全 文 ：激光-氯化锂复合诱变选育絮凝性适中的啤酒酵母
吴英敏 1,王德良 2,张彦青 2,邓 利 1,王 芳 1
(1.北京化工大学生命科学与技术学院,北京,100029;2.中国食品发酵工业研究院,北京,100027)
摘 要:以絮凝性弱而其他发酵指标皆可的啤酒酵母菌 Fs为出发菌株,以激光-氯化锂为复合诱变剂诱变啤
酒酵母得到一株絮凝性适中的啤酒酵母,絮凝性为37.9%,比原菌株提高了1.61倍。用该菌株酿造的啤酒,发
酵液中双乙酰含量为0.048mg/L,风味指标几乎不变。
关键词:激光诱变;絮凝性;啤酒酵母
中图分类号:TS262.5;TS261.11文献标识码:B
用激光照射酵母菌,可以通过产生光、电、热、压力和电磁
效应的综合作用,直接或间接地影响酵母菌,引起细胞 DNA
或 RNA改变,导致酶的激活或钝化,进而引起细胞分裂和细
胞代谢活动的改变[1~2]。激光作为一种育种方法,具有操作简
单、使用安全等优点,近年来应用于微生物育种中取得不少进
展[3]。
氯化锂是一种碱金属卤化物,其本身并无诱变作用,但在
一些菌种选育中表明与其他诱变剂具有协同作用[4]。
啤酒酵母是啤酒工业的重要生产菌种,它的优劣直接关
系着啤酒质量的高低。絮凝性是啤酒酵母的一个重要特性,絮
凝性的强弱不仅对啤酒的发酵周期、过滤性能等生产过程控
制具有重要意义,而且还会对成品啤酒的发酵度等指标产生
影响,甚至会影响到啤酒的风味,在生产上具有特殊的意义,
也是区别酵母菌株的一项重要内容[5]。为此,本实验以激光 -
氯化锂为诱变剂对啤酒酵母进行诱变处理,经过培养,检测酵
母的絮凝性,从而选育出絮凝性适中而其它指标基本不变的
菌株。
1材料与方法
1.1材料与仪器
菌种:中国食品发酵工业研究院酿酒部提供。
收稿日期:2006-12-25
作者简介:吴英敏(1977- ),女,河北省黄骅市人,本科毕业于北京工商
大学生物化工专业,现就读于北京化工大学生命科学与技术学院。
文章编号:1002-8110(2007)02-0081-03
Biochemical Characteristics of Shaoxing Yellow Rice Wine Brewing Process
MAOQing-zhong,XUANXian-yao,LURui-gang
(HuijishanShaoxingYellowRiceWineCo.Ltd.Keqiao,Shaoxing312030,Zh jiang,China)
Abstract: Thebiochemicalcharacteristicswerepresentedintheshaoxingyellowricewinebrewingprocess:theuniquenessofadjunctmaterials
and the variety of different wine,the treatment of soaking rice at lowtemperature for a long time,the variety of fermentation state,the
characteristicsofricewinebroth,thevarietyandcomplexityofmicroorganisms,theuniquenessofinoculationandstrainpreservation,theprocess
ofmixed fermentation ofyeast and Lactobacillus(bacteria)(e.g.the concurrence ofsaccharification,yeast fermention and Lactobacillus
(bacteria)fermentation),XiangxueWinemainfermentationbyLactobacillus(bact ia);l ttlefermentationbyyeast;theover-mixingof
differentliquors,thehighsterilizationtemperature,andthestorageofproducedwine.
Key words:shaoxingyellowricewine;threesidesf rmentation;biochemicalcharacteristics;ye stLactobacillusspp.
[9]毛青钟.黄酒发酵醪中乳酸杆菌的分离和性能浅析[J].中国黄酒.
2002(3) :23~29.
[10]毛青钟.DS56酵母的性能及在黄酒酿造中的作用 [J]酿酒科技
2003(5) :37~38.
[11]毛青钟.酒药(小曲)香气的产生菌DS563~6菌株的分离选育中
国黄酒[J].2004(1) :25~27.
[12]毛青钟.拟内孢霉的性能研究和在黄酒酿造中的应用初探[J].中
国黄酒.2004(1) :22~24.
[13]毛青钟.念珠霉的性能及其在黄酒酿造中的作用[J]江苏食品与
发酵 2004(2) :11~13.
[14]管敦仪.工业手册上册 [M].北京:中国轻工业出版社.1985
658~659.
[15]康明官.日本清酒技术[M].北京:中国轻工业.版社.1986 153.
[16]诸葛健,王正祥.工业微生物实验技术手册[M].北京:中国轻工业
出版社 1997 96.
[17]张 蕾.甘蓝乳酸发酵汁的利用[M].中国酿造.1992(2) :17~22.
[18]毛青钟.黄酒灭菌温度的探讨[J].中国酿造.2005(6) :34~38.
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第34卷 第2期
2 0 0 7年 3月
酿 酒
LIQUOR MAKING
Vol.34.№.2
Mar.,2007
· 81·
照射电流及距离
12mA,15cm
20mA,15cm
25mA,15cm
20mA,5cm
涂布的培养基
B1
B1
B2
C
致死率
5min
22%
23.5%
68.5%
-
10min
26.5%
44%
75%
78%
15min
28.5%
67.5%
82.5%
98.5%
20min
48.5%
58.5%
92%
99%
30min
65.5%
48%
94.5%
-
YPD斜面培养基,11°P麦汁,麦汁固体培养基(编号为
A),麦汁 -LiCl(3mg/mL和 4mg/mL)固体培养基(编号分别为
B1、B2)以及麦汁 -LiCl(3mg/mL)-双乙酰(120μg/mL)固体培
养基(编号为C),0.9%生理盐水,无菌水等。
SJ-8He-Ne激光器;LRH-150-S恒温恒湿培养箱,广东
省医疗器械厂;LRH-250生化培养箱,上海一恒科技有限公
司,centrifuge5810R离心机,德国;UV-2401PC分光光度计,
日本岛津;恒温水浴锅,余姚金电仪器有限公司。
1.2激光诱变的方法
在无菌操作下,将酵母菌接种于 YPD斜面培养基上,于
28℃培养箱中培养24h。然后取培养的酵母接种于麦汁中,于
28℃培养箱中培养 20h。离心弃培养基,用生理盐水洗涤 2
次,离心收集菌体。用生理盐水悬浮菌体菌浓度为106个 /mL
左右。分别装于6个无菌试管中2mL,分别用5个剂量(5min,
10min,15min,20min,30min)的 He-Ne激光照射酵母菌细胞,
其中一个作为对照。将试管振荡均匀后,进行激光照射[6]。照射
完毕后进行适当稀释,涂布各种培养基,同时以 A培养基为
对照。倒置平板于28℃培养72h,计数平板上的菌落,计算致
死率,并挑出生长旺盛的菌株接种到麦汁斜面培养基上,于
28℃培养箱中培养48h后保存。分别在麦汁中培养这些初步
筛选出的酵母并测定其絮凝性,以筛选絮凝性好的菌株为目
标菌株。
1.3酵母凝聚性的测定方法
离心收集酵母泥,用 0.01MEDTA-Na清洗 2次,再用去
离子水清洗 2次。称取 1g酵母于 50mL具塞比色管中,加入
50mL醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.5),振荡摇匀,立即在 670nm
下测量 OD1,然后在 20℃水浴中放置 30min,取出吸取距液面
1cm处的溶液,在670nm下测量OD2,酵母的絮凝性(F)=
(OD1-OD2)/OD1×100%[7]。
1.4理化指标分析方法
双乙酰采用邻苯二胺比色法测定,酒精度、发酵度等指标
采用比重瓶法测定,风味指标采用顶空瓶进样法测定。
2结果与讨论
2.1激光诱变后酵母的生长情况(见表1)
表1 不同条件下诱变酵母的生长情况
酵母经激光照射后,初期明显地表现细胞生长缓慢,菌落
很小,呈现出有一细胞修复阶段。同时可以看到,随着照射时
间的延长以及照射电流的增大,酵母的致死率亦随之增加,诱
变条件以照射电流为 20mA,照射距离 5cm,照射时间
15~20min为好。
2.2菌种的筛选
从 B2培养基平板上生长的酵母挑出 13株 (编号为
L1~L13)、从 C培养基平板上生长的酵母挑出 18株(编号为
S1~S18)到麦汁斜面培养作为保存菌株。将以上酵母分别进行
培养测定酵母的絮凝性,以原始菌株为对照,从絮凝性角度考
察诱变情况。絮凝性测定结果见表2。
酵母
L1
L2
L3
L4
L5
L6
L7
L8
凝聚性/%
26.0
18.4
28.6
20.9
18.8
24.8
33.2
13.7
酵母
L9
L10
L11
L12
L13
S1
S2
S3
凝聚性/%
14.1
25.1
17.6
16.0
29.9
18.7
19.2
29.9
酵母
S4
S5
S6
S7
S8
S9
S10
S11
凝聚性/%
16.6
18.6
22.8
23.8
31.0
21.1
23.7
38.4
酵母
S12
S13
S14
S15
S16
S17
S18
对照
凝聚性/%
24.1
21.4
21.9
37.9
23.4
36.0
27.0
23.5
表2 酵母突变株絮凝性的测定结果
由 表 1可 见 ,L1、L3、L6、L7、L10、L13、S3、S8、S11、S15、
S15、S17等12株酵母的絮凝性与对照相比,皆好于对照。
2.3发酵栓实验
根据絮凝性的测定结果筛选出的 12株酵母进行发酵栓
实验,以原始菌株为对照。以双乙酰、酒精度、发酵度、风味等
指标进行复筛。具体结果见表 3~表4。
双乙酰是啤酒风味的主要影响因素,它在啤酒中含量较
高,阈值低,对啤酒风味影响很大,超过阈值时啤酒呈饭馊味。
由表 3可知,L1,L3,L6,L13,S3,S8,S17,S18的双乙酰含量超
过阈值,L7、L10、S11、S15的双乙酰含量低于阈值,且 S11、
S15的双乙酰含量低于对照。
发酵度是啤酒成品的一个重要理化指标,在麦汁浓度一
定的情况下,发酵度的高低决定了啤酒成品的最终残糖含量
和酒精含量。同时发酵度高低对啤酒的口感和保存期有重要
影响。就酒精度和发酵度而言,除了 L1和 L13外,其他酵母
的测定结果皆好于对照。
酵母
L1
L3
L6
L7
L10
L13
S3
S8
S11
S15
S17
S18
对照
双乙酰/(mg/L)
0.098
0.113
0.129
0.074
0.072
0.108
0.110
0.134
0.055
0.048
0.094
0.089
0.060
酒精度/%(w/w)
3.52
3.90
3.87
3.85
3.98
3.56
3.95
3.90
3.88
3.80
3.85
3.98
3.72
发酵度/%
67.4
69.0
69.2
68.8
69.4
67.6
69.5
69.9
69.2
68.2
68.8
69.7
67.9
表3 双乙酰、酒精度、发酵度测定结果
第二期 2007酿 酒
· 82·
表4 风味指标测定结果 单位:mg/L
项目
L1
L3
L6
L7
L10
L13
S3
S8
S11
S15
S17
S18
对照
乙醛
2.972
1.460
4.088
2.415
4.218
2.944
2.856
4.126
2.327
3.762
2.901
4.332
4.688
甲酸乙酯
0.092
0.044
0.104
0.092
0.106
0.096
0.107
0.107
0.119
0.106
0.115
0.109
0.113
乙酸乙酯
14.594
10.476
15.239
16.946
17.169
15.556
17.169
17.213
19.531
18.247
19.033
17.278
16.832
乙酸异丁酯
0.027
0.020
0.027
0.045
0.032
0.032
0.082
0.036
0.043
0.034
0.046
0.033
0.034
正丙醇
7.190
5.468
7.729
7.204
8.667
7.539
8.336
8.581
8.882
8.306
9.760
9.020
8.159
异丁醇
4.720
3.576
5.346
5.036
6.131
5.314
5.274
6.128
8.180
5.748
7.400
6.156
5.978
乙酸异戊酯
1.684
0.994
1.698
1.915
1.878
1.718
1.838
1.854
2.123
1.869
2.295
1.730
1.781
异戊醇
43.786
32.489
48.278
16.422
55.416
48.375
50.620
55.002
61.436
52.879
60.566
56.848
52.922
己酸乙酯
0.134
0.116
0.141
0.150
0.150
0.141
0.156
0.157
0.154
0.156
0.146
0.158
0.146
辛酸乙酯
0.265
0.156
0.253
0.266
0.380
0.218
0.275
0.270
0.259
0.263
0.306
0.258
0.331
除双乙酰外,高级醇、乙醛、酯类等也是影响啤酒风味的
主要指标。高级醇是酵母发酵的代谢产物,赋予啤酒醇厚的口
感,但含量太高会破坏酒体及风味的协调。乙醛影响啤酒口味
的成熟,其含量的阈值为 10mg/L,超过阈值给人以不愉快的
粗糙苦味感觉。酯类是啤酒中的主要风味物质,适当的含酯量
能赋予啤酒特有的风味,但是含量过高则会呈现不正常的口
味。从表4可以看出,筛选菌株的乙醛、高级醇和酯类等含量
皆在阈值以下,尤以L6、S8、S15、S18的测定结果与对照接近。
因此从双乙酰、酒精度、发酵度以及风味等角度进行综合考
虑,以S15的发酵结果较好,即S15为目标菌株。
3结论
利用激光-氯化锂的协同作用,以其为复合诱变剂对啤
酒酵母进行诱变,同时结合一定的筛选指标,以筛选凝聚性适
中的酵母,筛选得到的目标菌株与原菌株相比,凝聚性提高了
1.61倍,还原双乙酰能力也有所增强,同时其他风味指标也基
本不变。由此可见,利用激光进行诱变育种是一种有效的方法。
[参考文献]
[1]WilisC.Biochem.Biophys.Acta,1984,782:274~284
[2]ZakianV.Mol.Cel.Biol.,1981,1:673~679
[3]陈义光等.新型物理诱变方法及其在微生物诱变育种中的应用进
展[J].长江大学学报(自然版),2005,2(5):46~50
[4]施巧琴,吴松刚.工业微生物育种学[M].北京:科学出版社
[5]吕宪峰,毛得奖.啤酒酵母絮凝机理研究进展[J].酿酒科技,2006,
(4):87~90
[6]张智维,杨辉.He-Ne激光对啤酒酵母的影响 [J].酿酒,2004,31
(9):94~95
[7]夏雪.酵母的凝聚性及其检测方法的探讨[J].啤酒科技,2005,(8):
33~34
吴英敏,等:激光-氯化锂复合诱变选育絮凝性适中的啤酒酵母第二期 2007
ScreeningoftheMedium FlocculablityByLaser-LiCl
CooperativeMutagenesis
WUYing-min1,WANGDe-liang2,ZHANGYan-qing2,DENGLi1,WANGFang1
(1.ColegeofLifeScienceandTechnology,BeijingUniversityofChemicalTechnology,Beijing100029,China)
2.ChinaNationalInstituteofFoodandFermentationIndustries,Beijing100027,China)
Abstract:TheobjectiveofthisworkwastoobtainthefineflocculabilityyeastfromSaccharomycesCerevisiaeFs.Laser-LiClwasusedas
cooperativemutagenesisagentwhichelicitedyeastthatcangetonestrainsofmediumflocculabilityyeast:flocculabilityamountedto37.9%
whichwas1.61timesthantheformalstrains.thisspecieswasusedtobeerfermented,whichresultindiacetyl0.048mg/Linzymolyticliquid.The
flavornearlyhadnotanychange.
Keywords:Laser-mutagenesis,flocculablity,yeast
· 83·