全 文 ：收稿日期:2015-05-15
基金项目:湖北省 2014 年中青年创新团队项目(T201414)
作者简介:张晨宁(1988-)，男，硕士，讲师，主要从事中药药代动力学研究;E-mail:ZhangCN1118@ 163. com。
* 通讯作者:杨光义，E-mail:13971908289@ 163. com。
UPLC-MS /MS法测定南方山荷叶与八角莲中
4 种木脂素类成分的含量
张晨宁1，杨光义1* ，魏晋宝1，叶 方1，雷 攀1，吴婷婷2
(1. 湖北医药学院附属太和医院，湖北 十堰 442000;2. 湖北医药学院药学院，湖北 十堰 442000)
摘要 目的:建立 UPLC-MS /MS 法测定南方山荷叶与八角莲中鬼臼毒素-4-O-葡萄糖苷、4-去甲鬼臼毒素、鬼
臼毒素、4-去氧鬼臼毒素的含量。方法:采用 Waters BEH C18色谱柱(100 mm × 2. 1 mm，1. 7 μm)，以甲醇-0. 1%甲
酸溶液(10 mmol /L乙酸铵)为流动相进行梯度洗脱;流速为 0. 3 mL /min;柱温为 30 ℃;质谱条件:采用正离子的模
式，以 MＲM配对离子方式进行定量分析。结果:4 种木脂素类成分均在 4 min内出峰且分离良好，鬼臼毒素-4-O-葡
萄糖苷、4-去甲鬼臼毒素、鬼臼毒素、4-去氧鬼臼毒素分别在 156. 25 ～ 10 000 ng /mL、40. 63 ～ 2 600 ng /mL、159. 38 ～
10 200 ng /mL、8. 13 ～ 520 ng /mL范围内线性关系良好(r ＞ 0. 998)，平均加样回收率为 98. 2% ～ 105. 0%，ＲSD均小
于 4. 2%(n = 3)。结论:该方法专属性强、快速灵敏，可用于南方山荷叶与八角莲中多种成分含量的测定。
关键词 南方山荷叶;八角莲;UPLC-MS /MS;含量测定
中图分类号:Ｒ284. 1 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2015)12-2550-04
DOI:10. 13863 / j. issn1001-4454. 2015. 12. 024
《神农本草经》记载鬼臼的根茎和须根均可入
药，具有散瘀止痛、活血止血等功效〔1，2〕。现代研究
表明，鬼臼亚科均含鬼臼毒素等芳基四氢萘类木脂
素成分，该类化学成分具有显著的抗肿瘤等活性，但
又是其主要的毒性成分，毒理实验研究表明其极易
引起中枢神经系统、消化系统以及心血管系统等系
统病变〔3〕。有关鬼臼类药材品种滥用、误用等造成
中毒事件时常发生〔4，5〕，已引起广泛关注。
目前鬼臼亚科植物相关化学成分含量测定方法
研究较多，但多集中于薄层扫描法、紫外分光光度法
和高效液相色谱法〔6-9〕。研究表明，鬼臼亚科植物中
主要含有 1-苯基四氢萘结构化合物，该类化学成分
结构中多含有手性碳原子，相关立体异构体的色谱
行为极其相似，常规 C18柱极难将其分离，或者存在
分析时间较长、峰型较差及定量不准确等难题。超
高效液相色谱串联质谱仪(UPLC-MS /MS)具有极高
的分离效能、高灵敏度、高选择性等优点，适合该类
化学成分分析。
南方山荷叶和八角莲分别为小檗科鬼臼亚科山
荷叶属植物南方山荷叶 Diphylleia sinensis H． L． Li、
八角莲属八角莲 Dysosma versipellis(Hance)M． Cheng
ex Ying 的干燥根茎。本文建立了 UPLC-MS /MS 法
测定南方山荷叶与八角莲中 4 种木脂素类成分(鬼
臼毒素-4-O-葡萄糖苷、4-去甲鬼臼毒素、鬼臼毒素、
4-去氧鬼臼毒素)的含量方法，以期为准确测定鬼臼
类植物化学成分提供科学依据，为进一步探索鬼臼
类中药相关药效或毒性成分的药代动力学、毒理学
等研究奠定基础。
1 仪器与材料
1. 1 仪器 Waters ACQUITY UPLC 液相色谱仪;
Waters三重四级杆串联质谱仪(XEVO TQ);Massl-
ynx 4. 1 数据处理软件(美国 Waters 公司);KM-
410C型超声清洗器(广州市科洁盟实验仪器有限公
司);VOＲTEX-6 微型涡旋混合仪(海门市其林贝尔
仪器制造有限公司)。
1. 2 材料 实验用南方山荷叶和八角莲药材采自
湖北省十堰市武当山地区，经湖北医药学院陈吉炎
教授鉴定为小檗科鬼臼亚科山荷叶属植物南方山荷
叶 Diphylleia sinensis H. L. Li和八角莲属植物八角莲
Dysosma versipellis (Hance)M. Cheng ex Ying的干燥
块茎。4-去氧鬼臼毒素对照品(TOＲONTO ＲESEAＲCH
CHEMICALS INC，批号:1-AKS-159-1);鬼臼毒素-4-
O-葡萄糖苷对照品(上海源叶生物科技有限公司，
批号:ZN1113BB14);鬼臼毒素 (批号:111645-
200602)、4-去甲鬼臼毒素(批号:111792-200901)
对照品购自中国食品药品检定研究院。实验用水为
超纯水;甲醇为 LC-MS 级(Merck KGaA);其他试剂
为分析纯。
2 方法与结果
2. 1 色谱和质谱条件 色谱条件:Waters BEH C18
色谱柱(100 mm × 2. 1 mm，1. 7 μm);流动相:甲醇
(A)-0. 1%甲酸溶液(10 mmol /L乙酸铵)(B) ，梯度
·0552· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 38 卷第 12 期 2015 年 12 月
洗脱(0 ～ 4. 5 min，50% ～ 65% A;4. 5 ～ 5. 5 min，
65% ～95%A;5. 5 ～ 6. 5 min，95% A;6. 5 ～ 8. 0 min，
95% ～50%A);流速:0. 3 mL /min，柱温:30 ℃;进样
量:2 μL。质谱条件:Waters三重四级杆串联质谱仪
(XEVO TQ)，电喷雾离子源(ESI)，MassLynx 4. 1 工
作站;毛细管电压 3. 8 kV;离子源温度 150 ℃;脱溶
剂气温度为 350 ℃;喷雾气为 650 L /h的 N2;碰撞气
为 0. 16 mL /min Ar2;扫描方式多反应正离子监测模
式(MＲM)，质谱条件见表 1。LC-MS /MS图见图 1。
2. 2 对照品溶液的制备 取 4 种对照品各 5 mg，
精密称定，分别置于 10 mL 量瓶中，加甲醇溶解定
容，最终4种化合物浓度分别为鬼臼毒素-4-O-葡萄
表 1 4 种待测化合物质谱检测条件
化合物 母离子 /Da 子离子 /Da 驻留时间 / s 锥孔电压 /V 碰撞电压 /V
鬼臼毒素-4-O-葡萄糖苷 593. 96 396. 98 0. 2 20 16
4-去甲鬼臼毒素 417. 96 246. 94 0. 2 14 16
鬼臼毒素 431. 91 246. 9 0. 2 14 16
4-去氧鬼臼毒素 415. 67 230. 95 0. 2 10 16
图 1 多反应监测模式下 4 种木脂素类成分的 LC-MS/MS图
A. 对照品 B. 八角莲药材 C. 南方山荷叶药材 1. 鬼臼毒素-4-O-葡萄糖苷 2. 4-去甲鬼臼毒素 3. 鬼臼毒素 4. 4-去
氧鬼臼毒素
·1552·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 38 卷第 12 期 2015 年 12 月
糖苷 0. 50 mg /mL、4-去甲鬼臼毒素 0. 52 mg /mL、鬼
臼毒素 0. 51 mg /mL、4-去氧鬼臼毒素 0. 52 mg /mL。
2. 3 供试品溶液的制备 取药材粉末(过 40 目
筛)50 mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲
醇 50 mL，称定重量，超声(250 W，40 kHz)处理 30
min，冷却至室温，加甲醇补足减失质量，吸取 1 mL
上清液至 10 mL量瓶中加入甲醇定容，0. 22 μm 微
孔滤膜过滤，取续滤液供 UPLC-MS /MS 测定，进样
体积为 2 μL。每 1 个样品进行 3 次样本分析，以平
均值计算其含量。
2. 4 线性范围和检出限 分别吸取各对照品储备
液配制混合对照品溶液，最终制备成浓度分别为 10
μg /mL鬼臼毒素-4-O-葡萄糖苷、2. 6 μg /mL 4-去甲
鬼臼毒素、10. 2 μg /mL 鬼臼毒素、0. 52 μg /mL 4-去
氧鬼臼毒素的混合对照品溶液，再用甲醇稀释制备
得到一系列混合对照品溶液，按“2. 1”项下色谱条
件测定，记录色谱峰面积，以峰面积(Y)对浓度(X)
进行线性回归，结果见表 2。
表 2 标准曲线、线性范围、相关系数及定量限
化合物 标准曲线 r 线性范围 /(ng /mL) 检测限 /(ng /mL)
鬼臼毒素-4-O-葡萄糖苷 Y = 120. 727X + 611. 992 0. 999 156. 25 ～ 10000 0. 006
4-去甲鬼臼毒素 Y = 96. 852X － 1083 0. 998 40. 63 ～ 2600 0. 07
鬼臼毒素 Y = 118. 049X － 1763. 52 0. 998 159. 38 ～ 10200 0. 002
4-去氧鬼臼毒素 Y = 79. 659X + 43. 246 0. 999 8. 13 ～ 520 0. 04
2. 5 精密度试验 取同一份供试品溶液，按已确
定的色谱条件连续测定 6 次，供试品中 4 种待测成
分的峰面积 ＲSD 分别为鬼臼毒素-4-O-葡萄糖苷
2. 48%，4-去甲鬼臼毒素 1. 27%，鬼臼毒素 0. 86%，
4-去氧鬼臼毒素 4. 26%，表明仪器精密度良好。
2. 6 重复性试验 精密称取八角莲药材样品(过
40 目筛)6 份，每份 50 mg，按照已确定的方法制得
6 份供试品溶液，进样 2 μL，结果 6 份供试品溶液中
4 种被测成分的峰面积 ＲSD 分别为鬼臼毒素-4-O-
葡萄糖苷 1. 77%，4-去甲鬼臼毒素 2. 44%，鬼臼毒
素 0. 72%，4-去氧鬼臼毒素 3. 28%，表明该方法的
重复性良好。
2. 7 加样回收率试验 精密称取八角莲药材样品
9 份，向其中加入高、中、低三个浓度(n = 3)的对照
品溶液。按照“2. 3”项下方法处理后进样分析，每 1
个浓度进行 3 次样本分析，以计算所得的实际值与
加入量的比值即为其准确度。4 种化合物的平均加
样回收率分别为鬼臼毒素-4-O-葡萄糖苷 105. 0%，
4-去甲鬼臼毒素 98. 2%，鬼臼毒素 101. 6%，4-去氧
鬼臼毒素 98. 4%，其 ＲSD均小于 4. 2%。
2. 8 稳定性试验 精密称取八角莲药材粉末(过
40 目筛)50 mg，按照“2. 3”项下方法制得供试品溶
液，分别在 0、2、4、8、12 h各进样 1 次，进样 2 μL，根
据峰面积计算 ＲSD，考察样品稳定性。样品中 4 种
被测成分的峰面积 ＲSD 分别为鬼臼毒素-4-O-葡萄
糖苷 0. 92%，4-去甲鬼臼毒素 1. 72%，鬼臼毒素
1. 44%，4-去氧鬼臼毒素 2. 85%，表明供试品溶液在
12 h内稳定。
2. 9 样品含量测定 分别称取八角莲与南方山荷
叶粉末 50 mg(n = 3)，精密称定，按“2. 3”项下方法
制备供试品溶液，分别进样 2 μL，在“2. 1”项色谱条
件下进行分析，测定峰面积，以回归方程计算 4 种待
测成分在两种药材中的含量。各样品测定结果表明
南方山荷叶中鬼臼毒素-4-O-葡萄糖苷含量为
0. 202%，4-去甲鬼臼毒素含量为 1. 465%，鬼臼毒
素含 量 为 1. 232%，4-去 氧 鬼 臼 毒 素 含 量 为
0. 069%;八角莲中鬼臼毒素-4-O-葡萄糖苷含量为
5. 867%，4-去甲鬼臼毒素含量为 1. 144%，鬼臼毒
素含 量 为 7. 442%，4-去 氧 鬼 臼 毒 素 含 量 为
0. 056%。
3 讨论
3. 1 色谱条件筛选时分别考察了乙腈-水、乙腈-5
mmol /L乙酸铵溶液、乙腈-0. 1% 甲酸溶液、甲醇-
水、甲醇-5 mmol /L乙酸铵溶液、甲醇-10 mmol /L 乙
酸铵溶液、甲醇-0. 1% 甲酸溶液(10 mmol /L 乙酸
铵)等流动相系统，结果发现加入乙酸铵与加酸的
流动相，离子响应较高，且乙酸铵浓度越高响应越
好，结合文献与实验室质谱状况，采用甲醇-0. 1%甲
酸溶液(10 mmol /L 乙酸铵)作为流动相;在质谱条
件的筛选中，为使各准分子离子峰信号达到最佳，以
正、负离子模式分别进行检测，并进行二级质谱扫
描。结果发现选择正离子模式检测时，离子峰强度
较高。
3. 2 近年来，采用 LC-MS /MS 法测定中药材或中
药制剂中质控成分逐渐增多，该法针对中药材及中
药复方中化学性质及含量相差均较大的成分测定具
有极大优势。鬼臼类中药化学成分的检测方法主要
有高效液相色谱法、紫外分光光度法等，但鬼臼毒素
类化学结构中含有多个手性中心，常规的液相很难
将其分离，仅以保留时间进行定性分析存在缺陷，当
·2552· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 38 卷第 12 期 2015 年 12 月
目标物浓度较低时基质干扰严重，选择性差，易出现
假阳性，且 HPLC检出限高，很多情况下不能满足该
类化学成分分析鉴定的需要。UPLC-MS /MS法同时
具备超高效液相色谱高效、快速的在线分离能力和
质谱高选择性、高灵敏度的检测能力，可以同时得到
化合物的保留时间、分子质量以及特征结构碎片等
丰富的信息，其多反应监测技术兼具有选择离子扫
描的灵敏度和二级质谱的特征性，在痕量分析方面
具有很大的优势。
3. 3 鬼臼亚科为一个自然类群，在鬼臼亚科中山
荷叶属最为原始，它通过两条方向演化，一是保持其
原来的异花授粉方向演化为足叶草属，另一方向是
转向自花授粉，自山荷叶属演化为八角莲属，然后再
演化为桃儿七属〔10〕。本文通过对鄂西北地区分布
的南方山荷叶和八角莲药材样品进行分析测定，结
果发现八角莲中 4 种测定成分总含量明显高于南方
山荷叶，实验结果为山荷叶向八角莲进化模式及次
生代谢产物累积规律研究奠定一定基础，也为该地
区频繁发生误服“江边一碗水”中毒事件提供一定
数据支撑，为进一步探索鬼臼类中药相关药效或毒
性成分的药代动力学、毒理学等深入研究奠定基础。
参 考 文 献
［1］清·顾重光 . 神农本草经［M］．北京:人民卫生出版社，
1955.
［2］江苏新医学院 . 中药大辞典［M］．下册 . 上海:上海人
民出版社，1975.
［3］ Chang LW，Yang CM，Chen CF，et al. Experimental podo-
phyllotoxin(Bajiaolian) poisoning———Ⅰ. Effects on the
nervous system［J］． Biomedical and Environmental Sci-
ences，1992，5(4) :283-292.
［4］于萍，陈吉炎，陈师西，等 . 口服鬼臼类中药中毒 46 例
分析［J］．医药导报，2010，29(22):1518-1520.
［5］金钟大，袁静 . 误饮八角莲药酒致中毒性脑病 1 例［J］．
中国中药杂志，2003，28(5):477.
［6］赵卫星，姜红波，温普红，等 . 光谱分析法测定窝儿七中
的微量元素［J］．化学与生物工程，2011，28(1):89-91.
［7］王小平，黎丹，龙凯花，等 . 一测多评法测定窝儿七中 3
个活性成分的含量［J］． 药物分析杂志，2014，34(8):
1426-1430.
［8］赖菁华，柴江，张亚强，等 . 高效液相色谱法测定窝儿七
中鬼臼毒素和 4-去甲基鬼臼毒素的含量［J］． 中南药
学，2015，13(2):169-172.
［9］尚明英，徐国钧，徐珞珊，等 . HPLC 法测定鬼臼类生药
中鬼臼木脂素的含量［J］．中国药科大学学报，1996，27
(4):219-222.
［10］马绍宾，胡志浩 . 小檗科鬼臼亚科的地理分布与系统
发育［J］．云南植物研究，1997，1(1):48-56.
·3552·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 38 卷第 12 期 2015 年 12 月