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收稿日期:2015-01-19; 修订日期:2015-06-08
基金项目:浙江省丽水市科技合作项目(No． 20120304);
浙江省丽水市重点科技创新团队建设(No． 2012CXTD11)
作者简介:朱 波(1986-)，男(汉族)，浙江缙云人，浙江中医药大学博士
研究生，硕士学位，主要从事中药材育种、化学分析与分子鉴定工作．
* 通讯作者简介:华金渭(1968-)，男(汉族)，浙江遂昌人，丽水市农业科
学研究院研究员，学士学位，主要从事中药材栽培、育种工作．
三叶青基因组 DNA提取与 ISSＲ体系构建
朱 波1，2，华金渭1* ，雷 珍3，刘 昆1，吉庆勇1，齐 川4
(1．丽水市农业科学研究院，浙江 丽水 323000; 2．浙江中医药大学 药学院，浙江 杭州 310053;
3．丽水市科学技术协会，浙江 丽水 323000; 4．丽水市中药材产业发展中心，浙江 丽水 323000)
摘要:目的 构建三叶青 ISSＲ反应体系，为三叶青种质资源遗传多样性分析、品种选育与分子鉴定奠定基础。方法 用常
规 CTAB法、SDS法、改良 CTAB法、试剂盒法提取三叶青叶片基因组 DNA，采用正交设计试验 L12(3
4)，在 4 个主要因素
的 3 个水平上进行 ISSＲ体系构建，用 12 个不同种源三叶青样品验证体系稳定性。结果 改良 CTAB 法提取的三叶青叶
片基因组 DNA质量最好，纯度高，试剂盒法次之，常规 CTAB法与 SDS法所提 DNA质量较差。构建的 ISSＲ 最佳反应体
系为:20μl反应体系中，Taq 酶用量 0． 5U，模版 DNA20ng，dNTPs0． 20mmol /L，引物 0． 4μmol /L，2μl 10 × Buffer 缓冲液
(Mg2 +浓度 1． 5mmol /L)。结论 采用正交设计方法构建的三叶青 ISSＲ体系经检验，稳定可靠，可用于三叶青种质资源遗
传分析。
关键词:三叶青; DNA; ISSＲ; 体系构建
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2015． 09． 076
中图分类号:Ｒ93． 1． 71;Q943． 2 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2015)09-2242-03
三叶青是民间常用珍稀中药材，又名金线吊葫芦、石老鼠、蛇
附子，系葡萄科崖爬藤属植物三叶崖爬藤 Tetrastigma hemsleya-
num Diels et Gilg的块根。原植物主要分布于我国浙江、江西、福
建、广西、重庆、湖北、湖南、四川、广东、贵州等地，块根或全草入
药，具有清热解毒、祛风化痰、抗炎消肿、活血化瘀、抗肿瘤等功
效，内服可防治各类肿瘤，治疗小儿高热惊厥、痢疾、支气管炎、肺
炎、咽喉炎、肝炎与病毒性脑膜炎等，外敷可治疗毒蛇咬伤、扁桃
体炎、蜂窝织炎、跌打损伤等［1 ～ 3］。目前三叶青的研究报道主要
集中于生药学、组织培养、化学成分与药理等研究［4 ～ 8］，而三叶青
分子水平研究鲜有报道。
ISSＲ(inter － simple sequence repeat)分子标记即微卫星间
DNA多态性，是由 Zietkiewicz 等［9］于 1994 年提出创建的分子标
记技术，与 ＲFLP和 ＲAPD等其他 DNA 检测技术相比，ISSＲ分子
标记技术根据植物广泛存在简单重复序列的特点，利用在植物基
因组中常出现的简单重复序列本身设计引物，无需预先克隆和测
序，通常为显性标记，呈孟德尔式遗传，具有操作简单，试验成本
低，多态性丰富与稳定性较高的特点，已广泛应用于种质资源鉴
定、基因定位、遗传多样性分析和遗传图谱的构建等［10 ～ 13］。本研
究以三叶青新鲜叶片为试材，就三叶青基因组 DNA的提取与 IS-
SＲ分子标记系统的构建进行了探索，为三叶青遗传多样性评价、
分子辅助育种工作的开展奠定了基础。
1 材料与仪器
1． 1 材料 2012 年 4 月至 6 月，收集浙江、江西、福建、广西、贵州
等省区三叶青野生种质资源 12 份，全部栽培于浙江省丽水市农
业科学研究院中药材种质资源圃，原植物由浙江农林大学斯金平
教授鉴定为葡萄科植物三叶崖爬藤 Tetrastigma hemsleyanum，
2014 年 6 月，选取三叶青新鲜叶片，洗净晾干，待用。
1． 2 仪器与试剂 5424Ｒ 型高速离心机(德国 Eppendorf 公司)，
nexus SX1 型 PCＲ扩增仪(德国 Eppendorf 公司)，Milli － Q Aca-
demic型超纯水仪(美国 Millipore公司)，BIO － BEST凝胶成像系
统(美国 SIM公司)，SpectraMax PLUS384 型连续波长酶标仪(美
国 MD公司)，DYY －8C型电泳仪(北京六一仪器厂)，AＲ2140 型
分析天平(上海梅特勒 －托利多仪器有限公司)，HH － 4 型数显
恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)，FM50 型制冰机(北京长
流科学仪器公司)，GＲ60DA型自动压力蒸气灭菌锅(厦门致微仪
器有限公司)，DZG － 6050 型真空干燥箱(上海森信实验仪器有
限公司)。
·2422·
时珍国医国药 2015 年第 26 卷第 9 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2015 VOL． 26 NO． 9
十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷基硫酸钠(SDS)、乙
二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、三羟甲基
氨基甲烷(Tris － base)、β －巯基乙醇、硼酸、氯仿、无水乙醇、异
丙醇、氯化钠、琼脂糖、异硫氰酸胍、异戊醇、浓盐酸、DNA Marker、
Taq聚合酶、dNTPs等试剂购自天根生化科技(北京)有限公司与
杭州木木生物科技有限公司，SK8231 试剂盒购自生工生物工程
(上海)有限公司，ISSＲ 引物购自美国 Invitrogen 公司，此次试验
选用引物 xp14 与 p23，序列分别为 5 ＇ － AGGAGGAGGAGGAG-
GAGG －3＇，5＇－ CTCTCTCTCTCTCTCTAGA －3＇。
2 方法
2． 1 基因组 DNA提取 采用 CTAB法、SDS法、改良 CTAB法、试
剂盒法提取三叶青叶片基因组 DNA，常规 CTAB 法与 SDS 法参
照文献［14］。改良 CTAB 法:①将 1ml CTAB 提取液［2% CTAB，
2% PVP，100mM Tris － HCl(pH8． 0)，25mM EDTA，2． 0M NaCl］加
入到 2ml离心管中，65℃水浴 30min 预热;②预热期间，取 1 ～ 2g
样品置于研钵中，加入适量 PVP，液氮中研磨至粉末;③将适量粉
末迅速转入盛有 1． 2ml TNE(100mM Tris － HCl pH 8． 0，20mM
EDTA，0． 25M NaCl，2% β －巯基乙醇)的离心管中，充分震荡混
匀，65℃水浴 10min，期间摇晃 2 次，室温 10000r /min离心 10min，
去上清;④加入预热好的 CTAB 提取液 1ml，混匀 65℃ 水浴
40min，期间颠倒混匀 3 ～ 5 次，12000r /min离心 10min;⑤取上清，
加入等体积氯仿 － 异戊醇(V∶ V = 24 ∶ 1)，充分颠倒混匀，
10000r /min离心 10min，取上清，重复 1 次;⑥加入等体积异丙
醇，轻缓颠倒混匀，－ 20℃ 冰箱放置 30min，12000r /min 离心
10min，弃上清;⑦加入 1ml 70%乙醇漂洗 2 次;⑧室温下微干，加
入 30 ～ 50μl TE 缓冲液;⑨加入终浓度为 20μg /ml 的 ＲNaseA，
37℃水浴 30min。
试剂盒法:①取 50 ～ 100mg 新鲜叶片组织液氮中研磨成粉
末，转移至 1． 5ml离心管中;②加入 400μl Buffer PCL，8μl β －巯
基乙醇，震荡混匀，65℃水浴 45min;③加入 200μl Buffer PP，充分
颠倒混匀，－ 20℃冰箱放置 5min;④室温 10000r /min 离心 5min，
将上清转移到新的 1． 5ml 离心管中;⑤加入 500μl 氯仿，颠倒混
匀，12000r /min离心 5min，取上清;⑥加入等体积异丙醇，颠倒混
匀 5 ～ 8 次，室温放置 2 ～ 3min，室温 10000r /min 离心 5min，弃上
清;⑦加入 1ml 75%乙醇，颠倒漂洗 1 ～ 3min，10000r /min 离心
2min，弃上清，重复 1 次;⑧开盖室温倒置 5 ～ 10min 至残留的乙
醇完全挥发;⑨得到的 DNA用 50 ～ 100 μl TE Buffer溶解。
2． 2 ISSＲ反应体系的构建 试验设计以 20μl 反应体积为基础，
共设计 Taq聚合酶、DNA模版、dNTP、引物共 4 个因素，采用正交
设计 L12(3
4)在 3 个水平上进行试验(表 1)。PCＲ 扩增程序为:
94℃4min;94℃变性 30s，45℃复性 45s，72℃延伸 2min，35 个循
环;72℃延伸 7min，4℃保存。
2． 3 产物的检测 用连续波长酶标仪检测 DNA 纯度，DNA 模版
与 ISSＲ反应产物用 1． 5% ～ 2． 0%琼脂糖凝胶，80 ～ 150V 电泳
30 ～ 60min，溴化乙锭染色 15min，凝胶成像系统观察照相。
3 结果
3． 1 三叶青基因组 DNA 提取方法比较 采用常规 CTAB 法与
SDS法得到的三叶青叶片基因组 DNA 纯度低，OD260 /OD280值分
别为 1． 468 与 1． 502，SDS 法所得 DNA 泳道点样孔荧光较强，表
明 CTAB法与 SDS法提取的 DNA 残留蛋白质或多糖等杂质，电
泳图显示 3 个样品中只有 2 个样品有条带，DNA 提取重复性较
低。试剂盒法所提 DNA虽然纯度较高，但是 DNA提取重复性稍
低(12 泳道条带弱)，相比之下用改良 CTAB 法所提 DNA 纯度
高，OD260 /OD280达到了 1． 954，电泳图显示所得 DNA 条带清晰，
杂质少，详见表 2，图 1。结果表明，用改良 CTAB 法所提三叶青
叶片基因组 DNA纯度较高，重复性好，可用于下一步 PCＲ扩增。
表 1 ISSＲ反应体系正交试验设计
编号
Taq聚合酶
/U·20μl － 1
模版 DNA
/ng·20μl － 1
dNTPs
/mmol·L －1
引物
/μmol·L －1
1 0． 5 20 0． 15 0． 3
2 0． 5 40 0． 20 0． 4
3 0． 5 60 0． 25 0． 5
4 1． 0 20 0． 15 0． 3
5 1． 0 40 0． 20 0． 4
6 1． 0 60 0． 25 0． 5
7 1． 5 20 0． 15 0． 3
8 1． 5 40 0． 20 0． 4
9 1． 5 60 0． 25 0． 5
10 2． 0 20 0． 15 0． 3
11 2． 0 40 0． 20 0． 4
12 2． 0 60 0． 25 0． 5
表 2 DNA质量检测结果
提取方法 OD260 /OD280 浓度 /ng·μl － 1
CTAB法 1． 468 1405
SDS法 1． 502 1372
改良 CTAB法 1． 954 866
试剂盒法 1． 806 792
3． 2 三叶青 ISSＲ 体系的构建 ISSＲ 反应体系中 Taq 聚合酶、
DNA模版、引物、dNTPs对扩增结果都有影响(图 2)。如图中显
示泳道 5，11，12 扩增条带较少，有拖尾，酶用量过高时易出现条
带不清晰，酶用量在 0． 5U 时所得条带虽然没有高酶用量时亮，
但是条带较清晰，无拖尾，效果较好。dNTPs 是 PCＲ 反应的底
物，反应体系中 dNTPs的浓度直接影响产物的量，过低则产物不
足，过高又会抑制 Taq聚合酶的活性，无法得到预期效果。引物
浓度也至关重要，浓度太低会导致扩增不完全，过高则容易生成
引物二聚体，影响产物质量。本试验中，10 × Buffer 缓冲液(含
Mg2 +)用量根据酶用量而定。如图，2 号泳道扩增产物条带清晰，
无拖尾，效果最好，其他处理效果略差。结果显示，三叶青 ISSＲ
最佳反应体系为:20μl 反应体系中，Taq 聚合酶用量 0． 5U，模版
DNA 20ng，dNTPs 0． 20mmol /L，引物 0． 4μmol /L，2μl 10 × Buffer
缓冲液(Mg2 +浓度 1． 5mmol /L)。
1 ～ 3 为 CTAB法，4 ～ 6 为 SDS法，
7 ～ 9 为改良 CTAB法，10 ～ 12 为试剂盒法
图 1 三叶青不同 DNA提取方法比较
3． 3 不同种源三叶青 ISSＲ 扩增 在已构建好的 ISSＲ 反应体系
的基础上，用 p23 引物对 12 个不同种源三叶青进行 ISSＲ 扩增，
结果如图 3 所示。不同种源三叶青样品均能扩增出清晰、稳定的
条带，表明构建的反应体系适合三叶青种质资源 ISSＲ 分析。不
同种源三叶青 ISSＲ 扩增条带存在多态性差异，p23 共扩增出条
带 10 条，其中多态性条带 3 条，多态性较一般，如需进一步较准
确地评价三叶青进行遗传多样性，应筛选出更多引物进行扩增，
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2015 VOL． 26 NO． 9 时珍国医国药 2015 年第 26 卷第 9 期
得到更多的多态性条带进行分析。
1 ～ 12 对应表 1 正交设计的编号
图 2 引物 xp14 的三叶青 ISSＲ正交试验电泳图
图 3 引物 p23 对 12 个不同种源三叶青的扩增条带
(箭头指向多态性位点)
4 结论与讨论
高质量、高纯度的 DNA 是 ISSＲ 分子标记反应扩增出稳定、
清晰条带的关键性因素，三叶青为多年生植物，叶片中含有较多
次生代谢产物，加大了基因组 DNA提取的难度。采用常规 CTAB
与 SDS法提取三叶青叶片基因组 DNA，无法有效地去除蛋白质、
多糖等杂质，得到 DNA纯度差，重复性低。用改良的 CTAB法提
取 DNA，先用 TNE缓冲液去除多糖类杂质，TNE中的 β －巯基乙
醇是还原剂，可有效抑制多酚及其他物质的氧化，避免褐变。在
研磨与 CTAB缓冲液中加入了 PVP，PVP能与多酚形成一种络合
物，可有效去除多酚类杂质。用改良的 CTAB法提取的三叶青叶
片基因组 DNA质量好，纯度高，条带清晰，试验重复性好，较稳
定，能满足 ISSＲ分子反应的要求。ISSＲ是基于 PCＲ反应的分子
标记技术，PCＲ扩增结果受反应体系各因素条件变化的影响。在
进行 PCＲ 扩增反应时，引物与模板结合后在 Taq 酶作用下进行
延伸，Taq 酶浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则使合成
产物量减少。Mg2 + 作为Taq酶的辅助因子，不仅影响Taq酶活
性及合成的稳定性，还能与反应液中的 dNTP、模板 DNA 及引物
结合，影响引物与模板的结合效率、模板与 PCＲ 产物的解链温度
以及产物的特异性和引物二聚体的形成［15，16］。本试验在模板
DNA质量得到保证的情况下，进行正交试验设计构建三叶青 IS-
SＲ分子标记体系，最终最佳反应体系为:20μl 反应体系中，Taq
酶用量 0． 5U，模版 DNA20ng，dNTPs0． 20mmol /L，引物 0． 4μmol /
L，2μl 10 × Buffer 缓冲液(Mg2 +浓度 1． 5mmol /L)。该体系用 12
份不同种源三叶青样品进行检验，证明体系稳定可靠，可以继续
收集全国其他三叶青主产区种质资源进行 ISSＲ 分析，为三叶青
遗传多样性分析及遗传图谱的构建奠定了基础。
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