全 文 ： Marine Sciences / Vol. 39, No. 12 / 2015 15
琼枝麒麟菜多糖抗呼吸道病毒活性研究
邹沐平1, 2, 董 栋1, 王怀玲1, 王巧利1, 蒲含林2, 王一飞1
(1. 暨南大学 生命科学技术学院 生物医药研究开发基地, 广东 广州 510632; 2. 暨南大学 生命科学技术学
院 生物工程研究所, 广东 广州 510632)
摘要: 为了评价琼枝麒麟菜多糖(EGP)包括粗提物(CEGP)及大于 500 kDa 多糖组分(LEGP)抗呼吸道相
关病毒活性。采用 Reed-muench 法计算流感病毒 H1N1、H3N2 和 H5N3, 柯萨奇病毒 CVB3 及呼吸道
合胞病毒 RSV-long 株滴度; 采用观察细胞病变效应(CPE)法, 确定 CEGP 和 LEGP 对犬肾细胞(MDCK),
人宫颈癌细胞(HeLa)和人喉癌上皮细胞(HEp-2)的最大无毒浓度; 通过细胞病变观察法(CPE)及四甲基
偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT 法)测定 CEGP 和 LEGP 抑制各病毒产生细胞病变的作用。结果表明:
CEGP 和 LEGP 对 5 种常见的呼吸道病毒 H1N1、H3N2 和 H5N3, CVB3 和 RSV 都有抑制作用, CVB3
和 RSV 对 CEGP 和 LEGP 更敏感; CEGP 和 LEGP 有抗多种呼吸道病毒作用, 为抗呼吸道病毒新药的研
发提供理论依据。
关键词: 琼枝麒麟菜多糖; 抗病毒; 呼吸道病毒
中图分类号: Q 文献标识码: A 文章编号: 1000-3096(2015)12-0015-06
doi: 10.11759/hykx20141128001
呼吸道病毒是一类能侵犯呼吸道或以呼吸道为
侵入门户而引起呼吸道及呼吸道外组织器官病变的
病毒 [1]。呼吸道病毒包括流感病毒 (H1N1, H3N2,
H5N3 等 )、呼吸道合胞病毒 (RSV)和科萨奇病毒
(CVB3)等。流感病毒传染性极强且极易变异, 危害性
大, 难以控制[2], 目前广泛使用的抗流感病毒的西药具
有一定的毒副作用, 并可引起流感病毒变异, 或产生
不同程度的耐药性[3]。柯萨奇病毒 CVB3是非常严重的
致病病原[4-5], 目前尚无有效药物[6]。呼吸道合胞病毒
RSV 可引起婴幼儿严重呼吸道感染, 目前只有病毒唑
和 RSV免疫球蛋白 2种药物。但病毒唑不良反应较严
重, RSV 免疫球蛋白治疗费用很高。综上, 呼吸道病
毒对人类危害大, 人类尚无法阻止这些病毒感染或进
行有效治疗, 因此, 开发研制药效可靠, 毒副作用小
的新药, 仍然是国际新药研发的重要任务。
近年来对海洋资源的开发成为热点, 目前国内
外对海洋生物活性物质的研究都取得一定进展。许
多从海洋生物中提取的天然产物具有抗肿瘤, 抗凝
血, 抗病毒[7-8]等的生物活性。从海洋生物中提取的
多糖 , 尤其是从海藻中提取的硫酸酯多糖 , 不仅能
提高机体免疫力, 而且具有广泛的抗病毒作用[9]。
琼枝麒麟菜 (Eucheuma gelatinae)属于红藻门 ,
麒麟菜属 , 在我国海南岛有大规模的人工养殖 , 资
源十分丰富[10]。麒麟菜中含有丰富的多糖, 约占藻体
干重的 60%。迄今为止, 人们对琼枝麒麟菜在抗病毒
等生物活性方面的研究较少。本文对琼枝麒麟菜多
糖粗提物(CEGP)及大于 500 kDa多糖组分(LEGP)抗
呼吸道相关病毒活性进行初步研究。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 病毒
流感病毒 H1N1、H3N2 和 H5N3, 呼吸道合胞
病毒RSV-long株和柯萨奇病毒CVB3均为本实验室
保存。
1.1.2 细胞
犬肾细胞(MDCK), 人宫颈癌细胞(HeLa)和人喉
癌上皮细胞(HEp-2), 均为本实验室保存。
1.1.3 药物
参考王怀玲等 [11]多糖提取工艺, 通过水提醇沉

收稿日期: 2014-11-28; 修回日期: 2015-06-05
基金项目: 广东省海洋渔业科技推广专项科技攻关与研发(A201301C06)
资助
作者简介 : 邹沐平(1990), 女 , 广东揭阳人 , 硕士研究生; 研究方向:
海洋药物 , 电话: 15002004602, E-mail: zoumuping@163.com; 王一飞,
通信作者 , 教授 , 研究方向: 生物医药 , 电话: 020-85223426, E-mail:
twangyf@jnu.edu.cn; 蒲含林, 通信作者, 男, 副研究员, 研究方向: 天然
产物纯化、合成及活性研究, 电话: 13560136797, E-mail: tphl@jnu.edu.cn
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法得到琼脂麒麟菜粗多糖(CEGP), 并通过膜分离技
术从琼枝麒麟菜粗多糖中分离出大于 500 kDa 的多
糖组分(LEGP)。所有样品均没有检测出核酸及蛋白
质等杂质。
1.1.4 试剂与器材
胎牛血清, 杭州四季青生物材料工程有限公司;
二甲基亚砜, 广州化学试剂厂; DMEM培养基, Gib-
co 公司; MEM 培养基, Gibco 公司; 培养箱, 日本
SANYO 公司; 96 孔培养板, 美国 CORNING 公司;
倒置显微镜, 德国 Leica 公司; 超净工作台, 苏州净
化设备公司。
1.2 实验方法
1.2.1 病毒毒力测定[12]
选用 MDCK、HeLa和 HEp-2细胞进行培养。接
种 1.5×105个/mL细胞于 96孔细胞培养板, 在恒温培
养箱中培养 16~20 h, 待细胞生长成单层后, 吸弃培
养基, 用 PBS洗涤 3次, 加入用维持液按 10倍递减
稀释的病毒毒液 100 μL/孔, 设 8 个复孔, 同时设正
常细胞对照。37℃, 5% CO2温箱中培养 3 d, 在倒置
显微镜下观察并记录细胞形态变化(CPE), 细胞无病
变为–, 病变 0~25%为+, 病变 25%~50%为++, 病变
50%~75%为+++, 病变 75%~100%为++++。根据观察
结果用 Kärber 公式计算 TCID50。
1.2.2 细胞毒性实验
选用 MDCK、HeLa和 HEp-2细胞进行培养。对
CEGP和 LEGP的细胞毒性进行测定, 计算最大无毒
剂量(TC0)。细胞长成单层后, 吸弃培养液, 分别加入
维持液按 2倍比稀释成不同浓度的药液, 每孔 100 μL,
各设 6个复孔, 同时设正常细胞对照, 其间置倒置显
微镜下观察, 采用 CPE 法[10], 观察药物的最大无毒
浓度 TC0。
1.2.3 抗呼吸道相关病毒活性[13]
选用 MDCK、HeLa和 HEp-2细胞进行培养。在
96孔培养板中接种细胞密度为 1.5105 个/mL, 每孔
100 μL, 37℃, 5% CO2培养箱中培养 16~20 h, 待其
生长为单层细胞, 弃去培养液, 用 PBS洗 3次, 将不
同稀释度的药物(在无毒浓度范围内)和病毒稀释液
(100TCID50)各 50 μL 直接加到单层细胞上, 先加样
品液, 再加病毒液。每个浓度设 3个复孔, 100 μL/孔,
同时设病毒对照组、正常细胞对照组, 置于 37℃、
5% CO2培养箱培养 24~72 h, 其间置倒置显微镜下观
察细胞病变(CPE)的情况。待病毒对照组的细胞病变
达到 75%以上, 而对照组细胞正常时, 观察并记录各
孔的 CPE, 并做MTT定量活细胞数计算病毒抑制率。
病毒抑制率=(药物组吸光度–病毒组吸光度)/(对
照组吸光度–病毒组吸光度)×100%。
根据病毒抑制率计算药物的半数抑制浓度(IC50)
和药物的治疗指数 TI= TC50/ IC50。
1.2.4 麒麟菜多糖样品抗病毒机理初探
LEGP 虽然是 CEGP 进一步精制所得, 但是抗
病毒活性与 CEGP 相似, 且没有明显提高, 为以后
产业化工艺成本考虑, 选用 CEGP 进行机制研究。
根据 1.2.3的实验结果, 选取 CEGP抗病毒活性较好
的两株病毒进行抗病毒机理的初步探索。按不同给
药途径设置三组实验 : a. 感染病毒前加药法。将
CEGP用维持液对倍稀释后加入长成单层的 Hela细
胞 , 每孔 50 μL。37℃吸附两小时后加入 50 μL
CVB3 病毒悬液。b. 直接灭活法。将 CEGP 用维持
液对倍稀释后与相同体积的 CVB3 病毒悬液混合,
在 37℃孵育 2 h 后加入单层 Hela 细胞。c. 感染病
毒后加药法。接种 50 μL病毒悬液于单层细胞中, 在
37℃吸附 1 h后加入用维持液对倍稀释的 CEGP溶
液[11]。所有 96孔培养板均置于 37 ℃、5% CO2培
养箱中培养, CPE 观察, 待病毒对照孔达到 75%以
上病变程度时, 用 MTT 法定量活细胞数计算病毒
抑制率, 方法如 1.2.3。
2 结果
2.1 病毒滴度测定
通过倒置显微镜观察细胞病变情况 , Reed-
muench方法计算各毒株 TCID50(表 1)。以 100TCID50
的浓度进行抗病毒实验。

表 1 实验所用各毒株滴度
Tab.1 Virus titer used in the experiment
病毒株 TCID50 病毒株 TCID50
H3N2 10–5.5 CVB3 10–7
H5N3 10–4.5 RSV 10–4.2
H1N1 10–4.5

2.2 CEGP 和 LEGP 对各细胞株的细胞毒
性测定
以正常细胞无死亡、不引起细胞病变的最高药
物稀释浓度作为对各株细胞的最大无毒浓度 TC0,
CPE观察结果见表 2。
CPE观察结果得, CEGP和 LEGP在实验所用浓度
(≤500 μg/mL)范围对MDCK, HeLa, HEp-2细胞均无毒。
Marine Sciences / Vol. 39, No. 12 / 2015 17
表 2 CEGP 和 LEGP 的细胞毒性
Tab.2 Cytotoxicity of CEGP and LEGP
TC0(μg/mL) 样品
MDCK HEp-2 HeLa
CEGP >500 >500 >500
LEGP >500 >500 >500

2.3 CEGP 和 LEGP 对呼吸道相关病毒的
作用
倒置显微镜下观察, 流感病毒感染使细胞出现
破碎、皱缩成团等病变特征(如图 1b); 科萨奇病毒
CVB3感染使细胞皱缩、变圆死亡(如图 2b); 呼吸道
合胞病毒 RSV 感染导致细胞出现典型的合胞体(如
图 3b)。CEGP及 LEGP在实验所用浓度(≤500 μg/mL),
均能不同程度地抑制各株病毒感染所致的细胞病变
(如表 3所示), 且 CEGP和 LEGP的作用相似。病毒
RSV 和 CVB3 均比三株流感病毒对 CEGP 和 LEGP
更敏感, 最低浓度 31.25 μg/mL的 CEGP 和 LEGP可
100%抑制病毒 RSV 引起的细胞病变, 而最低浓度
62.5 μg/mL 的 CEGP 和 LEGP 可 100%抑制病毒
CVB3引起的细胞病变。抗病毒活性及治疗指数结果
(表 4)显示 CEGP 对科萨奇病毒的半数治疗指数为
0.371 μg/mL, LEGP对科萨奇病毒的半数治疗指数为
0.263 μg/mL, 治疗指数分别是大于 1347及 1901。


图 1 显微镜下 MDCK细胞形态: 正常细胞(a), 流感病毒感染后(b)和流感病毒 + CEGP(c)
Fig.1 MDCK cells under the microscope: normal cells (a), cells infected with the influenza virus (b), cells infected with the
virus but treated with CEGP (c)

图 2 显微镜下 HeLa细胞形态: 正常细胞(a), 感染后(b)和+CEGP(c)
Fig.2 Hela cells under the microscope: normal cells (a), cells infected with CVB3 (b), cells infected with the virus but treated
with CEGP (c)

图 3 显微镜下 HEp-2细胞形态: 正常细胞(a), 感染后(b)和+CEGP(c)
Fig.3 HEp-2 cells under the microscope: normal cells (a), cells infected with RSV (b), cells infected with the virus but treated
with CEGP (c)
18 海洋科学 / 2015年 / 第 39卷 / 第 12期
表 3 CEGP 和 LEGP 抗呼吸道相关病毒活性(CPE)
Tab.3 Anti-respirovirus activity of CEGP and LEGP (CPE)
CEGP LEGP 样品(μg/mL)
H1N1 H3N2 H5N3 CVB RSV H1N1 H3N2 H5N3 CVB RSV
病毒组 ++++ ++++ +++ ++++ +++ ++++ ++++ +++ ++++ +++
3.9 +++ +++ +++ +++ ++ +++ +++ +++ +++ ++
7.8 +++ ++ +++ +++ + +++ ++ +++ +++ +
15.6 ++ ++ ++ ++ + ++ ++ ++ ++ +
31.3 + + ++ + – + ++ ++ + –
62.5 + + ++ – – + + ++ – –
125 + + ++ – – + + ++ – –
250 + + ++ – – + + ++ – –
500 + + ++ – – + + ++ – –

表 4 CEGP 和 LEGP 的抗病毒活性及治疗指数
Tab.4 Antiviral activity and the therapeutic index of CEGP and LEGP
IC50(μg/mL) TI 样品
H1N1 H3N2 H5N3 CVB RSV H1N1 H3N2 H5N3 CVB RSV
CEGP 485 500 253 0.37 18.3 >1 >1 >1.97 >1347 >27.4
LEGP 312 104 387 0.26 17.7 >1.6 >4.8 >1.3 >1901 >28.2

待病毒对照孔病变达到 75%以上而且病变不再
随时间增加而变化时, 用 MTT 法检测各孔中细胞存
活率。结果如图 4 和图 5, CEGP 和 LEGP 的抗病毒
活性都呈浓度依赖性, 且高浓度对病毒抑制率更高。

图 4 CEGP对实验中各株病毒抑制作用的效量关系
Fig.4 Inhibition effect of the virus (CEGP)

2.4 麒麟菜多糖样品抗病毒机理初探
根据 2.3的实验结果, 选取抗病毒活性较好的两
株病毒 RSV和 CVB3进行抗病毒机理的初步研究。
不同给药途径下 CEGP的抗病毒活性见图 6及图 7。
由图 6 和图 7 知, 不同给药途径下 CEGP 对
CVB3 和 RSV 两种病毒的抑制效果一致, 都是先加
药后感染病毒>直接灭活>感染病毒后加药。这说明
CEGP 具有良好的抑制病毒吸附或侵入细胞的活性,
在细胞外也能有效地直接杀灭病毒。

图 5 LEGP对各病毒株感染细胞抑制作用的效量关系
Fig.5 Inhibition effect of the virus (LEGP)

图 6 不同给药途径下 CEGP的抗 CVB3活性
Fig.6 Antiviral activity against CVB3 of CEGP based on
different dosing
Marine Sciences / Vol. 39, No. 12 / 2015 19

图 7 不同给药途径下 CEGP的抗 RSV活性
Fig.7 Antiviral activity against RSV of CEGP based on
different dosing

3 讨论
本文初步研究了麒麟菜多糖的抗病毒活性 ,
MTT 及 CPE 结果显示, CEGP 及 LEGP 对常见的呼
吸道病毒包括流感病毒(H1N1, H3N2, H5N3), 科萨
奇病毒 CVB3及呼吸道合胞病毒 RSV都具有一定抗
病毒活性 , 且活性相似 , 证明抗病毒多糖成分为大
分子量多糖组分。并且, 随着 CEGP和 LEGP浓度增
大, 抗病毒活性也随之增强。其中, LEGP对 CVB3
的作用最好, 治疗指数 TI 高达 1901, 但其抗呼吸道
相关病毒活性具体作用机制还有待进一步研究。另
外, 在实验所用浓度范围内(<500 μg/mL), CEGP 及
LEGP对 MDCK、HeLa和 HEp-2细胞均无明显毒性。
不同给药途径下 CEGP 的抗病毒作用实验证明 ,
CEGP 是通过阻止病毒吸附或侵入细胞以及直接杀
灭病毒来保护细胞免受病毒感染。关于 CEGP 是直
接抑制病毒吸附于细胞上还是抑制了病毒核酸注入
细胞的过程 , 以及是通过哪种方式杀伤病毒 , 相关
机制正在进一步研究中。
本文研究并证明了 CEGP及 LEGP具有抗呼吸道
相关病毒活性并初步探讨了抗病毒作用机制, 可针对
该活性做进一步的体内研究, 开发出可以预防及治疗
呼吸道相关疾病的药物或医疗器械等。麒麟菜易于大
规模人工培养, 藻体多糖含量高达 60%, 来源十分丰
富, 为其进一步的开发提供了有利的基础。
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20 海洋科学 / 2015年 / 第 39卷 / 第 12期
Anti-respirovirus activity of a Eucheuma gelatinae polysac-
charide
ZOU Mu-ping1, 2, DONG Dong1, WANG Huai-ling1, WANG Qiao-li1, PU Han-lin2,
WANG Yi-fei1
(1. Guangzhou Jinan Biomedicine Research and Development Center, Guangzhou 510632, China;
2. Guangzhou Jinan Bioengineering Institute, Guangzhou 510632, China)
Received: Nov., 28, 2014
Key words: Eucheuma gelatinae polysaccharides; antiviral activity; respirovirus

Abstract: Objective: To evaluate the anti-respirovirus effects of crude Eucheuma gelatinae polysaccharides (CEGP)
and large molecular weight components (MW > 500 kDa, LEGP).
Method: The Reed-Muench method was used to calculate the titer of the influenza virus (H1N1, H5N3, and H3N2),
coxsackie virus (CVB3), and the respiratory syncytial virus (RSV-long). The maximum no toxicity concentrations
of CEGP and LEGP to each cell line (MDCK, HeLa, and HEp-2) were selected by the cytopathic effect (CPE)
method. The antiviral effects of CEGP and LEGP were evaluated by the MTT and CPE methods.
Results: Both CEGP and LEGP showed significant and similar inhibition effects on the influenza virus (H1N1,
H5N3, and H3N2), CVB3, and RSV-long. CVB3 and RSV were more sensitive to EGP (CEGP and LEGP) com-
pared with the influenza virus.
Conclusion: CEGP and LEGP showed great potential in respirovirus inhibition.

(本文编辑: 康亦兼)