全 文 ：第３３卷第６期
２０１４年１２月
中 国 海 洋 药 物
ＣＨＩＮＥＳＥ　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＭＡＲＩＮＥ　ＤＲＵＧＳ
Ｖｏｌ．３３　Ｎｏ．６
Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，２０１４
琼枝麒麟菜多糖超声提取工艺及
皮肤修复活性研究△
＊
王怀玲＃，董栋＃，邹沐平，廖晓凤，刘秋英，王一飞＊
（暨南大学 生命科学技术学院 生物医药研究开发基地；广东 广州５１０６３２）
摘　要：目的 优化琼枝麒麟菜多糖（ＥＧＰ）的超声提取方法，并探讨ＥＧＰ在皮肤损伤修复方面的作用。方法
采用单因素考察和正交试验方法优化超声方法提取琼枝麒麟菜多糖（ＥＧＰ），苯酚－浓硫酸法测定ＥＧＰ中多糖
含量。通过 ＭＴＴ细胞毒性实验、细胞增殖实验和划痕实验，研究ＥＧＰ对人永生化表皮细胞（ＨａＣａＴ）形态、
增殖分化和细胞迁移速度的影响，评价其在皮肤损伤修复方面的作用。结果 确定ＥＧＰ的最优超声提取条件
为：温度６０℃，料液比１∶１００，时间３０ｍｉｎ，ＥＧＰ得率为４０．３％±１．８％，其中多糖含量为４８．２％±４．６％。
ＥＧＰ对ＨａＣａＴ细胞几乎无毒，且在一定浓度范围内对ＨａＣａＴ细胞的增殖有显著的促进作用；ＥＧＰ还能加快
ＨａＣａＴ细胞的迁移速度，对皮肤损伤的愈合有显著的影响意义。结论 超声法提取ＥＧＰ时间短，工艺稳定，
所得ＥＧＰ毒性小，对皮肤及黏膜损伤的修复具有促进作用，可广泛应用于化妆品及医疗器械。
关键词：琼枝麒麟菜；琼枝麒麟菜多糖；超声提取工艺；皮肤修复
中图分类号：Ｒ９３１　　　文献标志码：Ａ　　　文章编号：１００２－３４６１（２０１４）０６－０６５－０６
Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ
Ｅｕｃｈｅｕｍａ　ｇｅｌａｔｉｎａｅ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｓｋｉｎ　ｒｅｐａｉｒ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ
ＷＡＮＧ　Ｈｕａｉ－ｌｉｎｇ＃，ＤＯＮＧ　Ｄｏｎｇ＃，ＺＯＵ　Ｍｕ－ｐｉｎｇ，ＬＩＡＯ　Ｘｉａｏ－ｆｅｎｇ，
ＬＩＵ　Ｑｉｕ－ｙｉｎｇ，ＷＡＮＧ　Ｙｉ－ｆｅｉ＊
（Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｃｅｎｔｒｅ　ｏｆ　Ｊｉｎａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０６３２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｏｐｔｉｍｉｚｅ　ｔｈｅ　ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆ　Ｅｕｃｈｅｕｍａ　ｇｅｌａｔｉｎａｅ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ
（ＥＧＰ）ａｎｄ　ｅｖａｌｕａｔｅ　ｔｈｅ　ＥＧＰ＇ｓ　ｒｅｐａｉｒ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆ　ＥＧＰ　ｗａｓ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｂｙ　ｓｉｎｇｌｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｓｔｕｄｙ　ａｎｄ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ
ｏｆ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｗａｓ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｐｈｅｎｏｌ－ｓｕｌｆｕｒｉｃ　ａｃｉｄ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ　ＥＧＰ＇ｓ　ｒｅｐａｉｒ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ａｃ－
ｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｗｅｒｅ　ａｌｓｏ　ｅｖａｌｕａｔｅｄ　ｉｎ　ｔｅｒｍｓ　ｏｆ　ｃｅｌ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，ｃｅｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｃｅｌ　ｍｉｇｒａｔｉｏｎ　ｏｎ　ＨａＣａＴ　ｃｅｌ
ｌｉｎｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｗａｓ　ａｔ　ｔｈｅ　ｆｏｌｏｗｉｎｇ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ：
６０℃，ｓｏｌｉｄ－ｌｉｑｕｉｄ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　１∶１００，ａｎｄ　３０ｍｉｎ，ａｎｄ　ＥＧＰ　ｙｉｅｌｄｅｄ　４０．３％±１．８％ ｗｈｉｃｈ　ｃｏｎｔｅｎｔｅｄ　４８．
２％±４．６％ｏｆ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ．Ｃｅｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍｉｇｒａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙｓ　ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ＥＧＰ　ｐｌａｙｅｄ　ａｎ
ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｒｏｌｅ　ｔｏ　ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ　ｔｈｅ　ＨａＣａＴ　ｃｅｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍｉｇｒａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｎｏ　ｔｏｘｉｃｉｔｙ，ｗｈｉｃｈ　ｍｉｇｈｔ　ａｃ－
ｃｅｌｅｒａｔｅ　ｓｋｉｎ　ｒｅｐａｉｒ　ａｎｄ　ｗｏｕｎｄ　ｈｅａｌｉｎｇ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＩｔ　ｗａｓ　ａｎ　ｅｎｅｒｇｙ　ｓａｖｉｎｇ　ａｎｄ　ｓｔａｂｌｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｔｏ　ｅｘ－
ｔｒａｃｔ　ＥＧＰ　ｂｙ　ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ．Ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｖｅ　ｃｏｕｌｄ　ｉｍｐｒｏｖｅ　ｔｈｅ　ｗｏｕｎｄ　ｈｅａｌｉｎｇ　ａｎｄ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｋｉｎ　ａｎｄ
＊ △基金项目：广东省海洋经济创新发展区域示范项目（ＧＤＨＹ２０１２－０１－００１）资助
　作者简介：王怀玲（１９８８－），女，硕士研究生；＃共同第一作者：董栋（１９８３－），女，博士后。
＊通讯作者：王一飞，男，教授。研究方向：生物医药。Ｅ－ｍａｉｌ：ｔｗａｎｇｙｆ＠ｊｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ，Ｔｅｌ：＋８６－２０－８５２２３４２６
　　收稿日期：２０１４－０８－１１
DOI:10.13400/j.cnki.cjmd.2014.06.012
６６　 中　国　海　洋　药　物 ３３卷
ｍｕｃｏｓａ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｗｉｔｈ　ｎｏ　ｔｏｘｉｃｉｔｙ．ＥＧＰ　ｓｈｏｗｅｄ　ｇｒｅａｔ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｉｅｌｄｓ　ｏｆ　ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｒａｐｅｕ－
ｔｉｃ　ｄｅｖｉｃｅｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｅｕｃｈｅｕｍａ　ｇｅｌａｔｉｎａｅ；Ｅｕｃｈｅｕｍａ　ｇｅｌａｔｉｎａｅ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｏｓｅ（ＥＧＰ）；ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；
ｓｋｉｎ　ｒｅｐａｉｒ
　　麒麟菜又名鸡脚菜、珍珠菜等，全世界有３０
多种，其主要成分为多糖、纤维素和矿物质。琼枝
麒麟菜（Ｅｕｃｈｅｕｍａ　ｇｅｌａｔｉｎａｅ）属红藻，是麒麟菜的
１种，现主要被用于提取卡拉胶。
麒麟菜多糖的提取方法有很多，如热水浸提
法［１］、碱处理法和 ＫＣｌ分级提取法［２］等。在传统
热提取方法或碱处理过程中，其活性结构容易被
破坏，碱及无机盐的加入又会影响多糖的纯度。
为了有效的避免此类问题，本实验希望通过超声
控温提取法提取琼枝麒麟菜多糖，既可有效保护
麒麟菜多糖的活性结构，提高提取效率，减少提取
溶剂的使用，缩短提取时间，节省能源，又有希望
应用于工厂大量生产。另外，研究表明，麒麟菜多
糖具有抑菌［３］、抗病毒［４］、抗肿瘤［５－６］、抗凝血［７］等
多种生物活性。本文初步探讨了琼枝麒麟菜多糖
（ＥＧＰ）在皮肤修复方面的生物活性，为其在生物
医药材料及化妆品领域的应用提供进一步的科学
依据。
１　仪器与材料
仪器设备：电热套（浙江舟山市源仪器厂）；ＵＶ－
２６００紫外分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司）；
ＲＥ５２ＣＳ旋转蒸发仪（浙江舟山市源仪器厂）；Ｂ－２２０
恒温水浴锅（浙江舟山市海源仪器厂）；ＬＲＨ－１５０生
化培养箱（上海益恒仪器有限公司）；ＳＨＢ－Ｂ９５Ａ型
循环水多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；低
温冷却液循环泵（郑州长城科工贸有限公司）；超声
波仪（上海五相仪器仪表有限公司）；小型台式冻干
机（ＢＭＨ）；低温高速离心机（德国 ＨＥＴＴＩＣＨ 公
司）；细胞培养瓶（美国ＣＯＲＮＩＮＧ公司）；ＮＵＮＣ９６
孔板（广州新晋公司）。
材料：琼枝麒麟菜（海南省琼海市麒麟菜养殖
基地）；无水乙醇（广州化学试剂厂）；ＤＭＥＭ培养液
（美国Ｇｉｂｃｏ公司）；ＥＤＴＡ（美国ＡＭＲＥＳＣＯ公司）；
澳洲胎牛血清（美国 Ｈｙｃｌｏｎｅ公司）；ＤＭＳＯ（美国
Ｓｉｇｍａ公司）；ＭＴＴ粉末（美国Ｓｉｇｍａ公司）。
２　试验方法
２．１　多糖提取流程
琼枝麒麟菜用自来水冲洗干净，置于网筛上
控水至表面干燥，用粉碎机将其粉碎，８０目筛过
筛，得琼枝麒麟菜粉末（以下称原料）。按一定的
料液比（原料：水，ｇ·ｍＬ－１）在一定的温度下，用
超声仪（功率１００Ｗ）提取一定的时间，抽滤，得滤
液。浓缩至原体积的１／３，按浓缩液体积加入３倍
体积的９５％乙醇，置于４℃冰箱中过夜，离心，得
ＥＧＰ［３，８－１０］。
ＥＧＰ的提取率（％）＝ＥＧＰ质量／原料质量×
１００％。
２．２　单因素考察
２．２．１　提取温度的考察
以ＥＧＰ的提取率为指标，通过单因素考察提
取温度对提取率的影响，在２５、４０、６０和６５℃，料
液比１∶１００的条件下，原料１ｇ，根据２．１提取流
程，重复操作３次。
２．２．２　料液比的考察
以多糖的提取率为指标，通过单因素考察料
液比对提取率的影响，按１∶２５、１∶５０、１∶７５、１∶
１００，超声温度４０℃，原料１ｇ，根据２．１提取流
程，重复操作３次。
２．２．３　超声时间的考察
以多糖的提取率为指标，通过单因素考察提
取时间对提取率的影响，按３０、６０、９０、１２０ｍｉｎ，超
声温度４０℃的条件下，原料１ｇ，根据２．１提取流
程，重复操作３次。
２．３　正交试验［１０－１１］的设定
以ＥＧＰ的得率为指标，在单因素实验的基础
上选用Ｌ９（３４）正交试验对提取温度、料液比和超
声时间进行优化，从而优选出琼枝麒麟菜多糖的
最佳提取工艺，并在优化的最佳提取条件下再进
行３次验证实验。
２．４　超声提取ＥＧＰ的多糖含量测定
采 用 苯 酚－浓 硫 酸 法 进 行 多 糖 含 量 的 测
定［１１－１４］。
６期 王怀玲，等：琼枝麒麟菜多糖超声提取工艺及皮肤修复活性研究 ６７　
２．４．１　标准曲线的制作
称取分析纯葡萄糖１０．０ｍｇ溶于２５０．０ｍＬ
水，分别吸取０．４、０．６、０．８、１．０、１．２、１．６及１．８ｍＬ，
用水补至２．０ｍＬ；加入６．０ ％苯酚１．０ ｍＬ
及浓硫酸５．０ｍＬ，静置１０．０ｍｉｎ，摇匀，室温放置
２０．０ｍｉｎ后于４９０．０ｎｍ测定其吸光度（Ａｂｓ）；以
２．０ｍＬ水为空白对照按同样方法操作，横坐标为
多糖浓度（μｇ·ｍＬ
－１），纵坐标为吸光度值（Ａｂｓ），
做标准曲线。
２．４．２　ＥＧＰ多糖含量测定
吸取 ＥＧＰ溶液２．０ｍＬ（５．０ｍｇ／２５０ｍＬ
ＥＧＰ），按上述步骤操作测定吸光度，以标准曲线
计算ＥＧＰ多糖的含量。
２．５　ＥＧＰ皮肤修复活性的初步探究
２．５．１　ＥＧＰ对人永生化表皮细胞（ＨａＣａＴ）细胞
毒性［１５］研究（ＭＴＴ法）
取对数生长期的 ＨａＣａＴ细胞，每孔接种细胞
悬液１００μＬ于９６孔培养板中。３７℃、５％ＣＯ２培
养过夜。次日取出细胞板，弃上清，每孔分别加入
不同浓度的受试物（培养基稀释）１００μＬ，每一浓
度孔均做６复孔。对照组加入１００μＬ的培养基，
另做一孔不加细胞，只加培养液（比色时用此孔调
零）。外周加ＰＢＳ保持细胞培养板内部水分，在
３７℃、５％ＣＯ２条件下培养。于培养时间结束时，
依次在每孔中加入浓度为５ｍｇ·ｍＬ－１的 ＭＴＴ
溶液１０μＬ，继续孵育４ｈ。弃去孔中培养上清液
１００μＬ，再于每孔加入１００μＬ　ＤＭＳＯ充分震荡至
结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪上选择
５７０ｎｍ波长，测定各孔光吸收值（ＯＤ值）。
２．５．２　ＥＧＰ对人永生化表皮细胞（ＨａＣａＴ）细胞
增值研究（ＭＴＴ法）
取对数生长期的 ＨａＣａＴ细胞，铺板方法同
２．５．１。阳性对照组加入ｂＦＧＦ（２０ｎｇ·ｍＬ－１），
对照组加入１００μＬ的培养基，另做一孔不加细
胞，只加培养液（比色时用此孔调零）。在３７℃、
５％ＣＯ２条件下培养。于培养时间结束时，按照细
胞毒性实验中ＭＴＴ法进行以下步骤，最后在酶联
免疫检测仪上选择５７０ｎｍ波长，测定各孔光吸收
值（ＯＤ值）。
２．５．３　ＥＧＰ对 ＨａＣａＴ细胞创伤愈合的影响（细
胞划痕实验）
取 ＨａＣａＴ细胞预６孔板，待细胞１００％ 融
合，６孔板背面用笔画等距离横线，以１００μＬ枪头
在细胞单层纵向划痕，造成培养细胞创口模型，划
痕与所画横线交汇点附近观测。划痕后随机分组
（正常组、划痕组、实验组、阳性对照组），阳性对照
药物ｂＦＧＦ浓度为２０ｎｇ·ｍＬ－１，样品浓度选择
增殖效果最好的浓度。此时倒置显微镜照相作为
０ｈ，创口形成后６、１２、２４、４８ｈ分别照相，计算不
同时刻进入划痕内的细胞数。
３　结果与分析
３．１　超声温度对ＥＧＰ得率的影响
实验结果见图１。
图１　提取温度对ＥＧＰ提取率的影响
Ｆｉｇ．１　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｏｎ　ｔｈｅ
ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ＥＧＰ
　　由图１可知，ＥＧＰ得率随着超声温度的增加
而增加，且超过６０℃后，ＥＧＰ得率的增加不再明
显。
３．２　料液比对ＥＧＰ得率的影响
实验结果见图２。
图２　料液比对ＥＧＰ提取率的影响
Ｆｉｇ．２　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｏｌｉｄ－ｔｏ－ｓｏｌｖｅｎｔ　ｒａｔｉｏ　ｏｎ　ｔｈｅ
ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ＥＧＰ
　　由图２结果可知，增加料液比可提高ＥＧＰ的
提取率，且在１∶１００时提取率到达最高。
６８　 中　国　海　洋　药　物 ３３卷
３．３　超声时间对ＥＧＰ得率的影响
实验结果见图３。
图３　超声时间对ＥＧＰ提取率的影响
Ｆｉｇ．３　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ　ｔｉｍｅ　ｏｎ　ｔｈｅ
ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ＥＧＰ
　　由图３结果可知，ＥＧＰ得率随着超声时间的
增加而增加，但超声时间达到１２０ｍｉｎ后，ＥＧＰ得
率明显下降。
３．４　正交试验
通过对单因素实验结果进行分析，确定超声
提取时间、温度和料液比３个因素的较适宜的水
平范围。
为了进一步考察超声时间、超声温度和料液
比之间的交互影响，确定最佳提取工艺，拟用Ｌ９
（３４）正交试验进行进一步优化，其因素水平安排
见表１，正交实验结果与分析见表２，方差分析结
果见表３。
表１　正交试验因素水平表
Ｔａｂｌｅ　１　Ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ｃｒｉｔｉｃａｌ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒｓ
ｏｆ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ａｒｒａｙ　ｄｅｓｉｇｎ
水平
Ａ超声时间
／ｍｉｎ
Ｂ超声温度
／℃
Ｃ料液比
／ｇ·ｍＬ－１
１　 ３０　 ２５　 １∶５０
２　 ６０　 ４０　 １∶７５
３　 ９０　 ６０　 １∶１００
　　由表２极差分析和表３的方差分析结果可
知，影响ＥＧＰ提取率的因素主次顺序为超声温度
＞料液比＞超声时间，确定提取ＥＧＰ的最佳工艺
为Ａ１Ｂ３Ｃ３，即料液比为１∶１００，在６０℃下超声
３０ｍｉｎ。
表２　超声提取ＥＧＰ正交试验设计及结果
Ｔａｂｌｅ　２　 Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ
ｏｆ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ａｒｒａｙ　ｄｅｓｉｇｎ
试验号 Ａ　 Ｂ　 Ｃ　 ＥＧＰ提取率／％
１　 １　 １　 １　 １０．７
２　 １　 ２　 ２　 ２３．２
３　 １　 ３　 ３　 ３８．６
４　 ２　 １　 ２　 ２０．０
５　 ２　 ２　 ３　 ２４．６
６　 ２　 ３　 １　 ３０．９
７　 ３　 １　 ３　 １２．６
８　 ３　 ２　 １　 １８．８
９　 ３　 ３　 ２　 ３１．４
ｋ１　 ０．２４２　 ０．１４４　 ０．２０１
ｋ２　 ０．２５２　 ０．２２２　 ０．２４９
ｋ３　 ０．２０９　 ０．３３６　 ０．２５３
Ｒ　 ０．０４３　 ０．１９２　 ０．０５２
表３　方差分析表
Ｔａｂｌｅ　３　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｖａｒｉａｎｃｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ＥＧＰ
方差来源 偏差平方和 自由度 Ｆ比
Ｆ临界值
（ａ＝０．０５）
Ａ　 ０．００３　 ２　 ０．１７９　 ４．４６
Ｂ　 ０．０５６　 ２　 ３．３４３　 ４．４６
Ｃ　 ０．００５　 ２　 ０．２９９　 ４．４６
误差 ０．０７　 ８
３．５　验证实验
正交试验确定的最佳提取条件下进行从琼枝
麒麟菜中提取多糖的验证实验，实验重复３次，平
均提取率为４０．３％ ±１．８％（见表４）。说明该工
艺比较稳定，重现性较好。
表４　最佳提取条件下ＥＧＰ提取率
Ｔａｂｌｅ　４　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ＥＧＰ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
样品编号 ＥＧＰ提取率／％ Ｍｅａｎ±ＳＤ
１　 ４１．８
２　 ３８．５　 ４０．３±１．８
３　 ４０．５
３．６　ＥＧＰ多糖含量的测定
苯酚－硫酸法测定ＥＧＰ多糖含量的标准曲线
方程为ｙ＝０．０１９ｘ－０．０２３，ｒ２＝０．９９０，。对不同
温度下超声提取的ＥＧＰ进行多糖含量测定，进行
３次试验，得到多糖含量见表５。
表５　ＥＧＰ的多糖的含量
Ｔａｂｌｅ　５　Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ＥＧＰ
样品编号 ＥＧＰ提取率／％ Ｍｅａｎ±ＳＤ
１　 ４６．７
２　 ４３．４　 ４８．２±４．６
３　 ５２．９
６期 王怀玲，等：琼枝麒麟菜多糖超声提取工艺及皮肤修复活性研究 ６９　
３．７　ＥＧＰ的皮肤创伤修复探讨
３．７．１　ＥＧＰ对 ＨａＣａＴ细胞的毒性
分析结果如图４可知，ＥＧＰ对ＨａＣａＴ毒性极
小，在高达１ｍｇ·ｍＬ－１时仍有约７５．０％以上细
胞存活，且细胞状态良好。
图４　细胞毒性实验
Ｆｉｇ．４　Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｔｅｓｔ
３．７．２　ＥＧＰ对细胞的促增殖效果
由图５ａ可知，ＥＧＰ对 ＨａｃａＴ细胞增殖效果
的影响，可以观察到细胞增值率的提高呈现先上
升后下降的趋势。ＥＧＰ在浓度为３５．０μｇ·ｍＬ
－１
时对细胞的促增殖效果最明显，其增长率达到
１４５．８％，与阳性对照生长因子的细胞生长率相近
（１４４．６％，图５ｂ），增殖作用明显，故接下来对其
增殖效果的进一步评价选用最佳促增殖浓度
３５．０μｇ·ｍＬ
－１。
图５　细胞增殖实验
Ｆｉｇ．５　Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｃｅｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ
３．７．３　ＥＧＰ对 ＨａＣａＴ细胞创伤愈合的影响（细
胞划痕实验）
图６明显显示ＥＧＰ组和ｂＦＧＦ阳性对照组
的细胞划痕愈合效果高于正常对照组。观察各组
分别在０、６、１２、２４ｈ的划痕宽度，ＥＧＰ组和ｂＦＧＦ
组划痕宽度有明显变窄的趋势，可以看出其增殖
效果与阳性对照组作用接近。故由此可以得出，
ＥＧＰ可促进 ＨａＣａＴ细胞迁移融合，具有良好的
创伤愈合效果。
图６　细胞划痕实验
Ｆｉｇ．６　Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｓｃｒａｔｃｈ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｔｅｓｔ
４　结论
采用超声技术提取琼枝麒麟菜多糖，不仅能
够增加多糖类物质的提取率，还能够保持有效成
分的活性，减少水提时温度过高造成多糖成分结
构的改变。文中首先通过单因素实验验证提取温
度、料液比、超声时间对多糖提取率的影响，然后
采用正交试验设计得到最佳的提取条件：超声温
度６０℃，料液比为１∶１００，超声时间为３０ｍｉｎ，提
取率高达４０．３％。比传统的提取方法节约了资
源，减少提取工艺的时间。
７０　 中　国　海　洋　药　物 ３３卷
ＥＧＰ对ＨａＣａＴ细胞没有明显毒性，且在浓度
小于１５０μｇ·ｍＬ
－１时对其生长具有促进作用，其最
佳浓度在３５．０μｇ·ｍＬ
－１，其增殖率高达１４５．８％。
另外，划痕实验中ＥＧＰ可以在促进 ＨａＣａＴ细胞增
长的同时加速其进行融合迁移，初步证明ＥＧＰ对皮
肤创伤后细胞修复及创口愈合具有一定促进作用，
为ＥＧＰ在皮肤修复方面医疗器械及化妆品行业中
抗衰老产品中的应用提供了理论基础，也为麒麟菜
的开发奠定了一定的理论基础。
参考文献
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品工业，２０１２，３３（１２）：７５－７８．
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［３］　郭凌，包惠燕，叶绍明，等．琼枝麒麟菜和异枝麒麟菜硫酸多
糖及其水解产物的抑菌作用［Ｊ］．暨南大学学报（自然科学
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［４］　叶绍明，岑颖洲，张美英，等．麒麟菜硫酸酯多糖体外抗病毒
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ｄｕｃｅｄ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ　ｉｎ　ＲＡＷ　２６４．７ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ　ｂｙ　ｉｎｈｉｂｉ－
ｔｉｎｇ　ＮＦ－ｋａｐｐａＢ　ａｎｄ　ＭＡＰＫｓ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ＲＯＳ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
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