全 文 ：第一作者简介:袁雨，硕士研究生，研究方向:消化道肿瘤的基础与临
床。E-mail:779192313@ qq． com
通讯作者:朱炳喜，主任医师，副教授，研究方向:消化道肿瘤的基础与
临床。E-mail:82200496@ 163． com
doi:10． 3969 / j． issn． 1006-5709． 2016． 06． 010
三叶青水提取物对 NK 细胞杀伤胃癌 BGC-823 细胞的
影响
袁 雨1，朱炳喜1，刘军权2，周 燏2，吕小婷2，周忠海2，陈永强2，杨 阳2
1． 徐州医科大学，江苏 徐州 221002;2． 中国人民解放军第九七医院
【摘要】 目的 探讨三叶青水提取物对人 NK细胞杀伤胃癌 BGC-823 细胞的影响及机制。方法 采用干细胞生长培养基(SCGM)
体外扩增人外周血 NK细胞，不同浓度三叶青水提取物作用于 NK细胞后，采用 CCK8 法检测三叶青水提取物对 NK 细胞增殖率的
影响，流式细胞术(FCM)检测 NK细胞穿孔素(PFP)、颗粒酶 B(GraB)及 CD107a的表达，乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测 NK细胞对
胃癌 BGC-823 细胞的杀伤活性。结果 三叶青水提取物作用人 NK细胞 48 h后，三叶青水提取物 0． 0003 ～ 78． 125 μg /ml 浓度组的
NK细胞增殖明显(P ＜ 0． 05);三叶青水提取物 0． 305 ～ 4． 883 μg /ml浓度组人 NK细胞 PFP、GraB及 CD107a表达高于对照组(P ＜
0． 05) ;三叶青水提取物 0． 305 ～ 19． 531 μg /ml 浓度组人 NK细胞对胃癌 BGC-823 细胞杀伤活性较对照组增强，差异有统计学意义
(P ＜ 0． 05)。结论 三叶青水提取物能促进 NK细胞的增殖，能增强 NK细胞对胃癌 BGC-823 细胞的杀伤活性，这可能与三叶青水
提取物上调 NK细胞 PFP、GraB及 CD107a表达有关。
【关键词】 三叶青;NK细胞;胃癌 BGC-823 细胞;杀伤活性
中图分类号:Ｒ735． 2 文献标识码:A 文章编号:1006 － 5709(2016)06 － 0633 － 05 收稿日期:2015-10-20
Effect of the water extract of Tetrastigma hemsleyani on the cytotoxic activity of NK
cells against gastric cancer cell lines BGC-823
YUAN Yu1，ZHU Bingxi1，LIU Junquan2，ZHOU Yu2，LV Xiaoting2，ZHOU Zhonghai2，CHEN Yongqiang2，
YANG Yang2
1． Xuzhou Medical University，Xuzhou 221002;2． The 97th Hospital of Chinese PLA，China
【Abstract】 Objective To explore the effect and mechanism of the water extract of Tetrastigma hemsleyani on the cy-
totoxic activity of NK cells against gastric cancer cell lines BGC-823． Methods The amplification of human NK cells
was induced by stem cell growth medium (SCGM)in vitro． NK cells with different concentrations of water extract of Tet-
rastigma hemsleyani in vitro were cultured． CCK8 assay was used to measure the growth curve of NK cells． The expres-
sions of perforin (PFP)，Granzyme B (GraB)and CD107a on NK cells were detected by flow cytometry (FCM)． The
cytotoxic activity of NK cells to gatric cancer BGC-823 cells was detected by lactate dehydrogenase (LDH)release． Ｒe-
sults With the water extract of Tetrastigma hemsleyani after 48 hours，the proliferation rate of human NK cells was in-
creased significantly with the water extract of Tetrastigma hemsleyani at concentrations from 0． 0003 to 78． 125 μg /ml
(P ＜ 0． 05) ;the expressions of GraB，PFP and CD107a of human NK cells with the water etract of Tetrastigma hemsley-
ani at concentrations from 0． 305 to 4． 883 μg /ml were significantly higher than control group (P ＜ 0． 05) ;the cytotoxic
activity of human NK cells against BGC-823 with the water extract of Tetrastigma hemsleyani at concentrations from
0． 305 to 19． 531 μg /ml was remarkably higher than the control group (P ＜ 0． 05)． Conclusion The water extract of
Tetrastigma hemsleyani at a certain range of concentrations could promote the proliferation of NK cells and enhance the
cytotoxic activity of NK cells to BGC-823 cells． The possible mechanism may be that the water extract of Tetrastigma
hemsleyani could increase expressions of PFP，GraB and CD107a．
【Key words】 Tetrastigma hemsleyani;NK cells;Gastric cancer cell lines BGC-823;Cytotoxic activity
三叶青(Tetrastigma hemsleyani)为葡萄科崖爬藤
属植物三叶崖爬藤，主要分布于我国西南及安徽、浙
江、江西等地［1］。作用于机体后可发挥清热解毒、活
血止痛、祛风化痰、调节免疫等作用，现在临床上多采
用三叶青治疗哮喘、肺炎、肝炎、风湿、咽痛、瘰疬等疾
病，且具有很好的疗效［2］。近几年来，三叶青的抗肿
瘤作用成为研究热点，许多文献［3-4］报道三叶青提取
物在体外具有抑制肿瘤细胞增殖及诱导其凋亡的作
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用。自然杀伤细胞(natural killer cells，NK)是人体固
有免疫的主要淋巴细胞之一，无需事先致敏和免疫即
可识别肿瘤及病毒感染细胞，发挥细胞毒性无主要组
织相容性复合体(major histocompatibility complex，
MHC)限制性［5］。NK 细胞杀伤肿瘤细胞主要是通过
Fas和 FasL 相互作用后释放颗粒酶 B(Granzyme B，
GraB)和穿孔素(perforin，PFP)来实现［6］。本实验主
要研究三叶青水提取物在体外作用于人 NK 细胞后对
人 NK细胞杀伤胃癌 BGC-823 细胞的影响及其可能的
机制，为将来深入研究三叶青的抗肿瘤机制提供实验
依据。
1 材料与方法
1． 1 实验材料 三叶青块茎(浙江汉邦生物科技有
限公司);人胃癌细胞株 BGC-823(中国科学院上海细
胞研究所);二甲亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)
(Sigma公司);人 AB血浆(徐州市血站);淋巴细胞分
离液(中国科学院血液病研究所);ＲPMI 1640 培养基、
胰蛋白酶、胎牛血清(Gibco 公司);PE 标记的 CD3、
FITC标记的 CD56(美国 BD 公司);PE 标记的 GraB
(Granzyme B，GraB)、穿孔素(Perforin，PFP)(Ebio-
science 公司);乳酸脱氢酶试剂盒、APC 标记的
CD107a(美国 BD公司);CCK8 试剂(碧云天生物技术
研究所)。
1． 2 主要仪器 恒温 CO2 培养箱(德国 Heraeus 公
司);倒置显微镜(德国 Wilovert 公司);超净工作台
(苏州净化设备厂);低温高速离心机(德国 Eppendorf
公司);流式细胞检测仪(美国 BD 公司);SEAC 全自
动酶免系列分析仪(北京西亚克技术有限公司)。
1． 3 三叶青水提取物制备 由解放军第九七医院药
剂科杨阳［7］进行提取，取三叶青干燥药材 200 g，加 5
倍体积 80%乙醇水溶液浸泡 24 h 后，加热回流提取，
共 3 次，每次 40 min，合并提取液，过滤，减压回收蒸
干，得总提取物。取总提取，加水混悬，分别采用 10 倍
体积的石油醚、乙酸乙酯等进行分步萃取。将上述经
有机溶剂提取后的三叶青药材水煮后减压回收蒸干，
获得三叶青水提取物。
1． 4 NK 细胞培养及表型鉴定 取健康成年志愿者
外周静脉血 20 ml，低分子肝素钠抗凝后加入淋巴细胞
分离液，离心 2 000 r /min × 13 min(离心半径为 10
cm)。玻璃吸管吸取单个核细胞层，PBS 洗涤 2 次，将
细胞加入含有 rhIL-2 和人 AB 血浆的 SCGM 培养基
中，置于 37 ℃、5% CO2 培养箱中培养。收集培养10 d
的 NK 细胞，PBS 洗涤后将细胞浓度调整为 1 × 106 /
ml。在细胞悬液中加入 FITC-Anti-CD56 和 PE-Anti-
CD3，室温下避光孵育 15 min，PBS 洗涤并重悬细胞，
采用流式细胞术检测 NK细胞表型。
1． 5 胃癌细胞株 BGC-823 的培养 取复苏后的胃癌
BGC-823细胞加入细胞培养瓶，随后加入含 10%胎牛血
清的 ＲPMI 1640培养液15 ml，于 37 ℃、5% CO2 的培养
箱中培养。每天观察细胞生长情况，根据细胞生长情况
进行换液。待细胞铺满瓶底时，用 2． 5 g /L胰蛋白酶消
化细胞使其脱壁，收集细胞后离心 800 r /min ×3 min，弃
去上清，使用生理盐水反复吹打混匀细胞，计数后用于
实验。
1． 6 CCK8 法检测三叶青水提取物对人 NK 细胞增
殖的影响 取培养 10 d 的 NK 细胞，将其配制成 1 ×
105 /ml，以 180 μl /孔的剂量接种于 96 孔板。设置对照
组和实验组，对照组不加三叶青水提取物，实验组加入
三叶青水提取物(终浓度分别为 0． 0003、0． 0012、
0． 0048、0． 019、0． 076、0． 305、1． 221、4． 883、19． 531、
78． 125、312． 5、1250 μg /ml)，每组设 3 个复孔，将 96 孔
板放入 37 ℃、5% CO2 培养箱中继续培养 NK 细胞
24 h、48 h、72 h，随后在每孔中加入 CCK8 20 μl，继续培
养 4 h后弃去上清。将酶标仪测定波长调为 450 nm，检
测 96孔板各孔吸光度(OD)值，根据公式计算细胞增殖
率(%)，每组实验重复 3 次，取平均值。增殖率(%)=
(实验组 OD 值 － 对照组 OD 值)/对照组 OD 值
×100%。
1． 7 流式细胞术检测三叶青水提取物作用 48 h 后
NK细胞 PFP、GraB、CD107a 的表达 NK 细胞培养
10 d后，将其铺入 6孔板，3 ml /孔。设置对照组和实验
组，对照组不加三叶青水提取物，实验组加入不同浓度
三叶青水提取物(终浓度分别为 0． 076、0． 305、1． 221、
4． 883、19． 531 μg /ml)，用 PBS 洗涤 3 次后将细胞数调
至1 × 106 /ml。每管加入 FITC-Anti-CD56 和 PE-Anti-
CD3各 20 μl，GraB和 PFP组均加入固定剂 100 μl及破
膜剂 100 μl，随后分别加入 anti-GraB-PE、anti-PFP-PE
各 5 μl。CD107a组不加入破膜剂，仅加入 anti-CD107a-
APC，三组均设置同型对照抗体管，孵育、洗涤后采用流
式细胞检测仪检测 NK细胞 GraB、PFP 及 CD107a 的表
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达，每组实验重复 3次，取平均值。
1． 8 LDH 释放法检测三叶青水提取物作用 48 h 后
NK细胞对胃癌 BGC-823 细胞的杀伤活性 取培养
10 d的 NK细胞铺入 6 孔板，3 ml /孔。对照组不加三
叶青水提取物，实验组加入不同浓度的三叶青水提取
物(终浓度分别为 0． 076、0． 305、1． 221、4． 883、19． 531
μg /ml)，继续培养 48 h，收集 NK 细胞作为效应细胞，
胃癌 BGC-823 细胞作为靶细胞，将效应细胞和靶细胞
分别配成 2 × 106 /ml 和 2 × 105 /ml 的细胞悬液，效靶
细胞等体积混合(效靶细胞数比例为 10∶ 1)。将混合
后的效靶细胞置于 37 ℃、5% CO2 培养箱中孵育 6 h
后，离心 1 500 r /min × 10 min，取上清液。按 LDH 试
剂说明书要求操作，340 nm波长下全自动生化分析仪
测定吸光度值(A)，每检测样本设 3 个复管，实验重复
3 遍。NK细胞的杀伤活性(%)=(A实验组 － A效应
细胞自然释放组)/(A 靶细胞最大释放组 － A 靶细胞
自然释放组)× 100%。
1． 9 统计学方法 采用 SPSS 13． 0 软件进行统计分
析，计量资料用 x－ ± s 表示，多组间比较采用单因素方
差分析(One-way ANOVA)，检验水准取 α = 0． 05，P ＜
0． 05 为差异有统计学意义。
2 结果
2． 1 人 NK细胞的培养及鉴定 NK细胞培养结果显
示，人 NK细胞在体外扩增培养 10 d后，可见大的集落
和散在的细胞生长，单个细胞呈椭圆形或梭形生长。
流式细胞术检测结果显示，PBMC 未培养前 NK 细胞
(CD3 － CD56 +)比例为 6． 12%，培养 10 d 后 NK 细胞
比例增加到 81． 33%(见图 1)。
图 1 培养 10 d的 NK细胞倒置显微镜照片(400 ×)
Fig 1 Inverted microscope photo of NK cells cultured
after 10 days (400 ×)
2． 2 CCK8法检测不同浓度三叶青水提取物对 NK细
胞增殖的影响 三叶青水提取物作用于 NK细胞 24 h、
48 h和72 h后，三叶青水提取物0． 0012 ～78． 125 μg /ml
浓度组的 NK细胞增殖率均较对照组升高(P ＜ 0． 05)。
三叶青水提取物作用 24 h和 48 h 后 1 250 μg /ml 组和
72 h后 312． 5 ～ 1 250 μg /ml 组对 NK 细胞生长有抑制
作用(P ＜ 0． 05)。相同浓度的三叶青水提取物作用于
NK细胞后(0． 076 ～78． 125 μg /ml 浓度组)，48 h 组 NK
细胞增殖率与 24 h、72 h组比较，差异有统计学意义(P
＜0． 05);作用 48 h 时，三叶青水提取物浓度为
1． 221 μg /ml时细胞增殖率为(41． 75 ±2． 64)%，达到最
高值(见图 2)。
注:与对照组比较，* P ＜0． 05;浓度相同时，与其他时间组比较，
△P ＜0． 05。
图 2 不同浓度三叶青水提取物对 NK细胞增殖率的影响
Fig 2 Effect of different concentrations of water extract of
Tetrastigma hemsleyani on the proliferation rate of NK cells
2． 3 三叶青水提取物对 NK 细胞 PFP、GraB、
CD107a表达的影响 三叶青水提取物作用于 NK 细
胞 48 h后，NK细胞 PFP、GraB和 CD107a的表达均有
升高，0． 305 ～ 4． 883 μg /ml 浓度组与对照组比较，差
异均有统计学意义(P ＜ 0． 05);且当三叶青水提取物
浓度为 1． 221 μg /ml 时，GraB、PFP 和 CD107a 的表达
率均达到最大值;浓度 ＞ 1． 221 μg /ml 时，三者的表达
率开始下降(见表 1、图 3)。
表 1 不同浓度三叶青水提取物对 NK细胞 PFP、GraB、CD107a
表达的影响(x－ ± s，%)
Tab 1 Effect of different concentrations of water extract of
Tetrastigma hemsleyani on the expressions of PFP，GraB，
CD107a in NK cells (x－ ± s，%)
三叶青水提
取物(μg /ml)
PFP GraB CD107a
0(对照组) 72． 89 ± 2． 08 53． 69 ± 3． 55 83． 76 ± 3． 76
0． 076 76． 16 ± 3． 12 56． 68 ± 2． 13 88． 01 ± 1． 86
0． 305 82． 58 ± 3． 84* 62． 47 ± 2． 60* 90． 45 ± 2． 63*
1． 221 90． 17 ± 2． 14* 69． 19 ± 1． 33* 93． 91 ± 2． 08*
4． 883 83． 81 ± 4． 47* 67． 44 ± 2． 04* 90． 68 ± 3． 26*
19． 531 80． 61 ± 2． 73* 60． 56 ± 3． 05* 84． 10 ± 2． 47
注:与对照组相比，* P ＜ 0． 05。
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注: A1 ～ 3:同型对照组;B1 ～ 3:对照组;C1 ～ 3:实验组。
图 3 NK细胞 PFP、GraB、CD107a的 FCM检测结果
Fig 3 Expressions of PFP，GraB，CD107a of NK cells tested by FCM
2． 4 三叶青水提取物对 NK 细胞杀伤胃癌 BGC-823
细胞的影响 浓度为 0． 305 ～ 19． 531 μg /ml的三叶青
水提取物作用 NK细胞 48 h 后，NK 细胞对胃癌 BGC-
823 细胞的杀伤活性较对照组增强(P ＜ 0． 05);且浓
度为 1． 221 μg /ml时，NK细胞对胃癌 BGC-823 细胞的
杀伤活性达到最大［(67． 75 ± 2． 58)%，见图 4］。
注:与对照组比较，* P ＜ 0． 05。
图 4 三叶青水提取物对 NK细胞杀伤活性的影响
Fig 4 Effect of water extract of Tetrastigma hemsleyani on
killing activity of NK cells
3 讨论
近年来，从天然中药中寻找活性成分成为抗肿瘤
药物发展的重点之一。三叶青为我国特有珍稀植物，
研究［8-9］发现三叶青多种提取成分在体外可抑制肿瘤
细胞的生长。丁丽等［10-11］发现三叶青水提取物对胃
癌、宫颈癌及恶性黑色素瘤有较强抑制作用。然而，三
叶青水提取物对体外诱导培养的 NK 细胞的增殖作用
及其免疫学影响尚未见报道。本实验结果表明，三叶
青水提取物作用于 NK细胞 24 h、48 h和 72 h后，三叶
青水提取物浓度为 0． 0012 ～ 78． 125 μg /ml 时可促进
NK细胞的增殖，浓度为 0． 0012 ～ 1． 221 μg /ml 时，三
叶青水提取物促进 NK 细胞增殖呈上升趋势，浓度为
1． 221 μg /ml 时，NK 细胞增殖率达峰值，1． 221 ～
78． 125 μg /ml时三叶青水提取物促进 NK细胞增殖呈
下降趋势，由此说明三叶青水提取物对 NK 细胞具有
双向调节作用，在适宜的浓度下可促进 NK 细胞增殖，
提示三叶青水提取物对 NK 细胞的增殖具有一定程度
的促进作用，这可能对提高体外培养 NK 细胞的数量
用于肿瘤的免疫治疗提供了实验依据。
NK 细胞是固有免疫应答中最主要的效应细胞
群，其两大主要功能是识别与溶解肿瘤细胞和病毒感
染细胞及产生免疫调节性细胞因子［12］。NK细胞功能
低下或缺陷的患者易发感染，且肿瘤的发生率和转移
率提高［13］。彭六生等［14］研究发现胃癌患者肿瘤组织
内 NK细胞的百分率与胃癌的进展密切相关，且高于
NK细胞百分率中位数的患者总体存活时间较长。本
实验发现，0． 305 ～ 19． 531 μg /ml 的三叶青水提取物
作用于 NK细胞后能提高 NK细胞对胃癌 BGC-823 细
胞的杀伤作用，且 NK 细胞杀伤活性增高趋势与三叶
青水提取物作用于 NK 细胞后 NK 细胞增殖增长趋势
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一致，由此提示，三叶青水提取物可能通过促进 NK 细
胞的增殖进而增强对胃癌 BGC-823 细胞的抑制。
穿孔素和颗粒酶被认为是存在于细胞毒性 T 淋
巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)和 NK 细胞中的
具有细胞毒性的物质。GraB 以酶原的形式合成加工
后储存在细胞质颗粒内，细胞质颗粒内的酸性环境可
保持 GraB处于非活性状态，从而保障细胞不被自身颗
粒酶溶解，然而当与靶细胞接触后，穿孔素可从这些细
胞中释放出来，在靶细胞膜上形成穿孔素管道，GraB
N-端的酸性二肽被切除成为活性型 GraB，通过靶细胞
膜上的多聚穿孔素通道进入靶细胞从而杀伤靶细
胞［15］。因此，穿孔素和颗粒酶被认为是可以反映 NK
细胞功能活性的可靠指标。此外，CD107a 分子随着
细胞脱颗粒到达细胞膜表面，且其表达程度与穿孔素
的分泌多少一致。因此，NK细胞表达 CD107a 分子也
可代表其具有杀伤活性［16］。本实验发现，0． 305 ～
4． 883 μg /ml浓度组三叶青水提取物作用于 NK 细胞
48 h后，与对照组相比，PFP、GraB、CD107a 的表达均
有不同程度的增加，差异有统计学意义，且在三叶青水
提取物浓度为 1． 221 μg /ml 时，PFP、GraB、CD107a 表
达均达最高。这与三叶青水提取物作用后 NK 细胞对
胃癌 BGC-823 细胞杀伤活性的峰值一致，表明三叶青
水提取物增强 NK细胞对胃癌 BGC-823 细胞的杀伤活
性，我们猜测这可能与三叶青水提取物上调 PFP、
GraB、CD107a的表达有关。
综上所述，三叶青水提取物不仅能够促进 NK 细
胞的增殖，而且可以增强其杀伤胃癌细胞的能力，我们
推测这可能与三叶青水提取物促进 NK 细胞 PFP、
GraB及 CD107a 的表达有关，可为三叶青用于胃癌的
免疫治疗提供一定的实验依据。
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(责任编辑:马 军)
·736·胃肠病学和肝病学杂志 2016 年 6 月第 25 卷第 6 期 Chin J Gastroenterol Hepatol，Jun 2016，Vol． 25，No． 6