全 文 ：啤酒因其营养丰富素有“液体面包”之称，是目
前世界上最受欢迎的酒精饮料，但长期以来，来自
医学的观点认为啤酒因含有嘌呤类物质易诱发痛
风。嘌呤是生物体内一种重要的碱基，其在人体内
的代谢产物是尿酸[1]。
痛风是由于嘌呤代谢紊乱及尿酸排泄障碍引
起的疾病，其临床特点为高尿酸血症及由此而引起
的痛风性急性关节炎反复发作、痛风石沉积、痛风
石性慢性关节炎、关节畸形、慢性间质性肾炎和尿
酸肾结石[2]。
在啤酒中嘌呤的来源有两个途径，一是来自于
啤酒生产原料，二是来自于啤酒酵母发酵产生。酵
母在发酵初期，能够利用醪液中嘌呤碱基，加快合
成核酸类物质，从而缩短发酵时间，酵母几乎可以
利用所有游离状态的嘌呤碱基，但却不能利用核苷
酸和核苷等嘌呤类物质，以致啤酒中嘌呤类物质含
量 较 高 ， 成 品 啤 酒 嘌 呤 类 物 质 含 量 可 达
40mg/L~100mg/L。因此，通过诱变的手段筛选一株
低嘌呤啤酒酵母，对啤酒生产企业和消费者具有重
要的意义。
近年来，激光诱变广泛应用于生物育种，并取
得了大量的成功[3,4,5]，但关于激光诱变在啤酒酵母上
的应用只有在降低双乙酰方面有报道[6]。本研究利用
激光诱变对啤酒酵母进行了诱变处理，成功降低了
啤酒中嘌呤类物质的含量。
1 材料与方法
1.1 材料
啤酒酵母 VS：东营职业学院啤酒酿造车间提供。
麦芽汁：12°P 东营职业学院啤酒酿造车间自制。
1.2 主要设备与仪器
HJ- IB氦氖激光器：南京互川电子有限公司；
Laballiance PRE- 2000液相色谱：美国 SSI公司；啤
酒全自动分析仪（FermentoFlash）：奥地利安东帕(中
国)有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1细胞悬液的制备
将在 28℃小培养 36h 的酵母菌接入无菌生理
盐水，制成浓度为 107个 /mL的菌悬液。
1.3.2诱变处理[7,8]
取 5mL菌体悬液装入直径 5mm的玻璃小管
内，用 15mW的 He- Ne激光器（λ=623.8nm）垂直照
射，光斑直径 3mm，照射时间设置为 5min、10min、
收稿日期：2015- 10- 09
作者简介：于娓娉(1979- )，女，山东人，硕士研究生，讲师。
激光诱变选育低嘌呤啤酒酵母
于娓娉
（东营职业学院，山东 东营 257000）
摘 要:以嘌呤产量较高的啤酒酵母作为出发菌株，利用激光诱变手段对其进行诱变，最终筛选出一株嘌呤产量
低的啤酒酵母 V020，该菌株发酵性能好，且遗传性能稳定，总嘌呤产量较出发菌株降低 43.48%。
关键词：激光诱变;嘌呤;啤酒酵母
中图分类号：TS262.5；TS261.11；TS261.15 文献标识码：B
Breeding of Beer Yeast of Low Purine Cotent by Laser Radiation
YU Wei- Ping
（Dongying Vocational College, Dongying Shandong, 257000,China）
Abstract :Saccharomyces cerevisiae VS was induced mutation by laser radiation. To screen a stable, low purine- producing strain with
stable heritability. Finally, a strain of yeast was selected according to intended purpose, and total purine content was reduced by 43.48%.
Key words: laser radiation; purine; beer yeast
第 42卷 第 6期
2 0 1 5 年 11 月
酿 酒
LIQUOR MAKING
Vol.42.№.6
Nov.，2015
文章编号:1002- 8110（2015）06- 0055- 04
55
20min、30min、45min、60min、90min。
1.3.3 菌种筛选[9]
初筛：对诱变后的菌种制成菌悬液，稀释后涂
布乳酸平板，28℃下培养 48h 后进行活菌计数，并
计算致死率，选择菌落状态良好，且在电镜下观察
菌细胞形态好的菌株 100 株点接于麦芽汁 - 碳酸
钙培养基 28℃下培养 72h，挑选溶钙圈较大的菌株
60 株左右 - 点接到乳酸培养基上，28℃下培养
48h~72h，待菌落长成，加入 TTC上层培养基于暗处
培养 2h- 3h，挑选 TTC平板上颜色较深的菌株 30株
继续鉴定。
复筛：对 30株初筛菌株及原菌株进行发酵实
验，发酵结束测量啤酒中嘌呤含量，筛选出产嘌呤
产量低的菌种进行生产性能测试，从中选择一株发
酵性能优良的菌种，最后进行遗传稳定性试验。
1.3.4 啤酒发酵方法
菌种扩大培养后接种于 12°P麦芽汁，于 9℃下
发酵 4d，升高温度至 12℃还原双乙酰，6d后测双乙
酰含量确定前发酵结束。以每小时 0.7℃的速度降
低啤酒发酵温度至 4℃，低温发酵 2d降残糖，之后
将温度降至 - 1℃至 1℃之间贮酒[10]。
1.3.5 发酵性能实验
用出发菌种及诱变菌种分别进行发酵实验，发
酵结束测啤酒相关指标的含量，并对诱变前后菌种
测量结果进行比较。
1.4 分析方法
嘌呤含量的检测：高效液相色谱法[11]。
啤酒发酵度、双乙酰的测定：啤酒全自动分析
仪法。
2 结果与讨论
2.1 激光诱变的效果
2.1.1不同时间处理的致死率
从图 1可以看出，激光照射时间的长短对啤酒
酵母存活有较大的影响，诱变时间为 30min致死率
陡然增加，达到 86%，诱变时间高于 80min 以上时
致死率为 100%，因此，选择诱变时间为 30min作为
对出发菌株的诱变剂量。
2.1.2 目标菌株初筛
20 40 60 80 100
120
100
80
60
40
20
0
死
亡
率
/%
诱变时间 /min
图1 致死率曲线
图2 诱变菌株乳酸平板生长情况
图3 诱变菌株电子显微镜下细胞形态
图4 诱变菌株麦芽汁-碳酸钙平板生长情况
图5 诱变菌株TTC平板生长情况
第六期 2015酿 酒
56
于娓娉:激光诱变选育低嘌呤啤酒酵母第六期 2015
诱变后菌株在乳酸平板上的生长情况如图 2
所示，从图 2可以看出，诱变后的菌株生长状况不
同，菌落大小不一，这说明诱变因子对各菌株的影
响不同，挑选其中菌落大、表面光滑且均层较厚的
菌株在电子显微镜下观察细胞形态，挑选细胞形态
呈圆形或卵圆形（如图 3所示）的菌株涂布麦芽汁 -
碳酸钙平板，诱变菌在麦芽汁 - 碳酸钙平板生长状
况如图 4 所示，从图 3 可以看出，不同菌的溶钙圈
大小不同，通过溶钙圈直径（r2）与菌落直径（r1）比
值大小来考察菌株生长活力，其比值越大，菌种生
长活力越强，反之越差[12]。酵母菌生长活力不同，产
酸能力不同，为了保证啤酒风味，要选择产酸能力
适中的菌种作为目标菌，因此最终选择 r2/r1值居中
的菌点接 TTC平板。
筛选出的诱变菌种在 TTC平板生长情况如图 5
所示，筛选出的菌在 TTC平板上的菌落颜色深浅不
一，这说明菌株的发酵能力不同，颜色越深，菌种产
酒精能力越强，说明其发酵能力越强，因此，挑选颜
色深的菌种作为目标菌。
2.2 目标菌的复筛
通过初筛选出 30株菌发酵实验，相同条件下
用原菌 VS进行发酵实验作对照，发酵结束测量发
酵液中总嘌呤含量，部分嘌呤含量较低的实验结果
见表 1。
从表 1可以看出，各菌种所酿造啤酒中嘌呤总
含量存在差别，所列出菌种酿造啤酒中总嘌呤量均
低于原菌 VS的产量，尤其是 V003、V006、V007、
V020及 V022五株菌，所产啤酒总嘌呤含量不超过
40mg/L。因此可以利用以上五株菌进行啤酒发酵性
能实验及遗传稳定性实验，从而筛选出一株优良菌
株。
2.3 终筛
2.3.1 啤酒酵母双乙酰还原能力测定
双乙酰还原能力是考察啤酒酵母菌质量的重
要指标，因此筛选菌种还原能力强是酵母菌必备条
件之一[13]。对照菌与筛选菌种的双乙酰变化曲线如
图 6所示。筛选出的五株菌与对照菌 VS相比较，除
V007外，其它四株菌双乙酰峰值都低于原菌，但菌
种 V003双乙酰峰值较低，且还原速率也较慢，其他
三株菌 V006、V020、V022双乙酰峰值低于原菌，且
还原速率较快，发酵至第十天，双乙酰含量基本降
至 0.1ppm以下。
2.3.2 啤酒酵母发酵性能测定
分别利用对照菌与复筛菌株进行啤酒发酵，发
酵结果如表 2所示。真实发酵度是考察啤酒酵母发
酵能力的重要指标，对于下面发酵酵母，优良菌种
的发酵度应保持在 55%~60%范围内[13]，从表中可以
看出，V022发酵度偏高，而其它五株菌都保持在适
度范围内；从啤酒中双乙酰含量看，只有 V006、
V020、V022三株菌所产啤酒双乙酰含量低于阈值；
高级醇是啤酒酵母发酵代谢副产物，在淡色啤酒中
含量在 50mg/L~90mg/L范围内，其含量过低啤酒淡
而无味，含量过高啤酒易上头[14,15]，从表中所列数据
可以看出，除 V022外其他菌种产高级醇含量始中；
乙醛是啤酒中的重要醛类物质，在啤酒中的阈值是
10 mg/L，菌种 V003、V007、V022所产啤酒乙醛含量
较原菌高，且高于阈值范围。
综上，复筛菌株中，只有 V020各项发酵性能指
标优于对照菌 VS，因此最终选定 V020 为终筛菌
株。
2.4 筛选菌种遗传稳定测定
优良的啤酒酵母菌，不仅要具有良好的发酵性
能，还要具备一定的遗传稳定性，一般而言，啤酒酵
表1 初筛菌种酿造啤酒中总嘌呤的含量
菌种
VS
V001
V003
V006
V007
V013
总嘌呤含量 /mg·L-1
52.0238
43.0973
29.1405
33.4312
36.0756
40.0012
菌种
V015
V016
V020
V022
V025
V026
总嘌呤含量 /mg·L-1
42.0178
44.2976
30.3214
36.7813
40.2301
48.1029
双
乙
酰
含
量
/m
g·
L-
1
VS
V003
V006
V007
V020
V022
2.4
2.2
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
2 4 6 8 10
发酵时间 /d
图6 啤酒中双乙酰含量变化曲线
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母在工业生产中应用到 4~6 代就会出现严重的衰
退现象，因此啤酒酵母的使用一般不超过 7代。对
菌种 V020遗传稳定性考察至第八代，结果如表 3
所示。菌种 V020应用至第八代，衰退迹象并不明
显，如外观发酵度略有下降，乙醛、双乙酰含量略有
增高，但变化不大，因此可以断定，菌种 V020 具有
良好的遗传稳定性能。
表2 啤酒发酵结束测定结果
菌 种
VS
V003
V006
V007
V020
V022
真实发酵度 /%
59.96
58.82
58.64
59.67
57.22
65.43
双乙酰含量 /mg·L-1
0.12
0.18
0.09
0.18
0.08
0.09
高级醇含量 /mg·L-1
58.87
62.13
65.34
66.00
63.32
95.56
乙醛含量 /mg·L-1
9.34
11.25
8.98
12.34
9.01
14.34
总嘌呤含量 /mg·L-1
51.88
30.21
32.21
35.65
29.32
34.45
总嘌呤产量下降 /%
- - -
41.75
37.91
31.28
43.48
33.60
3 结论
激光作为一种新型诱变剂，诱变效果好，正突
变率高，在微生物育种方面正逐步展开应用。本实
验在 15mW的 He- Ne 激光器（λ=623.8nm）垂直照
射酵母菌种（小管内）30min，光斑直径 3mm，筛选到
一株低嘌呤啤酒酵母菌 V020。该菌株发酵性能好、
遗传性能稳定，嘌呤产量较原菌降低 43.48%。
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表3 V020遗传稳定性试验结果
代数
0
5
6
7
8
外观发酵度 /%
69.12
68.76
68.64
67.67
65.22
双乙酰含量 /mg·L-1
0.09
0.08
0.09
0.10
0.11
高级醇含量 /mg·L-1
65.87
68.13
65.34
66.00
69.32
乙醛含量 /mg·L-1
7.34
8.25
8.98
9.34
10.21
总嘌呤含量 /mg·L-1
31.88
30.21
32.21
32.65
33.32
第六期 2015酿 酒
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