全 文 ：5 结论
经液相色谱 /离子阱质谱 (LC /MSD Trap)联
用分析，并通过数据库匹配、紫外吸收和二级质谱
分析，本实验对蒙药栀子中的化学成分进行结构鉴
定，结果确定了 9 个化合物，包括环烯醚萜类和有
机酸类，为今后对栀子的进一步研究、临床用药及
质量控制奠定了基础。
参考文献:
［1］ 布和巴特尔，奥·乌力吉． 传统蒙药与方剂［M］． 赤峰:内
蒙古科学技术出版社，2013:70．
［2］ 刘武占，范建伟，高艳红，等． HPLC 同时测定栀子中八个
环烯醚萜苷类成分的含量［J］． 中国中药杂志，2012，37
(16) :2417-2421．
［3］ 嘎拉沁·满都拉，上井幸司，汤口实，等． HPLC-MS /MS法
同时测定生药栀子主要成分［J］． 亚太传统医药，2014，10
(8) :27-29．
［4］ 蔡财军，张忠立，左月明，等． 栀子环烯醚萜类化学成分研
究［J］． 时珍国医国药，2013，24(2) :342-343．
［5］ 张忠立，左月明，罗光明，等． 栀子化学成分研究 (Ⅱ)
［J］． 中药材，2013，36(3) :401-403．
［6］ 毕志明，周小琴，李 萍，等． 栀子果实的化学成分研究
［J］． 林产化学与工业，2008，28(6) :67-69．
［7］ 王晓燕，张 丽，王添琦，等． 栀子化学成分的 UHPLC-Q-
TOFMS分析［J］． 中药材，2013，36(3) :407-410．
［8］ 傅小梅，侴桂新，王峥涛． 栀子的化学成分［J］． 中国天然
药物，2008，6(6) :418-420．
［9］ 刘 青，曹瑞军，赵 欣，等． 栀子水提物的 HPLC-ESI-
MSn分析［J］． 中成药，2007，29(11) :1651-1654．
［10］ 孟祥乐，李红伟，李 颜，等． 栀子化学成分及其药理作用
研究进展［J］． 中国新药杂志，2011，20(11) :959-967．
［11］ 孙捍卫，张凤梅，韩 磊，等． 栀子的化学成分研究［J］．
中医药信息，2014，31(2) :18-20．
［12］ 于维萍，傅春升，钟映莉，等． 栀子中环烯醚萜类化合物的
研究概况［J］． 山东中医杂志，2007，26(8) :579-581．
［13］ 杨全军，范明松，孙兆林，等． 栀子化学成分、药理作用及
体内过程研究进展［J］． 中国现代中药，2010，12(9) :
7-12．
［14］ 王 莎，周小琴，司徒少金，等． 栀子药材环烯醚萜类和西
红花酸类成分 HPLC指纹图谱研究［J］． 中国实验方剂学杂
志，2012，18(19) :85-88．
［15］ 刘海萍． 栀子的化学成分及其质量研究［D］． 北京:首都
师范大学，2007．
［16］ 廖 辉，王 林，单晓庆，等． 栀子中五个环烯醚萜苷的研
究［J］． 西南民族大学学报，2009，35(6) :1228-1232．
［17］ 曹 慧． 杜仲中降压活性成分的分离和表征研究［D］． 长
沙:中南大学，2005．
［18］ 解华东． 液质发酵食品紫外光谱特性研究及鉴真技术体系
建立［D］． 杨凌:西北农林科技大学，2010．
濒危药用植物三叶青 ISSＲ分子标记的建立
彭 昕1， 吉庆勇2， 李玉兰1* ， 张煜炯1
(1． 浙江医药高等专科学校，浙江 宁波 315100;2． 丽水市农业科学研究院，浙江 丽水 323000)
收稿日期:2014-08-07
基金项目:2013 年浙江省公益性技术资助项目 (2013C32103) ;2013 年浙江省教育厅高校科研项目 (Y201330174)
作者简介:彭 昕 (1980—) ，女，硕士，副教授，研究方向为药用植物分子生物学。E-mail:pengx@ mail． zjpc． net． cn
* 通信作者:李玉兰 (1963—) ，女，教授，研究方向为分子生物学。E-mail:LiyL@ mail． zjpc． net． cn
摘要:目的 对三叶青的简单重复序列-聚合酶链式反应 (ISSＲ-PCＲ)体系和扩增程序进行优化，并将其应用于野生
三叶青种质资源的遗传分子标记。方法 采用单因素试验，对三叶青 ISSＲ-PCＲ反应条件中的Mg2 +、dNTP、引物、模
板 DNA、TaqDNA聚合酶浓度和退火温度等因素进行筛选，之后结合正交试验来选择多态性高、重复性好的 ISSＲ 引
物。结果 建立了 ISSＲ-PCＲ 最佳反应体系，为 25 μL 反应体系中含有 2. 5 mmol /L Mg2 +、0. 2 μmol /L 引物、0. 25
mmol /L dNTP、50 ng DNA模板、0. 5U TaqDNA聚合酶，并利用 U810 等 16 条引物，初步构建了 15 份三叶青种质资源
的 ISSＲ指纹图谱，平均多态条带百分率达 57. 0%。结论 该反应体系的稳定性和多态性良好，可满足对三叶青野生
资源的遗传变异水平和结构分析的研究考察。
关键词:三叶青;ISSＲ;单因素试验;正交试验;遗传多样性
中图分类号:Ｒ284. 1 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2015)07-1507-08
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2015. 07. 024
7051
2015 年 7 月
第 37 卷 第 7 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
July 2015
Vol． 37 No． 7
Construction of ISSＲ molecular marker system for endangered plant Tetrastigma
hemsleyanum
PENG Xin1， JI Qing-yong2， LI Yu-lan1* ， ZHANG Yu-jiong 1
(1． Zhejiang Pharmaceutical College，Ningbo 315100，China;2． Lishui Academy of Agricultural Science，Lishui 323000，China)
ABSTＲACT:AIM To construct a proper ISSＲ-PCＲ reaction system and amplification process for germplasm of
wild Tetrastigma hemsleyanum． METHODS Single factor test was applied to the optimization of the influencing
factors，including annealing temperature，Mg2 + concentration，dNTP concentration，template DNA dosage，Taq
DNA polymerase dosage，primer concentration． Orthogonal design was applied to the selection of stable and repeat-
able ISSＲ primers． ＲESULTS The optimal reaction system for ISSＲ analysis contained 2. 5 mmol /L MgCl2，0. 2
μmol /L ISSＲ primers，0. 25 mmol /L dNTP，50 ng of template DNA，and 0. 5 U of Taq DNA polymerase in 25
μL total volume． Based on 16 primers such as U810，the molecular marker system of 15 samples of T． hemsleya-
num was established with more than 57. 0% of average polymorphic bands． CONCLUSION The ISSＲ-PCＲ reac-
tion system constructed in this study is highly polymorphic and has high reliability and stability，which could be
used to detect the genetic diversity and investigate the genetic structure of T． hemsleyanum．
KEY WOＲDS:Tetrastigma hemsleyanum;ISSＲ;single factor test;orthogonal design;genetic diversity
三叶青 Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg 是
我国特有的葡萄科崖爬藤属珍稀药用植物，主要分
布于浙江、广西、江西等少数省份［1］，以地下块
根或全草入药。它可用于治疗高热、肝炎、风湿性
关节炎及病毒性脑膜炎等多种疾病，而且其主要活
性成分黄酮对肝癌、肠癌、胃癌和血癌细胞株具有
促凋亡作用［2-3］。目前，三叶青的野生资源濒临灭
绝，亟待保护，其组培快繁和栽培技术虽已有一些
探索［4-7］，但技术尚未完全成熟，远不能满足临床
需求。研究物种居群间的遗传变异水平可为基因资
源保护策略的制定、品种鉴别、良种选育等提供科
学依据，而目前关于三叶青种质资源保护方面的研
究尚未见报道。
如今，在遗传多样性评价中使用最广泛的
DNA 标 记 技 术 有 ＲFLP、ＲAPD、 SSＲ、 ISSＲ、
AFLP、SＲAP 和 SNP。其中，简单重复序列 ISSＲ
(inter-simple sequence repeats)标记是利用锚定的
微卫星 DNA 为引物，在 SSＲ 序列的 3端或 5端加
上 2 ～ 4 个随机核苷酸，对锚定引物互补的间隔不
大的 SSＲ 基因片段进行聚合酶链式反应 (PCＲ)
扩增［7］。该技术具有操作简便、多态性好、重复
性高、无需预先知道任何靶序列的 DNA背景信息、
模板需要量少等优点，广泛应用于遗传图谱构建、
遗传多样性分析等方面的研究［8-10］，但作为一种基
于 PCＲ 技术的分子标记，其反应条件受到模板
DNA及 Taq DNA聚合酶用量、Mg2 +、dNTP、引物
浓度、退火温度等因素的影响，故为了实现分析结
果的可靠性和重复性，进行 ISSＲ-PCＲ反应体系的优
化是非常必要的。本实验利用单因子和正交试验相
结合的方法，对以上各因素进行系统研究，并筛选
出一批多态性好、重复性高的引物，建立了一套稳
定的三叶青 ISSＲ-PCＲ反应体系，并对其稳定性和重
复性进行了检测，为关于三叶青的遗传多样性分析
和物种保护研究奠定技术基础。
1 材料与仪器
1. 1 材料 所用试剂及 DNA Marker S plus (包括
100、250、500、750、1 000、1 500、2 000、3 000、
5 000 bp 9 个条带)均购自上海生工生物工程有限
公司;100 条 UBC 801-UBC900 ISSＲ引物 (加拿大
哥伦比亚大学公布其序列及编号) ，上海生工生物
工程有限公司合成。
本实验所用的三叶青药材均为野生品种，经丽水
市农科院吉庆勇高级农艺师和浙江医药高等专科学校
杨雄志教授鉴定为三叶青 Tetrastigma hemsleyanum
Diels et Gilg。然后，利用表 1中编号为 jx1的材料对
反应体系进行优化，并选取外观性状及居群生境差异
较大的 zj2、gx1 和 jx1 材料用于有效引物的筛选，
所有材料均用于优化后反应体系的稳定性检测。
1. 2 仪器 Eppendorf Master cycler PCＲ 仪 (德国
Eppendorf公司);Gel Doc XＲ +紫外凝胶成像分析仪、
Sub-Cell系统水平电泳槽 (美国 Bio-Ｒad 公司);高
速冷冻离心机 (浙江纳德科学仪器有限公司)。
8051
2015 年 7 月
第 37 卷 第 7 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
July 2015
Vol． 37 No． 7
表 1 材料来源
Tab. 1 Sources of materials
产地 编号 种源地 经纬度
浙江 zj1 浙江象山 121 ∶ 48E 29 ∶ 29N
zj2 浙江丽水 119 ∶ 55E 28 ∶ 27N
zj3 浙江东钱湖 121 ∶ 34E 29 ∶ 52N
zj4 浙江温岭 121 ∶ 22E 28 ∶ 22N
zj5 浙江温州 120 ∶ 39E 28 ∶ 01N
江西 jx1 江西上饶 117 ∶ 58E 28 ∶ 28N
jx2 江西赣州 114 ∶ 55E 25 ∶ 51N
jx3 江西九江 114 ∶ 46E 26 ∶ 28N
广西 gx1 广西田林 106 ∶ 14E 24 ∶ 19N
gx2 广西乐业 106 ∶ 34E 24 ∶ 47 N
湖南 hn1 湖南邵阳 111 ∶ 30E 27 ∶ 13N
hn2 湖南沅陵 112 ∶ 22E 28 ∶ 50N
hn3 湖南永顺 109 ∶ 50E 29 ∶ 00N
hn4 湖南益阳 112 ∶ 20E 28 ∶ 36N
hn5 湖南醴陵 113 ∶ 30E 27 ∶ 40N
2 方法
2. 1 植物材料采样及 DNA 提取 每种药材取样 5
株，每株取 4 ～6 g 新鲜叶片放入密封塑料袋，硅胶
干燥，冷藏于 － 80 ℃超低温冰箱中，供提取 DNA
用。总 DNA提取采用改良 CTAB 法［11］，0. 8%琼脂
糖凝胶电泳和核酸检测仪检查总 DNA的完整性及纯
度，并将其浓度稀释至 50 ng /μL备用。
2. 2 PCＲ 扩增及引物筛选 ISSＲ 原初扩增反应的
体系为 25 μL PCＲ反应体积中含 10 × Taq酶配套缓
冲液 2. 5 μL、MgCl2 2. 5 mmol /L、Taq酶 2U、模板
DNA 50 ng、引物 0. 3 μmol /L、dNTP 0. 1 mmol /L。
原初扩增程序为 95 ℃下预变性 5 min (95 ℃ 45 s、
50 ℃ 60 s、72 ℃ 60 s) ，进行 40 个循环，72 ℃下
延伸 10 min。PCＲ 产物经含有5 mg /L 溴化乙锭
(EB)的 2%琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外凝胶成
像分析仪内观察并拍照。
2. 2. 1 单因素试验 先根据原初的 PCＲ 反应条件
进行引物初筛，选择能看到清晰条带的引物 U810
(序列为 GAG AGA GAG AGA GAG AT) ，对其退火
温度 (采用梯度 PCＲ 仪自动生成的 8 个梯度)、
Mg2 +浓度、引物浓度、dNTP 浓度、模板 DNA 量、
TaqDNA聚合酶用量这 6 个因素逐一设计单因素试
验，见表 2。在对某单一因素进行试验时，其他因
素均保持不变，以探讨各因素对反应体系的影响，
并筛选出最佳条件，每个试验重复 3 次。
表 2 单因素试验中所采用的各因素和水平 (25 μL反应体
系)
Tab. 2 Single factor test design for the factors and levels of
ISSＲ-PCＲ reaction
因素 水平
退火温度 /℃ 45、45. 8、47. 3、49. 4、51. 8、53. 8、55. 3、56
Mg2 +浓度 /(mmol·L －1) 0. 5 1 2 3
引物浓度 /(μmol·L －1) 0. 05 0. 1 0. 2 0. 3
dNTP /(mmol·L －1) 0. 05 0. 1 0. 2 0. 3
模板 DNA量 /ng 25 50 75 100
TaqDNA聚合酶 /U 0. 5 1 2 3
2. 2. 2 正交试验 优化 PCＲ 反应体系时采用
L9(3
4)设计，根据 “2. 2. 1”项下方法初步筛选合
理的范围，对 Mg2 +、引物、dNTP 和模板 DNA 进
行 4 因素 3 水平筛选，见表 3。本试验设计 9 个处
理，每个处理重复 3 次，利用 Quantity one 分析软
件，并按照特异性条带强弱，对试验结果进行标记
处理。其中，条带数量丰富、清晰度高、特异条带
最强的记为 1 分，最差的记为 9 分，其他情况与其
相比，取整数值，从低到高依次打分［12-13］。
表 3 ISSＲ-PCＲ 反应 L9(3
4)正交设计
Tab. 3 L9(3
4)orthogonal design for the factors and levels of ISSＲ-PCＲ reaction
处理组合
因素 得分
Mg2 +浓度 /(mmol·L －1) 引物浓度 /(μmol·L －1) dNTP /(mmol·L －1) 模板 DNA量 /ng 重复 1 重复 2 重复 3
1 2. 5 0. 15 0. 15 50 5 5 4
2 2. 5 0. 2 0. 2 75 2 3 2
3 2. 5 0. 25 0. 25 100 3 1 3
4 3 0. 15 0. 2 100 4 4 5
5 3 0. 2 0. 25 50 1 2 1
6 3 0. 25 0. 15 75 7 6 6
7 3. 5 0. 15 0. 25 75 6 7 7
8 3. 5 0. 2 0. 15 100 8 8 9
9 3. 5 0. 25 0. 2 50 9 9 8
2. 2. 3 引物筛选 采用 “2. 2. 2”项下优化的扩
增条件 (除退火温度项需对每个引物逐一筛选
外) ，对 100 条 ISSＲ 引物进行筛选。以扩增出的
条带数量多、多态性好、清晰度高、重复性好为原
则，确定有效引物。
2. 3 体系稳定性验证及 ISSＲ 图谱建立 将
“2. 2. 3”项方法筛选出的引物采用 “2. 2. 2”项下
优化的扩增条件，对 15 份三叶青材料反应体系的
9051
2015 年 7 月
第 37 卷 第 7 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
July 2015
Vol． 37 No． 7
稳定性进行验证，每个材料重复 3 次，建立 ISSＲ-
PCＲ扩增图谱。
3 结果与分析
3. 1 单因素试验结果 本实验先根据原初的 PCＲ
反应条件进行引物初筛，选择能看到清晰条带的引
物 U810 来确定退火温度，其对扩增结果的影响见
图 1。由图可知，虽然各温度均能扩增出条带，但
其数量及清晰度有明显区别。45 ℃时虽然能扩增
出较多条带，但均非常弥散;53. 8 ～ 56 ℃时虽然
一些条带亮度增加，但中分子质量区的条带数明显
减少，之间出现弥散现象，而且大分子质量区出现
了一些非特异性弱带，背景较高;49. 4 ～ 51. 8 ℃
时扩增出的条带数量最多，而且其清晰度和亮度较
高。考虑到较高退火温度有利于减少杂带的产生，
因此本实验选择 52 ℃为引物 U810 用于三叶青 IS-
SＲ扩增的最佳退火温度。
确定退火温度后，逐一改变 Mg2 +浓度、引物
浓度、dNTP浓度、模板 DNA 量、TaqDNA 聚合酶
用量这 5 种因素的水平，结果见图 2。由图可知，
当 Mg2 +浓度小于 2 mmol /L 时，不能扩增出条带;
浓度为 3 mmol /L 时，扩增出的条带多，而且背景
清晰。当 dNTP浓度上升时，其 PCＲ扩增产物的量
增加，但达到 0. 3 mmol /L 时，高分子质量区的主
注:1 ～ 8 泳道退火温度分别为 45 ℃、45. 8 ℃、47. 3 ℃、49. 4 ℃、
51. 8 ℃、53. 8 ℃、55. 3 ℃、56 ℃，M为 DNA marker
图 1 退火温度对三叶青 ISSＲ扩增的影响
Fig. 1 Effect of annealing temperature on T． hemsleyanum
ISSＲ amplification
带旁边出现 1 条杂带，因此选择 0. 2 mmol /L 为最
佳浓度。当引物浓度低于 0. 2 μmol /L 时，虽然扩
增出的条带较清晰，但中等及低相对分子质量区扩
增出的条带数目明显减少，亮度降低，而且高分子
质量区出现较多杂带;浓度为 0. 3 μmol /L 时，低
分子质量区出现疑似引物二聚体的杂带，因此选择
0. 2 μmol /L的引物浓度为 PCＲ 反应体系的最佳浓
度。当模板 DNA 用量在 50 ～ 75 ng 时，条带数目
最多，清晰度高;用量在 50 ng 以下时，条带清晰
度和产量明显提高;用量在 100 ng 时，扩增产物
的产量虽然也明显提高，但高分子及低分子质量区
分别出现 1 条非特异性杂带。
注:M为 DNA marker;1 ～ 4 为 0. 5、1、2、3 mmol /L Mg2 +;5 ～ 8 为 0. 05、0. 1、0. 2、0. 3 mmol /L dNTP;9 ～ 12 为 0. 05、0. 1、
0. 2、0. 3 μmol /L引物;13 ～ 16 为 25、50、75、100 ng模板 DNA
图 2 Mg2 +、引物、dNTP和模板 DNA浓度对三叶青 ISSＲ扩增的影响
Fig. 2 Effect of Mg2 +，dNTP，primer and template DNA concentration on T． hemsleyanum ISSＲ amplification
从图 3 可以清晰地看出，在所选择的 4 个浓度
范围内，Taq 酶对条带数量及清晰度没有明显影
响，故从实验成本考虑，选择 0. 5 U为最佳用量。
3. 2 PCＲ正交设计结果 图 4 为正交设计 ISSＲ扩
增结果，用 SPSS 13. 0 统计软件对其进行方差分
析，见表 4。由表可知，Mg2 +浓度、dNTP、引物浓
度对实验结果有显著影响 (P ＜ 0. 05) ，而模板
DNA浓度的影响不明显 (P ＞ 0. 05)。均方差结果
显示，这 4 个因素对其影响的主次顺序依次为
Mg2 +浓度 ＞ dNTPs ＞ 引物浓度 ＞ DNA 模板浓度，
与极差分析的结果相同。然后，进一步对各因素的
不同水平进行多重比较，发现 Mg2 +浓度在 3 个水
平之间的差异均有统计学意义，P 值分别为 0. 011
(2. 5 和 3. 0 mmol /L 之间)、0. 000 (2. 5 和 3. 5
mmol /L 之间)和 0. 000 (3. 5 和 2. 5 mmol /L 之
间) ，结合表 5 中的 PCＲ结果均值可知，Mg2 +浓度
0151
2015 年 7 月
第 37 卷 第 7 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
July 2015
Vol． 37 No． 7
注:M为 DNA marker;1 ～ 4 为 0. 5、1、2、3U TaqDNA聚合酶
图 3 Taq DNA聚合酶对三叶青 ISSＲ扩增的影响
Fig. 3 Effect of Taq DNA polymerase dosage on T． hems-
leyanum ISSＲ amplification
在 2. 5 mmol /L下最适合;引物浓度在 0. 2 μmol /L
时，与其他两个水平之间有显著差异，P 值分别为
0. 000 (0. 2 和 0. 25 μmol /L 之间)和 0. 001 (0. 2
和 0. 15 μmol /L之间) ，结合表 5 可知，引物浓度
在 0. 2 μmol /L下最适合;dNTP浓度在 3 个水平间
均有显著性差异，P 值均为 0. 000，结合表 5 中可
知，dNTP浓度 0. 25 mmol /L 下最适合。同时，模
板 DNA浓度在 3 个水平间均无显著性差异，P 值
分别为 0. 728 (50 和 100 ng、75 和 100 ng 之间)、
0. 489 (50 和 75 ng 之间)。综上所述，Mg2 +浓度
2. 5 mmol /L、引物浓度 0. 2 μmol /L、dNTPs 浓度
0. 25 mmol /L、DNA模板浓度 50 ～ 100 ng为三叶青
ISSＲ-PCＲ的最佳反应体系。
表 4 正交试验中各因素方差分析
Tab. 4 Analysis of variance for factors of orthogonal design
变异来源 自由度 均方 F值 显著水平
Mg2 +浓度 2 58. 111 130. 75* 0. 000
引物浓度 2 7. 444 16. 75* 0. 000
dNTPs 2 20. 333 45. 75* 0. 000
DNA模板浓度 2 0. 111 0. 250 0. 781
误差 18 0. 444
注:* P ＜ 0. 05
表 5 各因素不同处理水平结果均值差异显著性
Tab. 5 Significance among the means of different factor levels
水平
因素
Mg2 +浓度 /
(mmol·L －1)
引物浓度 /
(μmol·L －1)
dNTP /
(mmol·L －1)
模板 DNA
量 /ng
1 3. 11a 5. 22a 6. 44a 4. 89a
2 4b 4b 5. 11b 5. 11a
3 7. 89c 5. 78a 3. 44c 5a
注:aP ＜ 0. 05;bP ＜ 0. 05;cP ＜ 0. 05
注:M为 DNA marker;1 ～ 9 分别对应表 3 中的实验组合 1 ～ 9
图 4 L9(3
4)正交设计 ISSＲ扩增结果
Fig. 4 Electrophoresis of L9(3
4)orthogonal design
3. 3 体系稳定性验证及 ISSＲ图谱多态性分析 经
筛选确定的有效引物见表 6，而且从图 5 和图 6 可
知，U810 和 U811 引物能从表 1 所列的 15 份种质
材料中扩增出清晰度高、多态性丰富、重复性好的
DNA条带，表明优化后的 ISSＲ-PCＲ反应体系稳定
可靠，在此基础上，以扩增出的条带数量多、多态
性好、清晰度高、重复性好为原则，从 100 个 IS-
SＲ引物中筛选出 16 个扩增稳定、多态性高的引物
(表 6)。同时，它们又共扩增出 135 个条带，长度
为 200 ～ 2 000 bp，每条引物平均产生 8. 4 个条带，
其中多态性带 77 条，平均多态率达 57. 0%。由此
可知，ISSＲ 指纹能在居群水平中提供适量的多态
性，可满足对三叶青资源遗传多样性、遗传结构分
析和种质资源鉴定的研究考察。
1151
2015 年 7 月
第 37 卷 第 7 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
July 2015
Vol． 37 No． 7
表 6 筛选出的三叶青 ISSＲ标记分析的引物序列及其扩增结果
Tab. 6 Primer sequence screened for ISSＲ analysis of T． hemsleyanum and their amplification results
引物 5→3 引物序列 扩增条带数 /个 多态性条带数 /个 多态性条带百分率 /% 退火温度 /℃
U807 AGAGAGAGAGAGAGAGT 9 5 55. 6 53
U810 GAGAGAGAGAGAGAGAT 11 9 81. 8 52
U811 GAGAGAGAGAGAGAGAC 15 12 80. 0 56
U815 CTCTCTCTCTCTCTCTG 8 3 37. 5 56
U835 AGAGAGAGAGAGAGAGYC 6 2 33. 3 56
U827 ACACACACACACACACG 8 6 75. 0 56
U825 ACACACACACACACACT 9 4 44. 4 52
U817 CACACACACACACACAA 9 3 33. 3 50
U846 CACACACACACACACAＲT 13 10 76. 9 54
U855 ACACACACACACACACYT 13 10 76. 9 55
U822 TCTCTCTCTCTCTCTCA 7 3 42. 9 50
U848 CACACACACACACACAＲG 6 3 50. 0 54
U856 ACACACACACACACACYA 7 2 28. 6 53
U868 GAAGAAGAAGAAGAAGAA 4 1 25. 0 49
U889 DBDACACACACACACAC 5 2 40. 0 53
U842 GAGAGAGAG AGAGAGAYG 5 2 40. 0 55
注:Y为碱基 C或 T;Ｒ为碱基 A或 G;B为碱基 C、G或 T;D为碱基 A、G或 T。
注:M为 DNA marker;1 ～ 15 分别对应于表 1 中的各个样品
图 5 引物 U810 对 15 份三叶青 DNA扩增结果
Fig. 5 Amplification results of 15 DNA samples from T． hemsleyanum with primer U810
注:M为 DNA marker;1 ～ 15 分别对应于表 1 中的各个样品
图 6 引物 U 811 对 15 份三叶青 DNA扩增结果
Fig. 6 Amplification results of 15 DNA samples from T． hemsleyanum with primer U811
4 讨论
ISSＲ是在基因组中由 1 ～ 6 个核苷酸组成的，
基本单位重复多次构成的 DNA 无意义区域片段，
广泛分布于基因组的不同位置，容易受气温、日照
2151
2015 年 7 月
第 37 卷 第 7 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
July 2015
Vol． 37 No． 7
等环境条件的影响而出现变异，并且进化变异速度
快，蕴含的多态性位点多，具有很高的多态性检测
效率［8］。目前，ISSＲ 分子标记技术被广泛应用于
遗传多样性的评价［14］、品种鉴别［15］、指纹图谱库
建立［16］、物种间亲缘关系及系统进化［17］等领域。
PCＲ 扩增容易受到 Mg2 +、引物、dNTP、DNA
模板的浓度与纯度，以及扩增程序等诸多因素影
响。Mg2 +浓度过低会降低 Taq 酶活性，而过高则
会引起非特异性扩增，而且它还能与体系中的
dNTP、引物、模板结合，影响模板与引物的结合
率，产生非特异性条带［12］，本实验也发现 Mg2 +是
对扩增结果影响最大的因素，这与东方百合 ISSＲ
反应体系相似［18］。dNTP 是 PCＲ 反应中的原料，
浓度过低导致扩增产量不足，而浓度过高则导致
PCＲ 错配，出现非特异性扩增，而且会对 Mg2 +产
生拮抗作用，使反应中的有效 Mg2 +浓度下降，从
而影响聚合酶活力［19］，本实验中 dNTP 浓度上升
时，其 PCＲ 扩增产物随之增加，但浓度达到 0. 3
mmol /L时产生非特异性扩增。一般认为，引物浓
度过低时，扩增的条带较弱，数量也比较少，但浓
度过高时会产生引物二聚体和非特异性扩增［18］，
但本实验中引物浓度过低时也产生了非特异性扩
增，推测可能是因为过低的引物浓度与模板目标片
段结合的竞争力不足，扩大了引物在基因组上配对
的随机性，从而形成了一些分子质量较大的非特异
性产物。研究［18，20-21］表明，模板 DNA 的浓度适用
范围较宽，对 ISSＲ-PCＲ 反应的影响不大，25 ～
200 ng之间均能扩增出较清晰的条带，本实验中虽
然 DNA 模板浓度在一定范围内对条带的产量及多
态性影响不大，但浓度达到 100 ng 时会产生非特
异性扩增，与夏枯草 ISSＲ-PCＲ 反应体系［13］相似，
而且在所选择的用量范围内，Taq 酶对 PCＲ 产物
量及条带数量几乎没有影响，这与一些研究［12，19］
相一致，而东方百合 ISSＲ体系［18］中的 Taq 酶对结
果影响非常显著，可能与所使用酶的生产质量等因
素有关。一般认为，退火温度过高时，引物不能与
模板牢固结合，DNA 扩增效率下降，产生的条带
较少;温度过低时，可造成引物与模板错配，非特
异性产物增加［12］。本实验发现，退火温度过低时，
条带弥散，目标产物的产量低，而退火温度过高
时，虽然产生的条带有一部分缺失，但同时也出现
个别非特异性条带。在实际操作过程中，一般参考
引物理论 Tm值来确定最佳退火温度，但同一引物
对于不同物种时，退火温度可能不同，甚至差异较
大，如瓜蒌 ISSＲ分析时［22］，引物 810 所采用的退
火温度为 53. 6 ℃;王玉山等［23］用引物 810 对长叶
红砂 ISSＲ分析时发现，最佳退火温度为 48 ℃;本
实验三叶青 ISSＲ 体系中，引物 810 的最佳退火温
度为 52 ℃。因此，退火温度需要在参考引物理论
Tm值的基础上加以适当调整，以期得到稳定可靠
的实验结果。
与多因素试验相比，单因素试验可较为直观地
分析各因素对试验结果的影响，易筛选出各因素的
最佳水平，但可能会遗漏各因素之间的互作效应，
根据其优化组合而形成的试验体系可能在某种程度
上偏离真正的最佳条件［19］。而且，单因素试验无
法考察各因素不同水平对扩增结果影响的差异显著
性，而正交试验设计在同时检验多个因素的同时，
能缩小试验规模，并可通过方差分析来统计各因素
对结果影响的差异，但仍存在对各种因素的水平设
计是否适当以及对试验结果进行评价时有较大主观
性等局限。因此，本实验结合单因素和正交两种试
验设计，先通过单因素试验来选定各因素的适宜水
平范围，然后参照选出的水平范围进行正交设计，
从而筛选出最佳反应体系。结果发现，ISSＲ 指纹
图谱能够在居群水平上提供丰富的多态性，表明经
过优化后建立的 ISSＲ-PCＲ 反应体系具有较好的稳
定性，可以满足对三叶青野生资源的遗传变异水平
和结构分析的研究考察。
参考文献:
［1］ 韦树根，董青松，韦 莹，等． 广西濒危珍稀中药材三叶青
资源调查研究［J］． 北方园艺，2011，(21) :162-164．
［2］ Xu C J，Ding G Q，Fu J Y，et al． Immunoregulatory effects of
ethyl-acetate fraction of extracts from Tetrastigma hemsleyanum
Diels et． Gilg on immune functions of ICＲ mice［J］． Biomed
Environ Sci，2008，21(4) :325-331．
［3］ 王小莉，曾 娟，周 辉． 三叶青提取物对肺癌细胞株
A549 的影响［J］． 肿瘤药学，2012，2(5) :347-349．
［4］ Dai Y J，Shen Z G，Liu Y，et al． Effects of shade treatments on
the photosynthetic capacity，chlorophyll fluorescence，and chlo-
rophyll content of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg［J］．
Environ Exp Bot，2009，65(2-3) :177-182．
［5］ 彭 昕，张 剑，何军邀，等． 三叶青松散型和致密型愈
伤组织悬浮培养及黄酮积累的比较研究［J］． 中草药，
2012，43(3) :577-580．
［6］ Peng X，Zhou S L，He J Y，et al． Influence of rare earth ele-
ments on metabolism and related enzyme activity and isozyme
expression in Tetrastigma hemsleyanum cell suspension cultures
［J］． Biol Trace Elem Ｒes，2013，152(1) :82-90．
［7］ Zietkiewicz E，Ｒafalski A，Labuda D． Genome fingerprinting
3151
2015 年 7 月
第 37 卷 第 7 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
July 2015
Vol． 37 No． 7
by simple sequence repeat (SSＲ)-anchored polymerase chain
reaction amplification［J］． Genomics，1994，20(2) :176-183．
［8］ Wang Z，Wang J E，Wang X M，et al． Assessment of genetic
diversity in Galega officinalis L． using ISSＲ and SＲAP markers
［J］． Genet Ｒesour Crop Evol，2012，59(5) :865-873．
［9］ 郑道君，谢良商，曾建华，等． 海南龙血树 ISSＲ-PCＲ 反应
体系建立与有效引物筛选［J］． 热带亚热带植物学报，
2011，19(2) :177-183．
［10］ 陈大霞，王 钰，张 雪，等． ISSＲ分析 3 种类型黄连的遗
传多样性和遗传结构［J］． 中草药，2012，43(8) :1595-1598．
［11］ Wang M，Oppedijk B J，Lu X，et al． Apoptosis in barley aleu-
rone during germination and its inhibition by abscisic acid［J］．
Plant Mol Biol，1996，32(6) :1125-1134．
［12］ 孙清信，陈 坚，张 辉，等． 紫云英 ISSＲ 引物的筛选及
PCＲ 反应体系的优化［J］． 植物遗传资源学报，2012，13
(5) :870-878．
［13］ 廖 丽，郭巧生． 夏枯草 ISSＲ分子标记技术的建立与体系
优化［J］． 中草药，2009，40(7) :1131-1135．
［14］ 卜 静，王冬梅，李登武． 不同产地野生玉竹种质资源多样
性与亲缘关系的 ISSＲ 分析［J］． 中草药，2012，43(9) :
1824-1828．
［15］ 王 翀，周天华，杨 雪，等． ISSＲ-PCＲ 鉴别绞股蓝属 7
种植物［J］． 中草药，2008，39(4) :588-5911．
［16］ 张 林，徐迎春，成海钟，等． 基于 ISSＲ 标记的 62 个朱顶
红品种的遗传关系分析及指纹图谱构建［J］． 植物资源与
环境学报，2012，21(4) :48-54．
［17］ 徐晓波，蒋冬花，李 杰，等． 应用 ISSＲ 分子标记探讨酵
母菌种间亲缘关系［J］． 浙江师范大学学报:自然科学版，
2010，33(1) :89-94．
［18］ 丁信誉，邱 帅，席梦利，等． 东方百合 ISSＲ-PCＲ 反应体
系的正交优化［J］． 南京林业大学学报:自然科学版，
2012，36(5) :42-46．
［19］ 李娟玲，刘国民，曹嵩晓，等． 利用单因子和正交设计双重
实验法优化鹧鸪茶 ＲAPD-PCＲ 反应体系［J］． 农学学报，
2011，4(6) :14-21．
［20］ 陈莉娉，张小平，李晓红． 青檀 SＲAP-PCＲ体系优化设计方
案［J］． 生物学杂志，2012，29(5) :87-91．
［21］ 桂腾琴，孙 敏，乔爱民，等． 正交设计优化果梅 ISSＲ 反
应体系［J］． 果树学报，2009，26(1) :108-112．
［22］ 王真真，韩琳娜，郭庆梅，等． 瓜蒌 ISSＲ-PCＲ 最佳反应体
系的研究［J］． 辽宁中医杂志，2013，40(10) :2094-2096．
［23］ 王玉山，张颖娟． 濒危植物长叶红砂 ISSＲ扩增条件的优化
与引物筛选［J］． 内蒙古师范大学学报:自然科学版，
2008，37(3) :417-421．
葛根异黄酮类成分对缺氧复氧损伤心肌细胞保护作用的研究
包永睿1，2，3， 王 帅1，2，3， 杨欣欣1，2，3， 孟宪生1，2，3
*
， 蔡 琳1
(1． 辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600;2． 辽宁省组分中药工程技术研究中心，辽宁 大连
116600;3． 辽宁省现代中药研究工程实验室，辽宁 大连 116600)
收稿日期:2014-08-20
基金项目:十一五“重大新药创制”科技重大专项项目 (2010ZX09401-304-515) ;沈阳市科技计划项目 (F12-146-9-00)
作者简介:包永睿 (1978—) ，男，硕士，实验师，从事中药质量分析及作用机制研究工作。Tel: (0411)85890185，E-mail:byr1026
@ 163． com
* 通信作者:孟宪生 (1964—) ，男，博士，教授，从事中药组分配伍、代谢组学及药品质量分析工作。Tel: (0411)85890185，E-
mail:mxsvvv@ 126． com
摘要:目的 建立葛根异黄酮类成分的 HPLC指纹图谱，分析其对心肌细胞缺氧复氧损伤保护作用的相关性。方法
HPLC-TOF-MS法对葛根异黄酮各指纹峰进行辨认，并考察不同剂量葛根异黄酮给药组对乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤
的保护作用，然后采用灰色关联分析法将峰面积和细胞存活率药效数据相关联。结果 从 HPLC指纹图谱中鉴定出 7
个葛根异黄酮类成分，分别为葛根素、3-羟基葛根素、葛根素木糖苷、3-甲氧基葛根素、葛根素-7-木糖苷、大豆苷
和大豆苷元，这些成分的药效并无很大差异，相关系数最大值葛根素 (0. 761 4)与最小值大豆苷 (0. 670 8)之间相
差不到 0. 1。结论 葛根异黄酮保护缺氧复氧损伤心肌细胞的作用可能是通过多组分协同而发挥疗效。
关键词:葛根异黄酮;HPLC;心肌细胞;缺氧复氧损伤;灰色关联分析法;相关性
中图分类号:Ｒ284. 1 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2015)07-1514-04
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2015. 07. 025
Protective effect of pueraria isoflavones on myocardial cell with hypoxia /reoxy-
genation injury
4151
2015 年 7 月
第 37 卷 第 7 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
July 2015
Vol． 37 No． 7