全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 3期
HSV2 LAT ORF2在 Vero细胞中的
表达及对细胞的作用
白利利 1, 2 杨慧兰 2
( 1华南理工大学生物科学与工程学院,广州 510006; 2广州军区广州总医院皮肤科,广州 510010)
摘 要 : 旨在研究人单纯疱疹病毒 2型 (H SV2)潜伏相关转录体 ( LAT )开放读码框 2( ORF2)对体外培养的非洲绿猴肾
细胞 ( Vero )形态和活性的作用 。将构建好的带绿色荧光蛋白 ( EGFP)标签的 H SV2 LAT ORF2真核表达载体 pEGFPORF2,
转染 ve ro细胞, 荧光显微镜观测细胞形态的改变和 MTT法进行活性分析。结果: 显示, H SV2 LAT ORF2诱导细胞形态发生明
显变化, 绿色荧光蛋白在细胞的定位也发生了改变, 细胞活性降低。由此证实, HSV2 LAT ORF2对细胞有损伤作用, 为阐明
HSV2 LAT ORF2的功能提供了资料。
关键词: H SV2 LAT ORF2 绿色荧光蛋白 Vero细胞
HSV2 LAT ORF2 Expression in Vero Cells and Effects on Cells
Ba iL ili
1, 2 YangH uilan2
(
1
South China University of T echnology, Biological Science and Engineering School , Guangzhou 510006;
2
Guangzhou GeneralH o sp ital of GuangzhouM ilitary Command, D epartment of D ermatology, Guangzhou 510010)
Abstrac:t Itw as to explore the effect o fH SV2 LAT ORF2 on cy tom orpho logy and ce ll activ ity in vitroEukaryo tic express ive vec
tors o f EGFPORF2 fusion pro tein nam ed pEGFPORF2 was transfected in to Vero cells by liposom e transfection reagent, m orphogenesis
w ere observed by fluorescence m icroscopy and ce ll activ ity w ere analyzed byMTTResu lts that HSV2 LAT ORF2 had ev ident change
in cy tom orpho logy, the lo ca tion o f fusion prote in of EGFP and H SV2 LAT ORF2 in cells has changed, andMTT analysis revea led the
ce ll activ ity decreasedTherefore, it proved thatH SV2 LAT ORF2 has im pa irm en t on ce lls, and these resu ltsm ay shed light on the fur
ther study of the function o fH SV2
Key words: HSV2 LAT ORF2 Green fluo rescent prote in Vero cell line
收稿日期: 20091111
基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30972666) ,全军医药卫生科研基金资助项目 ( 06J008 )
作者简介:白利利,女,硕士研究生,研究方向:病毒分子生物学; Em ai:l b ll1012@ 163 com
通讯作者:杨慧兰, Em ai:l hu ilany88@ hotma il com
单纯疱疹病毒 2型 (HSV2)是人类疾病的常见
的病原体,在体内易引起持续潜伏感染,当免疫力低
下时, 可反复被激活。HSV2的潜伏感染是生殖器
疱疹易复发、难根治的主要原因。潜伏相关转录体
( LAT)是 HSV在潜伏感染时惟一大量表达和可被
检测到的基因, 被认为在 HSV潜伏的建立、维持和
激活过程中起重要作用 [ 1- 4]。HSV起主要作用的
LAT中含 3个 ORF, 其中 ORF2在 HSV1研究中被
认为有重要作用 [ 5] ,而与其同源性很高的 HSV2没
有报道。为此, 本试验拟将构建好的 HSV2 LAT
ORF2基因的表达质粒以脂质体转染 V ero细胞,观
察其对细胞作用,为探讨 HSV2 LAT ORF2在 HSV
2潜伏复发机制中的作用奠定基础。
1 材料与方法
11 材料
111 质粒与细胞 粒 pEGFPC2, 张宏斌博士赠
送; 质粒 pEGFPORF2由本实验室构建。非洲绿猴
肾细胞 (V ero)由本实验室保存。
112主要试剂 高保真 DNA聚合酶 PrimeSTAR
HS DNA Po lymerase购自 TaKaRa公司。脂质体 Li
po fectam ine
TM
2000, TRIzo l试剂为 Inv itrogen公司产
2010年第 3期 白利利等: H SV2 LAT ORF2在 Vero细胞中的表达及对细胞的作用
品。RPM I1640培养液与胎牛血清为 Hyclone公司
产品。MTT, DM SO购自 Sigma公司, 逆转录试剂盒
购自 Prom ega公司
12 方法
121 V ero细胞的培养 用含 10%胎牛血清的
RPM I1640细胞培养液在 37 , 5% CO 2及一定湿
度条件下对 Vero细胞进行常规培养, 2 - 3 d传代
1次。
122 质粒转染 V ero细胞 胰蛋白酶消化 V ero
细胞, 接种于细胞培养板上, 置于 37 , 5% CO2培
养箱中培养。 48 h后更换新鲜培养液。采用脂质
体法转染细胞。用无血清 RPM I1640培养液分别
稀释质粒和 Lipo fectam ineTM 2000, 室温静置 5 m in。
将两种稀释液轻轻混合, 室温放置 20 m in。将混合
液加至对应的孔板中, 置于 37 , 5% CO2条件下培
养。24 h后更换成新鲜含 10%胎牛血清的 RPM I
1640培养液继续培养
123 RTPCR检测 LAT ORF2的表达 将转染后
的 V ero细胞收集以后, 用 TR Izo l试剂提取细胞总
RNA进行逆转录, 具体步骤参照各自的产品说明
书。以所得 cDNA 为模板进行 PCR扩增, ORF2/
hA ctin扩增条件分别为 94 预变性 5m in; 94 变性
40 s, 44 /58 退火 1m in, 72 延伸 1 m in, 共循环
30次; 72 延伸 7 m in, 冷却到 4 。 PCR产物经
12%琼脂糖凝胶电泳检测。
124 质粒对细胞形态的影响 荧光显微镜下观
察转染后不同时间点的细胞形态的变化与绿色荧光
蛋白在细胞中的表达定位, 计数绿色荧光蛋白的表
达量。
125 细胞增殖试验 试验分为 3组,未作任何处
理的正常组 Vero细胞,分别转染了空质粒 pEGFPC2
与重组质粒 pEGFPORF2的 V ero细胞,转染 84 h后,
将各试验组细胞加入 MTT (终浓度为 05mg /mL ),
4 h后弃去培养液,加入 150 L DMSO, 震荡 10m in,
溶解 MTT结晶物,酶标仪测定 OD值, 检测波长为
570 nm,每组设 12个复孔,重复 3次。
126 统计学处理 试验结果采用 SPSS160软件
进行分析,各组数据均以均数 标准差 (x s )表示,
各组间两两比较采用单因素的方差分析和 t检验。
2 结果
21 重组质粒在 Vero细胞中的表达
荧光显微镜显示质粒在 Vero细胞中得到了高
效表达 (图 1)。
a.重组质粒 pEGFPORF2转染 V ero 细胞; b. 空质粒
pEGFPC2转染 V ero细胞
图 1 质粒转染 V ero细胞后荧光蛋白表达 ( 200 )
2. 2 重组质粒在细胞中表达的 RTPCR验证
各组均可扩出 452 bp的 actin内参条带, 转
染了 pEGFPORF2质粒的 V ero细胞可扩增出约
240 bp的目的条带 (图 2)。
1. DL2000 M ark er; 2. 转染 pEGFPORF2的 V ero细胞组
的 ORF2片段; 3.转染 pEGFPC2的 V ero细胞组无目的
片段; 4. DL2000M arker; 5.转染 pEGFPORF2的 V ero细
胞组 act in内参条带; 6.转染 pEGFPC2的 V ero细胞
组的 act in内参条带
图 2 RTPCR鉴定 pEGFPORF2的表达
23 重组质粒转染 V ero细胞的效率
脂质体介导的质粒转染 Vero细胞, 分别在 36,
60, 84 h后用荧光倒置显微镜观察转染效率, 重组
质粒与空质粒都在 V ero细胞中得到了表达, 并且瞬
时转染后在 84 h的表达量最高 (图 3)。
24 重组质粒对细胞形态的影响
转染了重组质粒的细胞形态发生明显的变化,
转染 60 h细胞变圆,绿色荧光蛋白在整个细胞中表
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 3期
达, 84 h出现不规则形状, 细胞比以前细长, 荧光蛋
白同样在整个细胞中表达, 108 h细胞内出现空泡,
绿色荧光蛋白主要分布于近核膜处, 细胞核内荧光
消失, 胞浆的荧光将胞核映照出清晰的无荧光轮廓,
转染 132 h后,细胞发生裂解死亡, 绿色荧光蛋白析
出,呈现出绿色丝状物,在普通倒置显微镜下也可观
察到 (图 4)。
图 3 荧光蛋白表达效率
25 细胞存活率 MTT法比色分析结果
MTT法相应 OD570值与细胞存活量成正比。转
染了质粒的细胞 OD值都低于正常对照组,说明转
染质粒对细胞有一定的损伤作用, 转染了重组质粒
pEGFPORF2的 Vero细胞 OD值明显低于 pEGFP
C2组 ( P < 005) ,与正常对照组 (P < 0001) , 而转
染空质粒组与正常对照组差异不显著, 说明 HSV2
LAT ORF2对细胞有损伤作用 (图 5)。
3 讨论
目前国际上研究 HSV潜伏复发的机制主要集
中在对 HSV1 LAT的研究上, 有报道称 HSV1 LAT
是通过其编码蛋白介导 HSV潜伏复发的 [ 3 ]。而目
前对 HSV2 LAT的研究国内外较少, 其所编码的蛋
白可能是瞬时表达 [ 6 ] , 所以很难检测到, 由此给
HSV2 LAT ORF的研究带来困难。
绿色荧光蛋白作为一种新型的报告基因 ,被认
为是研究基因表达调控、细胞分化及细胞探测的最
好方法。它具有直观、及时、应用范围广等优点, 作
为融合表达标签时不影响目的蛋白的定位和功能,
为基因功能的研究提供了一种崭新途径 [ 7]。因此,
以 EGFP为标签的 HSV 2 LAT ORF 的融合表达质
粒对于检测 HSV2 LAT蛋白的表达, 示踪蛋白的定
位创造了条件。本研究在将融合表达质粒瞬时转染
Vero细胞后发现, 84 h内荧光蛋白的表达量是逐步
增多的,此时荧光蛋白主要集中于整个细胞中。随
着时间延长荧光蛋白表达有向胞膜周围聚集的趋
势, 在细胞裂解死亡后, 荧光蛋白析出,呈现绿色丝
状物,在普通光镜下也能观察到。转染重组质粒后,
细胞形态发生了明显的变化, 说明 HSV2 LAT
ORF2对细胞有一定的诱导作用。同时, 用 MTT法
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2010年第 3期 白利利等: H SV2 LAT ORF2在 Vero细胞中的表达及对细胞的作用
检测了转染后细胞的活性,结果表明,转染了重组质
粒的细胞活性显著低于转染空质粒与正常细胞的活
性值。进一步说明 HSV2 LAT ORF2对细胞有一定
的损伤作用。
综上所述, 本试验发现 HSV2 LAT ORF2影响
细胞的形态,改变了融合蛋白在细胞中定位,同时抑
制细胞的活性。这与国外研究的 HSV1 LAT ORF
对细胞有抗凋亡作用不一致 [ 3 ] ,可能与疱疹病毒的
类型有关, 与研究方法的不同有关, 也可能 HSV2
LAT ORF2是通过其它作用介导 HSV2在体内细胞
中的潜伏复发的。因此, 要阐明 HSV2的潜伏复发
机制尚需要对 HSV2 LAT ORF2的作用作进一步
研究。
参 考 文 献
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(上接第 159页 )
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科学出版社新书
文冠果生物学
徐东翔 于华忠 乌志颜 胡春元 王义虞 毅卢 广军 编著
9787030263643 50. 00 2010年 1月出版
内容简介: 文冠果为我国特有的油料树种, 广泛分布于北方地区。本书以内蒙古林学院研究成果为主要资料,同时参考
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物学特性; 以有机养料制造、输导、累积和转化为基本线索的生理生化特性; 树种自然类型及优树选择与扩繁技术; 壮苗培育、
栽植及抚育管理等丰产技术;植物体各部分化学成分检测与深度、综合开发利用分析。本书注重理论与实践结合,揭示各生
命活动之间、各生长发育过程之间的内在联系, 将植物体视为统一的整体进行研究与分析, 以探索规律, 为发展其栽培技术措
施提供理论依据。
本书可作为有关高等院校生物类相关专业师生、科研院所从事植物类相关研究的科技工作者、从事文冠果产业和生物质
能源产业的相关科技人员以及林业管理人员的参考书。
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