全 文 ：·1354· 中国中西医结合杂志 2014 年 11 月第 34 卷第 11 期 CJITWM，November 2014，Vol． 34，No. 11
基金项目:浙江省科技计划项目(No． 2008F3036) ;浙江省科技厅科研院所专项基金资助项目(No． 011F10068)
作者单位:1． 浙江中医药大学附属省立同德医院肿瘤内科(杭州 310012) ;2． 浙江省中医药研究院(杭州 310007)
通讯作者:魏克民，Tel:0571 － 88849080，E-mail:wkmcyzy@ 163． com
DOI:10. 7661 /CJIM. 2014. 11. 1354
三叶青提取物对人肺癌 H1299 细胞凋亡的
影响及机制研究
钟良瑞1 林 霜1 陈伟芳1 魏克民2
摘要 目的 探讨三叶青提取物对人肺癌 H1299 细胞增殖抑制、凋亡作用及其机制。方法 采用
Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测三叶青提取物对 H1299 细胞增殖的抑制作用;采用倒置显微镜观察
三叶青提取物对 H1299 细胞形态的影响;荧光显微镜观察三叶青提取物作用细胞后经 Hoechst 33258
染色的凋亡形态变化;流式细胞仪检测细胞凋亡率;蛋白印迹法(Western blot)检测 pro-caspase-3、9，
cle-caspase-3、9，poly-ADP-ribose polymerase (PAＲP)蛋白表达变化。结果 与对照组比较，浓度为 0. 5、
1、5、10 mg /mL 三叶青提取物作用 H1299 细胞后抑制率升高(P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01);同时作用时间越
长，抑制率越高(P ＜ 0. 01)。倒置显微镜下观察给药后细胞形态明显改变，细胞减少;荧光显微镜下观
察荧光染色后细胞核浓染和凋亡小体形成。流式细胞仪检测结果显示细胞凋亡率呈明显的量 － 效关
系。Western blot 结果表明:与对照组比较，浓度为 5、10 mg /mL 三叶青提取物明显抑制 H1299 细胞中
pro-caspase-3、9 和 PAＲP 蛋白表达，增加 cle-caspase-3、9，cle-PAＲP 蛋白的表达，差异有统计学意义(P
＜ 0. 05)。结论三叶青提取物对人肺癌H1299 细胞具有明显抑制其增殖，促进细胞凋亡作用，且其机制
可能与激活 caspase 蛋白表达有关。
关键词 三叶青;人肺癌细胞;增殖;凋亡
Effect of Extract of Ｒadix Tetrastigma hemsleyani on Apoptosis of Human Lung Carcinoma H1299 Cells
and Its Mechanism Study ZHONG Liang-rui1，LIN Shuang1，CHEN Wei-fang1，and WEI Ke-min2 1
Department of Oncology，Tongde Hospital of Zhejiang Province，Affiliated to Zhejiang Chinese Medical Universi-
ty， Hangzhou (310012 )， China; 2 Zhejiang Academy of Traditional Chinese Medicine， Hangzhou
(310007) ，China
ABSTＲACT Objective To study the effect of extract of Ｒadix Tetrastigma hemsleyani on the proliferation and apoptosis of
human lung carcinoma H1299 cells，and to explore its mechanisms． Methods H1299 cells were treated with the extract of Ｒadix
Tetrastigma hemsleyani in different concentrations at different time points． Its inhibition on H1299 cell proliferation was detected by
Cell Counting Kit-8(CCK-8)assay． The morphology of the H1299 cell was observed by inverted microscope． Changes of apoptosis
were observed by Hoechst33258 methods． The apoptosis rate was detected by flow cytometry． Expression changes of apoptosis-relat-
ed proteins pro-caspase-3，pro-caspase-9，cle-caspase-3，cle-caspase-9，and poly-ADP-ribose polymerase (PAＲP)were detected
by Western blot． Ｒesults Compared with the control group，the inhibition rate of H1299 cells increased after acted by 0. 5，1，5，
and 10 mg/mL extract of Ｒadix Tetrastigma hemsleyani (P＜0. 05，P＜0. 01)． The longer the acting time，the higher the inhibition
rate (P＜0. 01)． Under inverted microscope，typical morphological changes could be seen and the number of H1299 cells was re-
duced． Under fluorescence microscope，dark stained nucleus and formed apoptotic body could be observed． Ｒesults of flow cytome-
try showed that the apoptosis rate was obviously dose-effect correlated with the concentration of extract of Ｒadix Tetrastigma hemsley-
ani． Ｒesults of Western blot indicated that compared with the control group，the protein expression of pro-caspase-3，pro-caspase-
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9，and PAＲP were down-regulated and that of cle-caspase-3，cle-caspase-9，and cle-PAＲP were up-regulated by 5 and 10 mg/mL
extract of Ｒadix Tetrastigma hemsleyani (P＜0. 05)． Conclusions Extract of Ｒadix Tetrastigma hemsleyani had obvious effect in in-
hibiting the proliferation and inducing apoptosis of human lung carcinoma H1299 cells，which might be achieved by activating the
expression of caspase protein．
KEYWOＲDS Ｒadix Tetrastigma hemsleyani;human lung carcinoma cell;proliferation;apoptosis
近年来，肺癌已严重威胁人类的生命及生活质量，
其发病率、病死率逐年上升［1］。临床使用的抗肿瘤药
物大多存在不良反应，影响患者生活质量［2］。目前中
药及其有效成分的抗肿瘤作用已成为研究热点。三叶
青具有清热解毒、祛风化痰、活血止痛的作用，用于治
疗高热惊厥、肺炎、哮喘、肝炎等病症［3］，其抗肿瘤作用
亦越来越受到关注。因此，本实验探讨三叶青提取物
对非小细胞肺癌的体外抑制增殖、促进凋亡及其作用
机制具有可行性和重要意义。
材料与方法
1 细胞株 人肺癌细胞 H1299 细胞株由浙江省
医学科学院提供。细胞株由浙江中医药大学实验室培
养传代。
2 药物 三叶青产地浙江，购自杭州华东中药饮
片有限公司，批号:120110;500 g三叶青经乙酸乙酯提
取 3 次，低温真空回收，旋转蒸发仪上浓缩成约10 g药
液，置 － 20 ℃冰箱备用。
3 主要试剂 胎牛血清由美国 Hyclone 公司
提供，批号:SH30070. 03;ＲPMI-1640 培养液由杭
州吉 诺 生 物 医 药 技 术 有 限 公 司 提 供，批 号:
GNM31800-S;CCK-8 由日本同仁化学研究所提供，
批号:CK04;Hoechst 33258 染色液由碧云天生物技
术研究所提供，批号:C1011;Annexin V-FITC 细胞
凋亡检测试剂盒由南京凯基生物技术有限公司提
供，批 号:KGA108。 caspase-3 (批 号:9665 )，
caspase-9(批号:9508) ，cle-caspase-3(批号:9664) ，
cle-caspase-9(批号:7237) ，PAＲP(批号:9532) ，由
美国 CST 公司提供。
4 主要仪器 CO2 细胞培养箱(美国 Thermo 公
司，型号:3111) ;酶标仪(美国 Thermo 公司，型号:
3001);流式细胞仪(美国 Becton Dickinson公司，型号:
FACSCantoⅡ) ;蛋白印记检测系统(美国 Bio-Ｒad 公
司，型号:ChemiDoc XＲS System) ;荧光显微镜(日本 O-
lympus公司，型号:IX71)。
5 检测指标与方法
5. 1 细胞培养 将 H1299 细胞培养于含 10%胎
牛血清的 ＲPMI1640 培养液，培养条件均为 37 ℃、含
5% CO2 的细胞培养箱内。待细胞长满瓶底后，弃掉
培养液，用胰酶消化，镜下观察到细胞分离变圆、细胞
间隙增大后，停止消化，更换培养液，分瓶培养，取对数
生长期细胞用于实验。
5. 2 不同浓度三叶青提取物对 H1299 细胞增殖
的影响 采用细胞增殖抑制试验。用细胞增殖与活性
检测试剂盒 Cell Counting Kit-8(CCK-8)的方法检测细
胞增殖情况。取对数生长期的 H1299 细胞，用 0. 25%
胰酶消化，计数细胞密度为 5 × 104 /mL的细胞悬液，每
孔 100 μL 细胞悬液接种于 96 孔板，次日贴壁后更换
培养液并加浓度为 0. 5、1、5、10 mg /mL三叶青提取物，
对照组不含药物，分 5 组，每组设 6 个重复复孔，分别
在 24、48、72 h 检测，450 nm 为检测波长，计算每组各
孔 吸 光 度 OD 值。 抑 制 率 (%) =
1 －(OD实验组 /OD对照组)× 100%。对照组抑制率
为 0%。计算三叶青提取物对 H1299 细胞的抑制率。
5. 3 不同浓度三叶青提取物处理 H1299细胞的形
态学变化 采用普通倒置显微镜观察法:将 H1299 细胞
用 0. 25%胰酶消化，每孔 500 μL细胞悬液接种于 24 孔
板中(5 × 104 /mL) ，次日细胞贴壁后，加浓度为 1、5、10
mg /mL三叶青提取物，对照组不含药物，继续培养 48 h
后用倒置显微镜观察各组的不同变化。
5. 4 不同浓度三叶青提取物对 H1299 细胞凋
亡形态的影响 采用荧光显微镜观察凋亡细胞形
态:细胞经浓度为 1、5、10 mg /mL 三叶青提取物处
理 48 h 后，吸除培养液;加入多聚甲醛固定 15 min;
PBS 漂洗 2 次;加入 Hoechst 33258 荧光染液，避光
染色5 min;PBS 漂洗 3 次，荧光显微镜观察细胞核
的形态。
5. 5 不同浓度三叶青提取物作用 H1299细胞后凋
亡率比较 采用流式细胞术检测细胞凋亡率。取对数
生长期 H1299细胞，制成 1 ×105 /mL细胞悬液接种于 6
孔板;2 mL细胞悬液每孔。次日细胞贴壁后，加浓度为
1、5、10 mg /mL三叶青提取物，对照组不加药物，作用于
细胞 48 h 后，用不含 EDTA 的胰酶消化，终止，
2 000 r /min离心 5 min，收集细胞，用 PBS 洗涤细胞
2次，收集细胞数约 2 ×105 个，加入 500 μL的结合缓冲
液 Bind Buffer悬浮细胞，先后加入5 μL Annexin V-FITC
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和 5 μL PI，混匀后室温避光孵育 15 min，上流式细胞仪
检测分析，激发波长为 488 nm。
5. 6 不同浓度三叶青提取物处理后 H1299 细胞
凋亡相关蛋白的影响 采用蛋白印迹法(Western
blot)方法检测。冰上操作，快速刮下细胞，移至
1. 5 mL离心管。每瓶细胞加 250 ～ 500 μL ＲIPA 裂解
液，1 200 r /min离心 5 min，收获蛋白，测定蛋白浓度。
用 SDS-PAGE 电泳分离蛋白，将蛋白转移至 PVDF 膜
上。5%脱脂奶粉室温下封闭 1 h，一抗室温孵育 2 ～ 3
h，二抗室温孵育 1 h。室温下，ECL 混合液滴加在
PVDF膜上，避光反应 3 ～ 5 min，放入蛋白印记检测系
统的暗箱内，在暗室中，曝光、显影、定影。以 β-actin
作为内参进行分析。
6 统计学方法 用 SPSS 13. 0 统计软件分析处
理。计量资料数据用 x± s表示，组间比较采方差分析，
组间两两比较采用 Dunnett 分析。P ＜ 0. 05 为差异有
统计意义。
结 果
1 不同浓度三叶青提取物对 H1299 细胞抑制率
的影响(表 1) 三叶青提取物对 H1299 细胞有明显增
殖抑制作用，随浓度的增加、时间延长，抑制率逐渐增
高，呈剂量、时间依赖性。与对照组比较，0. 5、1、5、10
mg /mL三叶青提取物作用 H1299 细胞后抑制率升高，
差异有统计学意义(P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01);同时作用时
间越长，抑制率越高，差异有统计学意义(P ＜ 0. 01)。
表 1 三叶青提取物对 H1299细胞抑制率的影响 (%，x± s)
组别 n
细胞增殖的抑制率
24 h 48 h 72 h
对照 6 0 0 0
三叶青提取物 0． 5 mg /mL 6 3． 95 ± 0． 75* 9． 21 ± 0． 89＊＊△ 21． 46 ± 1． 02＊＊△
1 mg /mL 6 11． 24 ± 1． 64＊＊ 20． 54 ± 0． 83＊＊△ 42． 75 ± 1． 04＊＊△
5 mg /mL 6 24． 30 ± 0． 68＊＊ 45． 25 ± 1． 15＊＊△ 70． 31 ± 1． 18＊＊△
10 mg /mL 6 44． 83 ± 1． 66＊＊ 64． 46 ± 1． 40＊＊△ 76． 25 ± 1． 37＊＊△
注:与对照组比较，* P ＜ 0． 05，＊＊ P ＜ 0． 01;与本组 24 h 比
较，△P ＜ 0． 01
2 不同浓度三叶青提取物处理后 H1299 细胞的
形态学比较(图 1) 三叶青提取物作用于 H1299 细胞
48 h后，对照组细胞生长良好，均贴壁生长，分布均匀
(图 1A)。1 mg /mL三叶青提取物作用后，有部分细胞
漂浮、部分贴壁细胞呈圆形(图 1B);自 5 mg /mL 开始
细胞出现明显的变化，细胞变圆、变小、胞膜皱缩，悬浮
细胞明显增多(图 1C);10 mg /mL 高浓度组细胞抑制
最明显，正常细胞少见(图 1D)。
注:A为不加药对照组;B 为三叶青提取物 1 mg /mL 组;C
为三叶青提取物 5 mg /mL组;D为三叶青提取物 10 mg /mL组
图 1 不同浓度三叶青提取物作用于 H1299 细胞
48 h的形态学变化 (× 100)
3 不同浓度三叶青提取物对 H1299 细胞凋亡形
态的影响(图 2) 正常细胞呈弥散均匀的荧光，当细
胞发生凋亡时，由于染色质固缩而浓染使细胞内的荧
光强度增强。实验结果表明:对照组细胞呈均匀蓝色
荧光 (图 2A);三叶青提取物 1 mg /mL 低浓度组细
胞核颜色稍亮(图 2B) ;5 mg /mL 中浓度组部分细胞
核呈致密浓染，颜色发亮(图 2C) ;10 mg /mL 高浓度
组细胞凋亡最明显，部分细胞核亮蓝色浓集、边缘化
(图 2D)。随着药物浓度的增加，细胞凋亡现象逐渐
明显。
注:A为不加药对照组;B为三叶青提取物 1 mg /mL 组;C 为
三叶青提取物 5 mg /mL组;D为三叶青提取物 10 mg /mL组
图 2 不同浓度三叶青提取物作用于 H1299 细胞 48 h的
荧光凋亡形态图(Hoechst33258，× 200)
4 流式细胞仪检测三叶青提取物对 H1299 细
胞凋亡的影响(表 2，图 3) 与对照组比较，经药物
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处理 48 h后细胞凋亡的比例均有明显升高，差异有
统计学意义(P ＜ 0. 01) ，且呈现一定的剂量 － 效应
关系。
表 2 三叶青提取物作用于 H1299 细胞 48 h后
凋亡率的比较 (%，x± s)
组别 n 细胞凋亡率
对照 6 4． 59 ± 0． 34
三叶青提取物 1 mg /mL 6 21． 62 ± 0． 39*
5 mg /mL 6 47． 66 ± 1． 33*
10 mg /mL 6 64． 47 ± 1． 91*
注:与对照组比较，* P ＜ 0． 01
注:A为不加药对照组;B 为三叶青提取物 1 mg /mL 组;C 为
三叶青提取物 5 mg /mL组;D为三叶青提取物 10 mg /mL组
图 3 流式细胞仪检测不同浓度三叶青提取物
对 H1299 细胞凋亡的影响
5 不同浓度三叶青提取物对 H1299 细胞相关凋
亡蛋白表达的影响(表 3、图 4) 与对照组比较，5、
10 mg /mL三叶青提取物对 pro-caspase-3、9，PAＲP 蛋
白表达明显降低，但对 cle-caspase-3、9，cle-PAＲP 蛋白
表达明显升高，差异有统计学意义(P ＜ 0. 05)。
注:A为不加药对照组;B为三叶青提取物 1 mg /mL 组;C
为三叶青提取物 5 mg /mL组;D为三叶青提取物 10 mg /mL组
图 4 不同浓度三叶青提取物处理细胞 48 h后
H1299 细胞蛋白表达电泳图
讨 论
肺癌发病率高，病因及发病机制复杂。肿瘤细胞
学研究表明肺癌的发生是由细胞增殖与凋亡的调节失
控引起［4］。目前中药的抗癌机制研究已取得重大突
破，尤其在肺癌细胞增殖的调控与诱导细胞凋亡两方
面［5］。三叶青为葡萄科崖爬藤属植物三叶崖爬藤，具
有清热解毒、祛风化痰、活血化瘀、抗炎镇痛等作用［6］;
抗肿瘤方面三叶青对肺癌、肝癌、胃癌等具有良好治疗
效果［7，8］。因此，本实验深入研究三叶青提取物抗肺
癌的机制具有重要意义。
本实验通过体外实验 CCK-8 证实:三叶青乙酸乙
酯提取物能抑制人肺癌细胞株 H1299 的增殖，且具有
浓度、时间依赖性，其中三叶青提取物浓度为
10 mg /mL、作用时间为 72 h时，对细胞的抑制率最高，
表明三叶青提取物能够明显抑制肺癌细胞的增殖。细
胞凋亡是一种程序性的细胞死亡，是机体生长发育、细
胞分化和病理状态中细胞自主死亡的过程，并通过分
子水平进行调控，在肿瘤发生发展中起重要作
用［9］。本研究通过流式细胞术AnnexinV-FITC和PI
表 3 各组 caspase-3、9 及 PAＲP蛋白表达比较 (x± s)
组别 n pro-caspase-3 cle-caspase-3 pro-caspase-9 cle-caspase-9 PAＲP cle-PAＲP
对照 3 1． 79 ± 0． 12 0． 46 ± 0． 03 2． 09 ± 0． 16 0． 47 ± 0． 03 1． 67 ± 0． 13 0． 41 ± 0． 04
三叶青提取物 1 mg /mL 3 1． 43 ± 0． 09 0． 51 ± 0． 05 1． 97 ± 0． 14 0． 53 ± 0． 04 1． 69 ± 0． 12 0． 56 ± 0． 06
5 mg /mL 3 0． 97 ± 0． 07* 0． 65 ± 0． 06* 1． 59 ± 0． 12* 0． 71 ± 0． 06* 1． 07 ± 0． 08* 0． 78 ± 0． 06*
10 mg /mL 3 0． 75 ± 0． 05* 0． 87 ± 0． 07* 0． 93 ± 0． 09* 0． 92 ± 0． 06* 0． 67 ± 0． 05* 1． 27 ± 0． 08*
注:与对照组比较，* P ＜ 0． 05
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双染，显示三叶青提取物能够诱导肺癌 H1299 细胞的
凋亡，且与浓度呈正相关性。在荧光显微镜下观察经
Hoechst33258 染色后的 H1299 细胞出现形态学上的改
变，凋亡细胞的细胞核呈致密浓染，颜色发亮，出现增
强的蓝色荧光，部分细胞核中出现新月状亮蓝色荧光
边集于核膜下。诱导细胞凋亡是多数抗肿瘤药物的主
要机制，本研究证实三叶青提取物可以明显诱导肺癌
H1299 细胞的凋亡。
细胞凋亡途径主要包括死亡受体介导的外源性途
径和线粒体参与的内源性途径［10，11］。其固有途径是
通过线粒体蛋白质的释放引起的，如细胞色素 C，与
Apaf-1 及 procaspase-9 结合形成凋亡体;凋亡体诱导
激活 caspase-9 和 caspase-3 从而启动细胞凋亡的
caspase 级联反应，导致细胞凋亡［12，13］。完整的
caspase-3 和 caspase-9 没有活性，当其发生剪切后激
活;细胞凋亡执行阶段时 PAＲP 被 caspase 降解，
caspase-3 是降解 PAＲP最有效的酶［14］。PAＲP参与调
控细胞染色体结构稳定，还参与凋亡的调控。细胞凋
亡执行阶段时 PAＲP 蛋白被降解，可以避免在凋亡细
胞中不必要的 DNA 修复，促使核降解，使凋亡顺利进
行。中药三叶青能有效抑制体外 HL60 细胞的增殖，
诱导其凋亡［15］。李华美等［16］研究发现，三叶青提取
物能抑制小鼠 Lewis 肺癌细胞的生长，可能与上调
caspase-3 从而促进肿瘤细胞凋亡有关。本次实验通
过Western blot检测结果显示与对照组比较，随三叶青
提取物浓度增加，pro-caspase-3、9 和 PAＲP 蛋白表达
降低，cle-caspase-3、9，cle-PAＲP 蛋白表达增加，提示
三叶青提取物通过激活 caspase 蛋白诱导 H1299 细胞
凋亡。
综上所述，三叶青乙酸乙酯提取物对肺癌 H1299
细胞具有抑制增殖和促进凋亡作用，通过降低 pro-
caspase-3、9 和 PAＲP蛋白，增加 cle-caspase-3、9 和 cle-
PAＲP 蛋白，激活 caspase 蛋白可能是其凋亡机制
之一。
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(收稿:2013 － 05 － 04 修回:2014 － 07 － 24)