目 (No 11C1093，11C1095)
作者简介:黄 靓(1979 －)，女，博士生，讲师，研究方向:心肌缺血 /
再灌注损伤的保护机制，Tel:0734-8281367，E-mail:
slimslim0530@ 163． com;
尹卫东(1957 －)，男，博士，教授，博士生导师，通讯作者，
Tel:0734-8282554，E-mail:wdy20042004@ 126． com
H9c2 心肌细胞缺氧 /复氧模型，检测各组心肌细胞凋亡情
况，细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、SOD
活性及 MDA含量及心肌细胞 AMPK 的活性。结果 与缺
氧 /复氧组细胞相比，Neu-P11 预处理组细胞凋亡率明显减
少，CK、LDH、MDA含量明显下降，SOD 活性增加，心肌细胞
AMPK活性明显增高，而 AMPK 特异性抑制剂 Compound C
可以阻断 Neu-P11 的保护作用。结论 Neu-P11 能够减轻心
肌细胞缺氧 /复氧损伤，这一保护作用与激活 AMPK有关。
关键词:Neu-P11;腺苷酸活化蛋白激酶;心肌细胞;缺氧 /复
氧损伤;腺苷酸活化蛋白激酶;细胞凋亡;褪黑素
褪黑素(melatonin，MT)是一种主要由松果体分
泌的吲哚类神经内分泌激素。研究发现［1］，褪黑素
对心肌缺血 /再灌注(ischemia / reperfusion，I /Ｒ)损伤
［10］ Heasley L E，Winn Ｒ A． Analysis of Wnt7a-stimulated JNK activity
and c-Jun phosphorylation in non-small cell lung cancer cells［J］．
Methods Mol Biol，2008，468:187 － 96．
［11］ Mu D，Zhang W，Chu D，et al． The role of calcium，p38 MAPK in
dihydroartemisinin-induced apoptosis of lung cancer PC-14 cells
［J］． Cancer Chemother Pharmacol，2008，61 (4):639 － 45．
Ｒadix tetrastigma hemsleyani flavone suppresses human lung carcinoma
A549 cell by regulating MAPKs pathway
ZHONG Liang-rui1，WEI Ke-min2
(1． Dept Oncology，Tongde Hospital of Zhejiang Province，Zhejiang University of Traditional Chinese
Medicine，Hangzhou 310053，China;2． Zhejiang Academy of Traditional Chinese Medicine，Hangzhou 310007，China)
Abstract:Aim To study the effect of Ｒadix tetrastig-
ma hemsleyani flavone (ＲTHF)on the growth and ap-
optosis of human lung carcinoma A549 cells as well as
its mechanisms． Methods A549 cells were treated
with ＲTHF at different concentrations for different time
in vitro，and the proliferation of A549 cell was detected
by cell counting Kit-8 assay． Hoechst 33258 methods
and Flow cytometry were adopted to determine cell ap-
optosis． Expression of apoptosis-related MAPKs signal
pathway proteins was detected by Western blot． Ｒe-
sults CCK-8 showed that ＲTHF had obvious anti-pro-
liferation effect on A549 cells in a dose- and time-de-
pendent manner． Microscope found typical manifesta-
tions of cell apoptosis，and flow cytometric testing re-
sults showed that the treatment of apoptosis was signifi-
cantly higher than the proportion in the control group
(P ＜ 0. 01)． The protein expression of p-p38 and p-
EＲK were up-regulated significantly and that of p-JNK
was little change in ＲTHF group when compared with
the control group． Conclusion ＲTHF exerts anti-
growth and apoptosis activity against human lung canc-
er A549 cells，which may be associated with the up-
regulation of MAPKs pathway proteins，the p-p38 and
p-EＲK．
Key words:Ｒadix tetrastigma hemsleyani flavone
(ＲTHF); human lung carcinoma cell; apoptosis;
MAPKs signal pathway;p38MAPK;EＲK
·401· 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2014 Jan;30(1):104 ～ 7