全 文 ：书第３４卷第４期
２０１５年８月
中 国 海 洋 药 物
ＣＨＩＮＥＳＥ　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＭＡＲＩＮＥ　ＤＲＵＧＳ
Ｖｏｌ．３４　Ｎｏ．４
Ａｕｇｕｓｔ，２０１５
琼枝麒麟菜多糖抗单纯疱疹病毒２型
活性研究△
＊
邹沐平＃１，２，董栋＃１，３，王怀玲１，刘秋英１，蒲含林２，王一飞１，３＊
（１．暨南大学，生命科学技术学院，生物医药研究开发基地；广东 广州５１０６３２；
２．暨南大学，生命科学技术学院，生物工程研究所；广东 广州５１０６３２；
３．广州暨南生物医药开发研究基地有限公司；广东 广州５１０６３２）
摘　要：目的 探讨琼枝麒麟菜多糖（ＥＧＰ）抗单纯疱疹病毒２型（ＨＳＶ－２）的活性及其作用机制。方法 联合采
用观察细胞病变效应（ＣＰＥ）法和 ＭＴＴ法评价ＥＧＰ对Ｖｅｒｏ细胞的毒性。空斑减数实验检测ＥＧＰ对 ＨＳＶ－２
的综合抗病毒活性、直接灭活作用、吸附及进入细胞过程的抑制作用、和感染后的治疗作用。Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ
（ＲＴ－ＰＣＲ）检测ＥＧＰ对ＨＳＶ－２基因表达及其ＤＮＡ复制的影响。结果ＥＧＰ浓度低于１２５μｇ／ｍＬ对Ｖｅｒｏ细
胞无毒性。ＥＧＰ具有较强的综合抗病毒活性，在实验所用最低浓度（１．９５μｇ／ｍＬ）下，ＥＧＰ可达到８０％的
ＨＳＶ－２病毒抑制率。ＥＧＰ对 ＨＳＶ－２具有很强的直接灭活和抑制吸附作用，治疗作用相对较弱。同时，ＥＧＰ
可以下调 ＨＳＶ－２早期基因ＵＬ５２和晚期基因ＵＬ２７的表达，但是对病毒的ＤＮＡ复制过程无影响。结论 麒
麟菜多糖具有显著的抗 ＨＳＶ－２感染活性，主要通过干扰病毒对细胞的粘附、侵入而发挥作用。
关键词：琼枝麒麟菜多糖；ＨＳＶ－２；抗病毒
中图分类号：Ｒ９６５　　　文献标志码：Ａ　　　文章编号：１００２－３４６１（２０１５）０４－０１３－０６
Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｔｈｅ　ａｎｔｉ－ｈｅｒｐｅｓ　ｓｉｍｐｌｅｘ　ｖｉｒｕｓ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｅｕｃｈｅｕｍａ
ｇｅｌａｔｉｎａｅ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ
ＺＯＵ　Ｍｕ－ｐｉｎｇ＃１，２，ＤＯＮＧ　Ｄｏｎｇ＃１，３，ＷＡＮＧ　Ｈｕａｉ－ｌｉｎｇ１，ＬＩＵ　Ｑｉｕ－ｙｉｎｇ１，ＰＵ　Ｈａｎ－ｌｉｎ２，ＷＡＮＧ　Ｙｉ－ｆｅｉ　１，３＊
（１．Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　Ｊｉ＇ｎａｎ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０６３２，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　Ｊｉ＇ｎａｎ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０６３２，Ｃｈｉｎａ；
３．Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ（Ｊｉ＇ｎａｎ）Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｃｅｎｔｅｒ　Ｃｏ．Ｌｔｄ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０６３２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｅｕｃｈｅｕｍａ　ｇｅｌａｔｉｎａｅ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＥＧＰ）ｏｎ　ｔｈｅ　ｒｅｐｌｉ－
ｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｒｐｅｓ　ｓｉｍｐｌｅｘ　ｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　２（ＨＳＶ－２）．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｍａｘｉｍｕｍ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＥＧＰ
ｔｏ　Ｖｅｒｏ　ｗａｓ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ　ｂｙ　ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ（ＣＰＥ）ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ＭＴＴ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ　ａｎｔｉｖｉｒａｌ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ
ＥＧＰ　ｗｅｒｅ　ｖｅｒｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｐｌａｑｕｅ　ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ　ｖｉａ　ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｓｕｃｈ　ａｓ　ｄｉｒｅｃｔ　ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ａｄ－
ｓｏｒｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｖｉｒｕｃｉｄａｌ　ｅｆｆｅｃｔ．Ｔｈｅ　ｖｉｒａｌ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｗａｓ　ａｌｓｏ　ｍｏｎｉｔｏｒｅｄ　ｂｙ
ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｎｏ　ｔｏｘｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ，ｗｈｅｎ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＥＧＰ　ｋｅｐｔ
ｌｏｗｅｒ　ｔｈａｎ　１２５μｇ／ｍＬ　ｉｎ　Ｖｅｒｏ　ｃｅｌｓ．ＥＧＰ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　８０％ｏｆ　ＨＳＶ－２ａｔ　１．９５μｇ／ｍＬ，ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｔｈｅ　ｌｏｗ－
ｅｓｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＥＧＰ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．ＥＧＰ　ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ　ｅａｒｌｙ　ＨＳＶ－２ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｄｉｒｅｃｔ－
ｌｙ　ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ　ｏｆ　ｖｉｒｕｓ　ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ．Ｂｕｔ　ＥＧＰ　ｃｏｕｌｄｎ’ｔ　ｐｒｅｖｅｎｔ　ｖｉｒａｌ　ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ．ＲＴ－
△基金项目：广东省海洋渔业科技推广专项科技攻关与研发项目（Ａ２０１３０１Ｃ０６）资助
　作者简介：邹沐平（１９９０－），女，硕士研究生；＃共同第一作者：董栋（１９８３－），女，博士后。
＊通讯作者：王一飞，男，教授。研究方向：生物医药。Ｅ－ｍａｉｌ：ｔｗａｎｇｙｆ＠ｊｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ，Ｔｅｌ：＋８６－０２０－８５２２３４２６
　　收稿日期：２０１４－１２－２４
DOI:10.13400/j.cnki.cjmd.2015.04.003
１４　 中　国　海　洋　药　物 ３４卷
ＰＣＲ　ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ＥＧＰ　ａｌｓｏ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ｔｈｅ　ＲＮＡ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ＨＳＶ－２ｅａｒｌｙ　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｌａｔｅ　ｇｅｎｅ，ｂｕｔ
ＥＧＰ　ｄｉｄｎ＇ｔ　ｃａｕｓｅ　ａｎｙ　ｃｈａｎｇｅ　ｉｎ　ｖｉｒａｌ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＥＧＰ　ｓｈｏｗｅｄ　ｈｉｇｈ　ａｎｔｉ－ＨＳＶ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｂｕｔ
ｌｏｗ　ｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｗｈｉｃｈ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｉｔ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ａ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｖｉｒａｌ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｅｕｃｈｅｕｍａ　ｇｅｌａｔｉｏｎａｅ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ＨＳＶ－２；ａｎｔｉｖｉｒａｌ
　　麒麟菜属于红藻门（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ），杉藻目
（Ｇｉｇａｙｔｉｎａｌｅｓ），红翎菜科（Ｓｏｌｉｎａｃｅａｅ），麒麟菜属
（Ｅｕｃｈｅｕｍａ），为热带和亚热带海藻［１］。其中琼枝
麒麟菜在中国海南岛有大规模的人工培养，来源
十分丰富。研究表明麒麟菜多糖具有多种生理活
性，如琼枝麒麟菜对受辐射损伤的小鼠腹腔巨噬
细胞具有一定的保护作用［２］，能够减少衰老模型
小鼠的自由基［３］，硒化麒麟菜多糖能够促进肿瘤
细胞凋亡［４］等。也有文献报道麒麟菜多糖具有抗
疱疹病毒、科萨奇病毒等活性［１］，但具体作用机理
尚未明确。本文通过经典的ＭＴＴ法、空斑减数实
验［５］和 Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ［６］研究了琼枝麒麟菜多糖
（ＥＧＰ）对单纯疱疹病毒２型的抗病毒活性，同时
初步研究了ＥＧＰ的潜在抗 ＨＳＶ－２作用机制，为
ＥＧＰ的进一步开发奠定了一定的理论基础。
１　材料与方法
１．１　实验材料
１．１．１　病毒和细胞
单纯疱疹２型（ＨＳＶ－２）及非洲绿猴肾细胞
（Ｖｅｒｏ）（ＡＴＣＣ　ＣＣＬＳ１）由本实验室保存。
１．１．２　试剂与器材
胎牛血清，杭州四季青生物材料工程有限公
司；二甲基亚砜，广州化学试剂厂；ＤＭＥＭ 培养
基，Ｇｉｂｃｏ公司；培养箱，日本ＳＡＮＹＯ公司；９６孔
培养板，美国ＣＯＲＮＩＮＧ公司；倒置显微镜，德国
Ｌｅｉｃａ公司；超净工作台，苏州净化设备公司。
１．２　实验方法
１．２．１　病毒毒力测定［７］
接种密度为１．５×１０５／ｍＬ的Ｖｅｒｏ细胞于９６
孔细胞培养板，在恒温培养箱中培养１６～２０ｈ，
待细胞生长成单层后，吸弃培养基，用ＰＢＳ洗涤３
次，加入用维持液按１０倍递减稀释的病毒毒液
１００μＬ／孔，每个浓度设８个复孔，同时设正常细
胞对照。３７℃，５％ ＣＯ２温箱中培养３ｄ，在倒置
显微镜下观察并记录细胞形态变化（ＣＰＥ），细胞
无病变为－，病变０～２５％为＋，病变２５％～５０％
为＋＋，病变５０％～７５％为＋＋＋，病变７５％～
１００％为＋＋＋＋。根据观察结果用Ｋｒｂｅｒ公式
计算 ＴＣＩＤ５０。
１．２．２　细胞毒性实验
测定ＥＧＰ对 Ｖｅｒｏ细胞的细胞毒性，计算最
大无毒剂量（ＣＣ０）及半数有毒剂量（ＣＣ５０）。细胞
培养和铺板方法如１．２．１。待细胞长成单层后，吸
弃培养液，分别加入用维持液倍比稀释成不同浓
度的药液，每孔１００μＬ，各设６个复孔，同时设正
常细胞对照，其间置倒置显微镜下观察，采用
ＭＴＴ法测出药物的最大无毒剂量ＣＣ０及半数有
毒剂量ＣＣ５０。
１．２．３　ＥＧＰ的抗 ＨＳＶ－２活性实验
采用空斑法对ＥＧＰ抗 ＨＳＶ－２的综合活性进
行测定，计算半数抑制浓度（ＩＣ５０）［９］。将培养至对
数生长期的Ｖｅｒｏ细胞用ＤＭＥＭ生长液调至密度
为１．５×１０５／ｍＬ，加入２４孔板中，每孔０．５ｍＬ。
在恒温培养箱中培养１６～２０ｈ，待细胞生长成单
层后，吸弃培养基，用ＰＢＳ洗涤１次，将病毒稀释
液（１×ＴＣＩＤ５０）与不同浓度药物稀释液各１００μＬ
（起始浓度为１２５μｇ／ｍＬ）加入孔中，一共设６个
浓度，每个药物设３个复孔，同时设正常细胞组和
病毒对照组，３７ ℃、５％ＣＯ２培养，期间每隔
１５ｍｉｎ轻轻摇晃培养板使病毒吸附均匀，２ｈ后吸
弃病毒液，随后加入含相应药物浓度的覆盖液（维
持液＋０．５％羧甲基纤维素）５００μＬ孔，于３７℃、
５％ＣＯ２条件下培养７２ｈ，吸弃覆盖液，１０％甲醛
固定１０ｍｉｎ，１％结晶紫染色１５ｍｉｎ，冲洗干净平
板，晾干；统计空斑数，计算空斑抑制率。以药物
浓度为横坐标，以空斑抑制率为纵坐标作图，根据
空斑抑制率结果做出病毒对药物的敏感性曲线，
计算药物的半数抑制浓度（ＩＣ５０）。空斑抑制率＝
（病毒对照组空斑数－药物处理组空斑数）／病毒
对照组空斑数×１００％［１０］。
１．２．４　ＥＧＰ对 ＨＳＶ－２的直接灭活实验
细胞培养与铺板方法同１．２．３。将倍比稀释
的ＥＧＰ溶液（起始浓度为１２５μｇ／ｍＬ）与病毒稀
释液（１×ＴＣＩＤ５０）混合后在３７℃孵育２ｈ。待Ｖｅ－
ｒｏ细胞在２４孔板中长成单层，吸弃培养液，用
３期 邹沐平，等：琼枝麒麟菜多糖抗单纯疱疹病毒２型活性研究 １５　
ＰＢＳ洗１次，每孔加入混合液２００μＬ，一共设６个
浓度，每个浓度设３个复孔，同时设正常细胞组和
病毒对照组，３７℃、５％ ＣＯ２培养２ｈ，吸弃病毒
液，随后加入覆盖液（维持液＋０．５％羧甲基纤维
素）５００μＬ／孔，于３７℃、５％ ＣＯ２条件下培养７２
ｈ，吸弃覆盖液，１０％甲醛固定１０ｍｉｎ，１％结晶紫
染色１５ｍｉｎ，冲洗干净平板，晾干；统计空斑数，计
算空斑抑制率，方法同１．２．３［１０］。
１．２．５　ＥＧＰ对 ＨＳＶ－２感染后的治疗作用
细胞培养与铺板方法同１．２．３。待Ｖｅｒｏ细胞
在２４孔板中长成单层，吸弃培养液，用ＰＢＳ洗１
次，每孔加入１００μＬ病毒稀释液（１×ＴＣＩＤ５０），
３７℃、５％ＣＯ２孵育２ｈ，吸弃病毒液，随后加入含
相应药物浓度的覆盖液（维持液＋０．５％羧甲基纤
维素）５００μＬ／孔，于３７℃、５％ ＣＯ２条件下培养
７２ｈ，吸弃覆盖液，１０％甲醛固定１０ｍｉｎ，１％结晶
紫染色１５ｍｉｎ，冲洗干净平板，晾干；统计空斑数，
计算空斑抑制率，方法同１．２．３［１０］。
１．２．６　ＥＧＰ对 ＨＳＶ－２吸附过程的抑制作用
细胞培养与铺板方法同１．２．３。待Ｖｅｒｏ细胞
在２４孔板中长成单层，将培养板放在４℃预冷
１ｈ，吸弃培养液，用４℃预冷的ＰＢＳ洗１次，加入
病毒稀释液（１×ＴＣＩＤ５０）与倍比稀释的药物稀释
液各１００μＬ（起始浓度为１２５μｇ／ｍＬ），一共设６
个浓度，每个浓度设３个复孔，同时设正常细胞组
和病毒对照组，４℃孵育２ｈ，吸弃病毒液，用预冷
ＰＢＳ洗１次，随后加入含相应药物浓度的覆盖液
（维持液＋０．５％羧甲基纤维素）５００μＬ／孔，于
３７℃、５％ ＣＯ２条件下培养７２ｈ，吸弃覆盖液，
１０％甲醛固定１０ｍｉｎ，１％结晶紫染色１５ｍｉｎ，冲
洗干净平板，晾干；统计空斑数，计算空斑抑制率，
方法同１．２．３［１０］。
１．２．７　ＥＧＰ对 ＨＳＶ－２进入细胞过程的抑制作用
细胞培养与铺板方法同１．２．３。待Ｖｅｒｏ细胞
在２４孔板中长成单层，将培养板放在４℃预冷
１ｈ，吸弃培养液，用４℃预冷的ＰＢＳ洗１次，加入
病毒稀释液（１×ＴＣＩＤ５０）与倍比稀释的药物稀释
液各１００μＬ（起始浓度为１２５μｇ／ｍＬ），一共设６
个浓度，每个药物设３个复孔，同时设正常细胞组
和病毒对照组，４℃孵育２ｈ，吸弃病毒液，用预冷
ＰＢＳ洗１次，加入倍比稀释的药物稀释液１００μＬ
（起始浓度为１２５μｇ／ｍＬ），一共设６个浓度，每个
浓度设３个复孔，同时设正常细胞组和病毒对照
组，３７℃、５％ＣＯ２孵育１０ｍｉｎ，加入ｐＨ＝３．０的
ＰＢＳ　２００μＬ孵育１ｍｉｎ以灭活未吸附的病毒；加
入ｐＨ＝１１的ＰＢＳ　２００μＬ孵育１ｍｉｎ以中和ｐＨ
＝３．０的 ＰＢＳ；吸弃 ＰＢＳ缓冲液，加入覆盖液
５００μＬ／孔；随后置于３７℃、５％ ＣＯ２培养箱培养
７２ｈ后，吸弃覆盖液，用 １０ ％甲醛固定细胞
１５ｍｉｎ，１％结晶紫染色１５ｍｉｎ，冲洗干净平板，晾
干；统计空斑数，计算空斑抑制率，方法同１．２．３［１０］。
１．２．８　ＥＧＰ对 ＨＳＶ－２ＲＮＡ合成的影响
将培养至对数生长期的Ｖｅｒｏ细胞用ＤＭＥＭ
生长液调至密度为１．５×１０５／ｍＬ，加入１２孔板
中，每孔１ｍＬ。在恒温培养箱中培养１６～２０ｈ，
待细胞生长成单层后，吸弃培养基，用ＰＢＳ洗涤１
次，加入 ＨＳＶ－２（１００×ＴＣＩＤ５０）病毒稀释液，于
３７℃孵育２ｈ。后吸弃病毒液，用ＰＢＳ洗１次，加
入含ＥＧＰ（６２．５μｇ／ｍＬ）或阿昔洛韦（７．８１μｇ·
ｍＬ－１）的维持液，同时做未加药对照组。在３７℃、
５％ＣＯ２培养箱中培养３，６，９ｈ，后用Ｔｒｉｚｏｌ试剂
（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）提取总ＲＮＡ，测定ＲＮＡ浓度，取５００
ｎｇ　ＲＮＡ分子用ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ（ＴＡＫＡＲＡ）反转
录试剂盒进行反转录得到ｃＤＮＡ。用ＳｓｏＦａｓｔ　ＴＭ
ＥｖａＧｒｅｅｎ?Ｓｕｐｅｒｍｉｘ试剂盒（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）进行Ｒｅａｌ－
ｔｉｍｅ　ＰＣＲ测定ｃＤＮＡ中即刻早期基因（３ｈ．ｐ．ｉ
ＵＬ５４），早期基因（６ｈ．ｐ．ｉ　ＵＬ５２）和晚期基因
（９ｈ．ｐ．ｉ　ＵＬ２７）的相对表达量，实验过程参照试
剂盒说明书进行，每个反应体系为１０μＬ，包括
２μＬ　ｃＤＮＡ，２μＬ　Ｔａｑ酶，上下游引物各２μＬ以
及２μＬ三蒸水。反应条件为：９５℃５ｍｉｎ；９５℃
３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ；７２℃１０ｍｉｎ（第２～
５步循环３０次）。所用ＰＣＲ引物如下：ＵＬ５４（Ｆ：
５′－ＴＧＧ　ＣＧＧ　ＡＣＡ　ＴＴＡ　ＡＧＧ　ＡＣＡ　ＴＴＧ－３′Ｒ：
５′－ＴＧＧ　ＣＣＧ　ＴＣＡ　ＡＣＴ　ＣＧＣ　ＡＧＡ－３′）；ＵＬ５２
（Ｆ：５′－ＧＡＣ　ＣＧＡ　ＣＧＧ　ＧＴＧ　ＣＧＴ　ＴＡＴ　Ｔ－３′Ｒ：
５′－ＧＡＡ　ＧＧＡ　ＧＴＣ　ＧＣＣ　ＡＴＴ　ＴＡＧ　ＣＣ－３′）；
ＵＬ２７（Ｆ：５′－ＧＣＣ　ＴＴＣ　ＴＴＣ　ＧＣＣ　ＴＴＴ　ＣＧＣ－３′
Ｒ：５′－ＣＧＣ　ＴＣＧ　ＴＧＣ　ＣＣＴ　ＴＣＴ　ＴＣＴ　Ｔ－３′）［６］。
１．２．９　ＥＧＰ对 ＨＳＶ－２ＤＮＡ拷贝数的影响
细胞培养、铺板、病毒感染及药物处理过程同
１．２．８。病毒感染２０ｈ后用 ＮＵＩＱ－１柱式病毒
ＤＮＡ抽提试剂盒（生工生物）提取病毒基因组。
实验过程参照试剂盒说明书进行。用ＳｓｏＦａｓｔ　ＴＭ
ＥｖａＧｒｅｅｎ?Ｓｕｐｅｒｍｉｘ试剂盒（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）进行Ｒｅａｌ－
ｔｉｍｅ　ＰＣＲ检测所提病毒基因组中即刻早期基因
１６　 中　国　海　洋　药　物 ３４卷
ＵＬ４７的相对含量，从而间接反映起始病毒ＤＮＡ
模板的量。进行Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ反应过程中，每个
反应体系为１０μＬ，包括２μＬ　ＤＮＡ，２μＬ　Ｔａｑ酶，
上下游引物各２μＬ以及２μＬ三蒸水。反应条件
为：９５℃５ｍｉｎ；９５℃３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ；
７２℃１０ｍｉｎ（第２～５步循环３０次）。所用ＰＣＲ引
物如下：ＵＬ４７（Ｆ：５’－ＧＡＣＧＴＡ　ＣＧＣ　ＧＡＴ　ＧＡＧ
ＡＴＣ　ＡＡ －３’，Ｒ：５’－ＧＴＴ　ＡＣＣ　ＧＧＡ　ＴＴＡ　ＣＧＧ
ＧＧＡ　ＣＴ－３’）［６］。
２　结果
２．１　病毒滴度测定
通过倒置显微镜观察细胞病变情况，Ｒｅｅｄ－
ｍｕｅｎｃｈ方法计算 ＨＳＶ－２的ＴＣＩＤ５０为１０－５．５。
２．２　细胞毒性测定
ＭＴＴ结果显示，ＥＧＰ对 Ｖｅｒｏ细胞毒性极
低，当多糖浓度达到１　０００μｇ／ｍＬ时Ｖｅｒｏ细胞的
存活率可高达７３．１４％，当多糖浓度在１２５μｇ／ｍＬ
以下时细胞存活率都超过１００％（见图１），说明
１２５μｇ／ｍＬ以下为完全无毒浓度，且对细胞增殖
有一定促进作用。根据 ＭＴＴ结果计算出ＥＧＰ对
Ｖｅｒｏ细胞的半数有毒浓度（ＣＣ５０）为２３７ｍｇ／ｍＬ，
进一步说明ＥＧＰ对 Ｖｅｒｏ细胞毒性极低，是１种
非常安全的多糖。
图１　麒麟菜多糖对Ｖｅｒｏ细胞的毒性实验结果
Ｆｉｇ．１　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＥＧＰ　ｅｘａｍｉｎｅｄ　ｂｙ
ｔｈｅ　ＭＴＴ　ａｓｓａｙ
２．３　ＥＧＰ抗 ＨＳＶ－２的综合抗病毒活性
采用体外空斑减数实验来评价ＥＧＰ抗 ＨＳＶ－
２的综合抗病毒活性，从图２可以看到，ＥＧＰ可以
显著减少 ＨＳＶ－２感染所致的空斑数，在实验所用
的最低多糖浓度１．９５μｇ／ｍＬ下空斑抑制率可达
到７８．０５％（见图３），ＥＧＰ对 ＨＳＶ－２的半数抑制
浓度为０．６７５μｇ／ｍＬ，显示ＥＧＰ具有良好的抗单
纯疱疹病毒２型的活性。
图２　空斑结果：正常细胞（Ａ），ＨＳＶ－２（１×ＴＣＩＤ５０）感染后（Ｂ）和 ＨＳＶ－２（１×ＴＣＩＤ５０）＋ ＥＧＰ（３１．２５μｇ／ｍＬ）（Ｃ）
Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｐｌａｇｕｅ　ａｓｓａｙ：ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ（Ａ），ｃｅｌｓ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ＨＳＶ－２（１×ＴＣＩＤ５０）（Ｂ），
ｃｅｌｓ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ＨＳＶ－２（１×ＴＣＩＤ５０）ａｔ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｔｉｍｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＥＧＰ（３１．２５μｇ／ｍＬ）（Ｃ）
３期 邹沐平，等：琼枝麒麟菜多糖抗单纯疱疹病毒２型活性研究 １７　
图３　ＥＧＰ对 ＨＳＶ－２的综合抗病毒活性测定
Ｆｉｇ．３　Ａｎｔｉｖｉｒａｌ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＥＧＰ　ｔｅｓｔｅｄ　ｂｙ　ｐｌａｑｕｅ
ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ
２．４　ＥＧＰ对抗 ＨＳＶ－２作用机制研究
２．４．１　ＥＧＰ对 ＨＳＶ－２的直接灭活，感染后治疗，
抑制吸附及抑制病毒进入细胞活性
采用空斑减数实验对ＥＧＰ的抗 ＨＳＶ－２病毒
作用机制进行探索，结果如图４所示，ＥＧＰ对
ＨＳＶ－２的抑制作用主要体现在对病毒的直接杀灭
及抑制病毒吸附２个方面。实验所用最低浓度的
ＥＧＰ（１．９５μｇ／ｍＬ）对 ＨＳＶ－２的直接灭活作用可
以达到７８．５７％（见图４Ｂ）。１．９５μｇ／ｍＬ的ＥＧＰ
可以明显抑制病毒吸附到宿主细胞这个过程，而
阳性药阿昔洛韦则对病毒吸附基本无影响（见图
４Ｃ）。但是如果病毒已经入侵到宿主细胞后，ＥＧＰ
对病毒的抑制作用就会明显逊色于阳性对照药阿
昔洛韦（见图４Ｃ）。在抑制病毒进入细胞方面，较
高浓度的ＥＧＰ（６２．５μｇ／ｍＬ）的抑制作用可以达
到５９．３２％，同样浓度的阿昔洛韦的抑制作用仅为
３２．８３％（见图４Ｄ）。
图４　ＥＧＰ对 ＨＳＶ－２感染后的治疗作用（Ａ），直接灭活作用（Ｂ），抑制吸附作用（Ｃ），
抑制病毒进入作用（Ｄ）（ＡＣＶ为阳性对照药）
Ｆｉｇ．４　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＥＧＰ　ａｎｄ　ＡＣＶ　ｏｎ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ａｆｔｅｒ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（Ａ），ｖｉｒｕｓ　ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ（Ｂ），
ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ（Ｃ）ａｎｄ　ｏｎ　ｓｕｐｐｒｅｓｓ　ｔｈｅ　ｖｉｒｕｓ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｃｅｌ （Ｄ）
２．４．２　ＥＧＰ对 ＨＳＶ－２ＲＮＡ转录和ＤＮＡ复制
的影响
采用Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ的方法检测ＥＧＰ对病毒
ＲＮＡ转录和 ＤＮＡ 复制的影响。如图５所示，
ＥＧＰ能够下调 ＨＳＶ－２的早期基因 ＵＬ５２和晚期
基因 ＵＬ２７的表达，但是对病毒即刻早期基因
ＵＬ５４则没有影响。从图６可以得出，ＥＧＰ对病
毒拷贝数没有影响。
１８　 中　国　海　洋　药　物 ３４卷
图５　ＥＧＰ对 ＨＳＶ－２ＲＮＡ合成的影响
Ｆｉｇ．５　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＥＧＰ　ａｎｄ　ＡＣＶ　ｏｎ　ＨＳＶ－１
ＲＮＡ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
图６　ＥＧＰ对 ＨＳＶ－２ＤＮＡ拷贝数的影响
Ｆｉｇ．６　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＥＧＰ　ａｎｄ　ＡＣＶ　ｏｎ　ＨＳＶ－１
ＲＮＡ　ＤＮＡ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ
３　讨论
本研究通过 ＭＴＴ法检测ＥＧＰ对 Ｖｅｒｏ细胞
的细胞毒性，空斑减数实验检测多糖对单纯疱疹
病毒２型的抗病毒活性，发现ＥＧＰ的细胞毒性极
低，在低浓度下也有较强的抗病毒活性，这为其进
一步应用于临床提供了前提。通过空斑减数实验
研究了ＥＧＰ的抗病毒机制，发现ＥＧＰ主要通过
直接杀灭病毒和抑制病毒吸附两方面起作用，这
说明 ＥＧＰ具有开发成预防用药的潜质。Ｒｅａｌ－
Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ检测发现ＥＧＰ能够影响病毒早期基因
和晚期基因的表达，但是对病毒ＤＮＡ拷贝没有影
响。这与空斑减数实验结果相符，即多糖对 ＨＳＶ－
２起作用的环节在于直接杀灭病毒和阻止病毒与
宿主细胞结合，而对病毒的复制无明显抑制作用。
已知病毒和细胞的外膜主要成分都是糖蛋
白，当病毒感染细胞时，病毒依靠糖蛋白识别并黏
附于细胞膜上，然后病毒包膜与细胞膜融合，病毒
将其遗传物质注入细胞内。未能进入细胞的病毒
会被机体免疫系统杀死［１２］。推测ＥＧＰ是通过竞
争结合糖蛋白从而抑制病毒吸附到细胞上。也有
文献报道多糖可以通过调节免疫作用从而间接发
挥抗病毒效应［１３］，这些都需要进一步深入探讨。
麒麟菜易于大规模培养，其多糖含量可高达
６０％，来源十分丰富，是一种常用的食材，细胞毒
性非常低，其进一步开发具有十分有利的基础。
ＥＧＰ对单纯疱疹病毒２型具有很好的直接杀灭和
抑制吸附作用，开发成为预防或治疗相关疾病的
药物或医疗器械，具有十分广阔的前景。
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