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·中药与天然药物·
三叶青抗肿瘤活性部位的筛选研究
丁　丽 ,纪其雄(浙江医药高等专科学校 宁波 315100)
摘要:目的　研究三叶青乙醇提取物及其不同溶剂萃取部分对不同肿瘤细胞的体外抑制作用 ,筛选三叶青抗肿瘤活性部位。方法　采用四甲
基偶氮唑盐(MT T)比色法。结果　三叶青乙醇提取物和其 4个提取部位对肿瘤细胞均有不同程度的抑制作用。其中 ,三氯甲烷部位和石油醚
部位在一定浓度下可有效抑制肿瘤细胞的活性 ,乙酸乙酯部位和正丁醇部位对肿瘤细胞的抑制作用均较弱。结论　三叶青中抗肿瘤的活性部
位是三氯甲烷部位和石油醚部位 ,而且其对不同肿瘤细胞的体外抑制作用呈一定的浓度依赖作用。
关键词:三叶青;抗肿瘤活性;体外抑制
中图分类号:R285.5　文献标识码:A　文章编号:1006-3765(2011)-12-0046-03
作者简介:丁　丽 ,女(1979-)。硕士学位 ,讲师 ,主要从事中药药效
物质基础研究工作。 联系电话:15968466128 , E-mai l:dingl @
mail.zjpc.net.cn
基金项目:浙江医药高等专科学校校级科研课题(ZPCSR2008005)
Study preliminary on the anti-tumor effect of the extract of Tetrastigma
hemsleyanum Diels et.Gilg
DINGLi , JI Qi-xiong(Zhejiang Pharmaceutical College ,Ningbo 315100 ,China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　To estimate the anti-tumo r activi ty of the ext ract of Tet rastigmatis hemsleyani Diels
et Gilg.METHODS　It w as measured by methy l thiazolyltet razolium (MTT)colorimetric assay to screen the an-
ti-tumor ef fect of the ex tracts of Tetrastigmatis hemsleyani Diels et Gilg on dif ferent tumor cell lines in vit-
ro.RESULTS　The alcohol ex tract and four f raction f rom Tetrastigmatis hemsleyani Diels et Gilg had variable in-
hibitory effect on different tumor cell lines.Chlo roform part and petroleum ether part had mo re remarkable anti-
tumo r activity in vit ro than ethyl acetate part and 1-Butanol part.CONCLUSION　Chloroform part and petroleum
ether part ,which are considered as active parts of Tetrast igmatis hemsleyani Diels et Gilg , had a significant inf lu-
ence on cell activi ty in a dose-dependent manner.
KEY WORDS:Tetrastigmatis hemsleyani Diels et Gilg;Anti-tumo r activity;;The inhibition of proliferation in vitro
　　三叶青(Tetrastigma tis hemsleyani), 又名:有角乌蔹莓 、石
老鼠 , 为葡萄科崖爬藤属植物三叶崖爬藤(Tetrastigmatis
hemsleyani Diels et G ilg)。三叶青具有清热解毒 、祛风化痰 、活
血止痛的功效 , 在浙江地区应用非常广泛 , 在民间常被用来治
疗小儿惊厥高热 、肺炎 、支气管炎 、咽喉炎 、痢疾 、肝炎 、病毒性
脑膜炎 、瘰疬 、痈疔疮疖等症〔1〕。作为民间的常用药 , 三叶青
越来越受到重视 , 对其研究逐年增多 ,药理实验表明三叶青提
取物除了具有解热镇痛消炎 、抗病毒及保肝作用外〔2 ～ 5〕 ,还可
抑制肿瘤细胞的增殖和诱导其凋亡〔6 ～ 9〕。本研究主要讨论三
叶青乙醇提取物及其不同溶剂萃取部位对不同肿瘤细胞的体
外抑制作用 , 初步确定其抗肿瘤的活性部位 , 为进一步研究三
·46·
海峡药学　2011年　第 23卷 第 12期
叶青的抗肿瘤有效成分提供实验依据。
1　材料
1.1　药物　三叶青饮片产自云南 , 购自宁波鄞州医药药材公
司 ,经鉴定为 Tetrastigma hemsleyanum Diels et.Gilg。三叶青
饮片 , 95%乙醇回流提取 3 次 , 每次 1h , 60%乙醇乙醇回流提
取 3 次 ,每次 1h , 合并提取液 ,过滤 ,减压浓缩得乙醇浸膏 , 用
少量水将乙醇浸膏分散 ,依次用石油醚 、三氯甲烷 、乙酸乙酯 、
正丁醇萃取 ,回收溶剂后 , 得到石油醚部位 、三氯甲烷部位 、乙
酸乙酯部位 、正丁醇部位。
1.2　试剂与仪器　MTT〔3-(4 , 5-Dimethylthiazol-2-y l)-2 , 5-
dipheny ltetrazolium bromide〕 ,美国 Amresco 公司 ,批号 ;RPMI
1640培养液 , 美国 I nvitrogen 公司 , 批号:20100306;胎牛血
清:上海蓝季科技发展有限公司 , 批号:20100524;胰岛素:上
海蓝季科技发展有限公司 , 批号:20091229;5-氟尿嘧啶注射
液:天津金耀氨基酸有限公司 , 批号:20100610。酶标仪 , 美国
Bio-Rad 公司;倒置生物显微镜 , Motic 实业集团有限公司;
CO2 培养箱 ,力康生物医疗科技控股有限公司。
1.3　细胞株　人宫颈癌细胞株 Hela 229 、人胃腺癌细胞株
AGS 、人恶性黑色素瘤细胞株 A375 和人膀胱癌细胞株 5637
均购自上海中科院细胞生化所。
2　方法
2.1　三叶青提取物溶液制备　取三叶青乙醇提取物适量 ,用
1mL DMSO 溶解 , 用含 10%(体积分数)灭活新生小牛血清
RPMI-1640培养液稀释 ,分别配制成 4 、20 、100 、500 、2500μg·
m L-1溶液 , 备用。 石油醚部位 、三氯甲烷部位 、乙酸乙酯部
位 、正丁醇部位同法操作 , 分别配制成 4、20、100、500 、2500μg
·mL-1溶液 ,备用。
2.2　阳性对照溶液制备　精密量取5-氟尿嘧啶(5-Fu)注射
液适量 ,用含 10%灭活新生小牛血清 RPMI-1640 培养液稀
释 ,分别配制成 4 、20、100、500 、2500μg·mL-1溶液 ,备用。
2.3　细胞培养　Hela 229 细胞 、AGS 细胞 、A375 细胞和5637
细胞用含 10%(体积分数)灭活新生小牛血清 RPMI-1640 培
养液在 37℃、5% CO2 、饱湿条件下培养。
2.4　体外肿瘤抑制试验　采用四甲基偶氮唑盐比色法。取
对数生长期 Hela 229 细胞 、AGS 细胞 、A375 细胞和 5637 细
胞 ,用 0.25%的胰蛋白酶进行消化后 , 分别配成 3.3104·
mL -1的细胞悬液接种于 96 孔培养板中 , 每孔加细胞悬液
150μL;培养 24h 后 , 分别加入不同浓度的三叶青提取物溶液
50μL ,终浓度为 1、5 、25、125 、625μg·mL-1 。空白对照组加
50μL 培养液 ,阳性对照组分别加入不同浓度的 5-氟尿嘧啶溶
液 50μL , 分别培养 48h 后 ,每孔加入 5g·L-1 M TT 20μL , 培养
4h 后 ,弃去上清液 , 加入 150μL DMSO 震荡 10min , 570nm 波
长下测定 OD值 , 每剂量组设 3 复孔 ,重复 3 次。按下式计算
药物对肿瘤细胞生长的抑制率。
肿瘤细胞生长抑制率(%)=(1-实验组平均 OD值/对
照组平均 OD值)×100%
2.5　统计方法　本实验数据采用 SPSS 13.0 进行处理 , 结果
均用表示 , 用单因素方差分析法对结果进行统计分析 , 当 P<
0.05时 , 认为两组间有显著性差异。
3　结果
三叶青不同提取部位对 4 种肿瘤细胞的体外抑制作用 ,
结果(见表 1)。在浓度 1μg·m L-1 ～ 625μg·m L-1的范围内 ,
三氯甲烷部位对 Hela 229 细胞和 A375 细胞的体外抑制作用
最强;石油醚部位对 Hela 229 细胞的体外抑制作用次之 , 对
A375 细胞的抑制作用较弱;石油醚部位对 AGS 细胞和 5637
细胞的体外抑制作用最强;三氯甲烷部位对 AGS 细胞和 5637
细胞的体外抑制作用次之;而乙醇提取物仅在浓度为 625μg·
mL -1时对各肿瘤细胞的增殖有较强抑制作用 ,在低浓度时则
抑制作用较弱或无抑制作用;乙酸乙酯部位和正丁醇部位对
4 种肿瘤细胞的抑制作用均较弱。以上结果表明 , 在相同浓
度下 , 三叶青的乙醇提取物对肿瘤细胞的增殖并不表现出显
著地抑制作用;三叶青中抗肿瘤的活性部位是三氯甲烷部位
和石油醚部位 , 而且其对不同肿瘤细胞的体外抑制作用呈一
定的浓度依赖作用。
表 1　三叶青不同提取部位对 4种肿瘤细胞的体外抑制影响
药物 剂量/μg·mL -1
Hela 229 AGS A375 5637
抑制率/ % IC50 抑制率/ % IC 50 抑制率/ % IC50 抑制率/ % IC50
5-Fu 1 23.78±7.91＊＊ 13.10 64.47±3.04＊ 0.11 34.99±12.09 4.47 74.63±4.67 3.74
5 35.55±9.16＊＊ 71.02±2.31＊ 48.05±8.41＊＊ 75.21±4.27
25 60.03±7.10＊＊ 81.03±2.60＊ 68.90±6.53＊＊ 75.47±4.30
125 81.17±5.45 97.63±1.31＊＊ 89.00±5.46 76.03±4.49
625 82.07±5.18 99.89±1.02＊＊ 91.58±4.37 76.21±4.05
石油醚部位 1 45.03±4.79 10.81 49.54±10.9 1.84 23.06±7.29 90.82 18.50±6.07 42.87
5 48.28±7.01 56.34±7.30 28.03±6.32 21.67±9.03
25 49.87±5.22 60.39±3.87 31.24±5.95 46.49±7.85
125 51.38±7.42 66.73±5.24 38.33±7.83＊ 50.18±8.58
625 67.62±10.44＊＊ 88.35±5.54＊＊ 79.78±4.96＊＊ 85.87±6.04＊＊
三氯甲烷部位 1 40.85±9.95 4.11 20.60±8.52＊ 20.07 28.87±11.95 19.30 30.02±7.58 143.68
5 50.15±8.15 25.93±8.85＊ 35.18±11.83 30.73±9.59
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Strait Pharmaceutical Journal Vol 23 No.12 2011
药物 剂量/μg·mL -1
Hela 229 AGS A375 5637
抑制率/ % IC50 抑制率/ % IC 50 抑制率/ % IC50 抑制率/ % IC50
25 64.24±7.57 46.50±7.45＊＊ 40.25±11.94 38.26±9.89
125 69.90±4.41 77.90±6.58＊＊ 63.18±10.81 46.28±11.98
625 81.03±5.65 92.44±2.13＊＊ 95.50±2.88＊＊ 61.78±9.76＊
乙酸乙酯部位 1 4.47±4.01 1736.81 13.70±4.71 678.13 13.67±7.46 97.29 4.05±1.94 185.00
5 7.54±5.94 19.93±4.39 20.31±4.81 9.44±6.58
25 13.16±3.87 21.55±4.80 24.32±7.47 14.45±7.82
125 24.13±4.27 22.26±5.69 33.49±12.55＊ 22.78±8.86＊
625 52.45±4.32＊＊ 65.00±1.56＊＊ 89.05±7.32＊＊ 87.38±5.57＊＊
正丁醇部位 1 22.09±8.25 270.53 14.44±4.60 868.65 22.22±12.68 239.10 7.78±4.10 2449.73
5 25.53±11.99 17.18±6.17 29.71±9.55 11.89±7.48
25 33.90±10.37 24.68±8.32 33.16±12.00 18.79±6.69
125 43.55±11.68＊＊ 27.12±11.66 44.07±12.63 29.77±11.86
625 58.23±4.71＊＊ 58.52±4.55＊＊ 59.09±10.03＊ 46.37±12.55＊＊
乙醇提取物 1 1.61±0.88 169.71 20.84±5.37 102.56 17.35±8.77 46.93 - -
5 20.99±8.32 24.69±4.26 28.68±6.71 -
25 30.27±10.39 27.12±3.99 36.32±11.74 -
125 38.34±10.78＊＊ 37.04±6.89＊＊ 41.45±11.74 -
625 68.67±7.01＊＊ 81.65±5.96＊＊ 93.86±10.71＊＊ 54.86
4　讨论
在癌症的治疗用药上目前仍以化学合成药为主 ,这些药
物在杀灭肿瘤细胞的同时 , 对人正常细胞也有很大的损害。
中国传统的医药在抗肿瘤方面显示了独有的优势 , 以毒副作
用小而受到人们的青睐。尤其是随着科技进步和社会发展 ,
医学模式的转变使癌症治疗将转向生物治疗 、基因治疗和传
统医学治疗。传统医学已先于前者取得令人瞩目的突破性进
展。近半个世纪来中西医结合治疗肿瘤 , 已越来越被广大学
者和患者接受 ,并逐渐受到重视 , 是目前恶性肿瘤综合治疗的
有效手段之一。
三叶青是我国民间的常用药物 ,为浙江地区的特色中药。
但由于三叶青资源较少 ,对生长环境要求较高 , 对于三叶青的
研究还处于较落后的水平。本研究通过细胞的体外抑制试验
发现 ,三叶青的三氯甲烷部位和石油醚部位在一定浓度下可
有效抑制人宫颈癌细胞 Hela 229 、人胃腺癌细胞 AGS、人恶性
黑色素瘤细胞 A375 和人膀胱癌细胞 5637 的活性 , 并且其抑
制作用表现出浓度依赖性。因此 , 将三氯甲烷部位和石油醚
部位确定为三叶青抗肿瘤活性部位。三叶青脂溶性提取物抗
肿瘤作用的物质基础尚不明确 ,课题组将继续研究 , 追踪三叶
青的抗肿瘤活性成分。
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