全 文 ：第 24卷　第 3期
2009 年 7 月
北　京　农　学　院　学　报
JO URNA L OF BEIJING UNIVERSITY OF AGRICULT URE
Vo l.24 , No.3
Jul., 2009
　　收稿日期:2009-03-19
　　基金项目:西藏自治区科技厅资助项目 (200422)
　　作者简介:杨　爽 (1982-), 女 , 实验员 , 研究方向:西藏当地濒危植物组织培养 , E-mai l:yangshuang346429@163.com
西藏八角莲种胚愈伤诱导的初探
杨　爽 , 王　勇2 , 陈芝兰1 , 何建清1 , 田发益1
(1.西藏大学农牧学院/生物技术中心 , 西藏林芝 860000;2.西藏林芝地区农牧局 , 西藏 林芝 860000)
摘　要:以西藏八角莲成熟种子为材料 , 研究了外植体的不同处理方法 、 激素浓度及光照条件对愈伤诱导的影
响。结果表明 , 在暗培养条件下 , 以带种胚的种子段为外植体 , 在 MS+ 6-BA 2.0 mg/ L + NAA 0.2 mg/ L 培
养基上可以获得诱导率较高的愈伤组织 , 诱导率为 66.7%。
关键词:西藏八角莲;激素;愈伤组织;诱导
中图分类号:S567.23+9.01　　文献标志码:A　　文章编号:1002-3186(2009)03-0063-03
Primary Study on the Callus Inducement from
Embryo of Dysosma tsayuensis Ying
YANG Shuang1 ,WANG Yong2 ,CHEN Zhi-lan1 ,HE Jian-qing1 ,T IAN Fa-y i1
(1.Agriculture and Animal Husbandry Colleg e , Tibe t Univer sity , Linzhi , Tibet 860000 , China;
2.Agricultural and Animal Bureau of Linzhi , Linzhi , T ibet 860000 , China)
Abstract:Using the mature seeds of Dysosma tsayuensis Ying as material , the effects of different methods on deal-
ing with the explants ,hormone concentration and illumination conditions on the callus inducement of Dysosma ts-
ayuensis Ying were studied.The results show ed that in the dark environment ,when the part of seed with the em-
bryo was chosen as the explants callus , the inducement rate was higher in the medium of MS +6-BA 2.0 mg/L +
NAA 0.2 mg/ L than in other media , and the callus inducement rate was 66.7%.
Key words:Dysosma tsayuensis Ying;hormone;callus;induce
　　西藏八角莲(Dysosma tsayuensis Ying)又名
鬼臼 、九臼 、八角盘 、独角莲 ,为小檗科(Be rberidace-
ae)八角莲属多年生草本植物[ 1] ,仅产于西藏东南部
海拔 2500 ～ 3500 m 的高山松林下或云杉林下[ 2] 。
味苦 、微辛 、性凉 ,有毒。具有解毒消肿 、祛痰止痛 、
化痰散结之功效[ 3] 。其根和根茎中含有的鬼臼毒素
是几种临床抗癌药物的前体。市场的需求造成对野
生资源的掠夺性索取 ,西藏八角莲已被列入《中国珍
稀濒危植物名录》。而笔者建立的以种子胚为外植
体诱导的愈伤组织 ,通过植物细胞大规模培养的方
式获得鬼臼毒素 ,从而为鬼臼毒素的工业化生产提
供了可能[ 4-5] 。目前关于西藏八角莲种胚愈伤诱导
的研究尚少见报道 。为此 ,以西藏八角莲成熟种子
为材料 ,进行了愈伤组织诱导条件的探索和优化 ,为
西藏八角莲组织培养提供基础研究资料。
1　材料与方法
1.1　材料来源
　　9月份采集西藏农牧学院内的西藏八角莲成熟
球果 。
1.2　外植体的处理方法
　　将刚采收的球果内的种子剥出 , 选择籽粒圆
滑 , 无病虫危害的种子 。选择后的种子用清水去掉
种子表面的果肉 ,取部分种子与适量的沙子混合 ,用
适当的手力进行揉搓 ,搓至种皮无色为止[ 6] 。将沙
搓处理的种子和未经沙搓处理的种子置于 300 mg/
L 的赤霉素溶液中浸泡 48 h ,以打破休眠[ 7] 。在无
菌操作台上将浸泡后的种子置于 0.1%的 HgCl2中
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处理 5 min后 , 用无菌水冲洗 5次。再将未经沙搓
处理的种子切成 2段 ,分无胚段 、有胚段 。将未经沙
搓处理的完整种子 、经过沙搓处理的完整种子 、有胚
的种子切段和无胚的种子切段分别接种到培养基
里 ,每瓶 4 ～ 5个种子或种子段 ,重复 10次。
1.3　激素种类和浓度的设计
　　蔗糖质量浓度 30 g/ L ,琼脂质量浓度 5 g/ L ,
pH 值 5.8 , NAA , 6-BA 和 2 ,4-D 三因素的正交设
计 ,见表 1。
表 1　激素的正交设计
Tab.1　Orthogonal design of hormones
水平 NAA质量浓度/(m g· L -1)
2 , 4-D质量浓
/(mg· L-1)
6-BA质量浓度
/(mg· L -1)
1 0 0 1.0
2 0.1 1.0 2.0
3 0.2 2.0 3.0
1.4　光照条件
　　分为 24 h 全暗培养和 12 h光照/12 h 黑暗培
养(光强为 36μmoL/(m2 · s),培养室温度为(25±
2)℃。
2　结果与分析
2.1　不同处理的外植体对西藏八角莲愈伤
诱导率的影响
　　以不同处理的种子为外植体接种到 MS+ 6-
BA 2 mg/L +NAA 0.2 mg/L 的培养基中 ,培养
条件为黑暗中 , 30 d后观察到的结果见表 2。
表 2　各处理的外植体愈伤诱导率
Tab.2　Callus inducemen trate of different explants
种　　子 完整 完整 切段 切段
处　　理 (未经沙处理)(沙处理) (有胚) (无胚)
接 种数 50 48 41 43
幼胚萌发数 0 45 40 -
愈伤产生数 0 9 27 0
幼胚萌发率/ % 0 93.7 97.6 -
愈伤诱导率/ % 0 18.7bB 65.9aA 0
　　注:表中数据为 10次重复的平均值 ,不同小写字母表示在 5%
水平显著差异 ,不同大写字母表示在 1%水平极显著差异 , 数据采用
LSD法检验。
　　从表 2中可以看出 , 未经沙搓处理的种子萌发
率为零 ,而经过沙搓处理的完整种子的萌发率与经
过切段处理的种子的萌发率均达到了 90%以上 ,说
明西藏八角莲的种子要打破休眠仅靠赤霉素浸泡是
不够的 ,还要经过沙搓处理或切段处理 。究其原因 ,
可能是在种子休眠期 ,种皮含有抑制种子萌发的物
质。完整种子萌发苗的愈伤组织产生的部位是下胚
轴 ,其愈伤诱导率低且愈伤组织块很小 ,直径多小于
5 cm 。经过切段处理的有胚种子段上产生的愈伤
组织块较大 ,直径多数在 1 ～ 2 cm ,而愈伤首先产生
于种子段的胚与胚乳交界的伤口处 ,随后慢慢向四
周扩展。这表明切段处理有利于愈伤的发生 ,可能
是由于成熟种子含有抑制种子发育的物质 ,加之种
皮包裹 ,在一定程度上阻碍了激素的吸收 ,不容易分
化为愈伤组织 。而切伤后破坏了这种作用 ,在内源
激素和外源激素的共同作用下 ,伤口处种胚的细胞
脱分化 ,进而形成愈伤组织。这种现象在黑麦草的
研究中也得到了证实[ 8] 。
2.2　不同激素对西藏八角莲愈伤诱导率的影响
　　以有胚种子段为材料 ,在 MS 培养基中加入不
同的激素 ,试验结果见表 3。
表 3　不同激素浓度处理的愈伤诱导率
Tab.3　Callus inducement rate in different
hormones of MS medium
培养基 NAA/(mg· L-1)
2 , 4-D
/(mg· L-1)
6-BA
(m g· L -1) 诱导率/%
1 0 0 3 29.4cB
2 0.1 0 1 47.1bA
3 0.2 0 2 66.7aA
4 0 1 2 14.2dB
5 0.1 1 3 12.6eC
6 0.2 1 1 18.8dB
7 0 2 1 3.5fD
8 0.1 2 2 10.3eC
9 0.2 2 3 6.4fD
k1 15.7 47.73 23.13
k2 23.33 15.2 30.4
k3 30.63 6.73 16.13
R 14.93 41 14.27
　　注:1.其中 k为各因子诱导率的平均值;R为极差。 2.表中数
据为 10次重复的平均值 ,不同小写字母表示在 5%水平显著差异 ,
不同大写字母表示在 1%水平极显著差异 ,数据采用 LSD 法检验。
　　在植物离体培养过程中 ,外植体的内源激素水
平不断变化 ,生长素类物质存在极性运输现象 ,由此
导致了其体内分布的特异性改变 ,培养基中加入生
长调节剂可以改变和影响外植体的内源激素水平。
这一变化与器官发生和愈伤组织的形成密切相
关[ 9] 。西藏八角莲愈伤组织的形成 ,是在其种子自
身的内源激素与外源激素共同调控下的结果。试验
结果表明 , 八角莲种子切段后很容易诱导出愈伤组
织 ,但出愈率与激素的种类和浓度有关 。愈伤发生
率最高的培养基是 3号培养基:MS+6-BA 2 mg/
L +NAA 0.2 mg/ L。从统计结果看 ,不同激素对
2009 年第 3 期 杨　爽 等:西藏八角莲种胚愈伤诱导的初探 65　
于愈伤诱导率的影响程度是 2 ,4-D>NAA >6-BA 。
其中 NAA 是随浓度的增高愈伤诱导率随之提高;
2 ,4-D抑制八角莲愈伤组织的诱导 ,并且随着 2 , 4-
D浓度的增大 ,这种抑制作用越明显;而 6-BA是随
浓度的增高诱导率先升高后降低 。表明 NAA , 6-
BA 对愈伤的诱导起促进作用 ,2 ,4-D则是起阻碍作
用。
2.3　光照的影响
　　以有胚 种子段 为材料 , 在 MS + 6-BA
2 mg/ L +NAA 0.2 mg/L 培养基中 ,分别进行光
照培养和暗培养 ,统计结果见表 4。
表 4　光照和黑暗培养对西藏八角莲愈伤诱导的影响
Tab.4　Effect of culturing in the light and dark
environment on callus inducemen trate
培养
条件 接种数
产生愈
伤数
诱导率
/ % 愈伤生长状况
光照 47 22 46.8bA 10 d开始生长 ,呈淡绿色
黑暗 44 29 65.9aA 7 d开始生长 ,呈白色
　　注:表中数据为 10次重复的平均值 ,不同小写字母表示在 5%
水平显著差异 ,不同大写字母表示在 1%水平极显著差异 , 数据采用
LSD法检验。
　　观察发现 ,在黑暗中培养 7 d 后开始出现愈伤
组织 ,而在光照下要 10 d 左右才开始出现 ,且比黑
暗中生长缓慢。从颜色来看 ,在黑暗中愈伤刚开始
生长时都是白色 、疏松的 ,之后置于光照下逐渐变为
淡绿色。从统计结果来看 ,出愈率在黑暗中要明显
高于光照下 ,这一结论和“对很多植物而言 ,暗培养
条件比光照条件更容易产生愈伤”的结论具有一致
性。一方面是强光抑制外植体周缘细胞的分裂 ,使
外植体细胞分裂的启动时间推迟 ,另一方面是在光
照下外植体的伤口迅速褐化 ,从而影响增殖 ,有时甚
至导致培养物死亡[ 10 ] 。
3　讨论与小结
　　在培养过程中 ,由于培养基中含有细胞分裂素
有增进多酚氧化酶活性的作用 ,使得培养基中积累
了酚类深褐色的物质 ,这些物质常产生毒害 ,抑制愈
伤生长。该试验在增殖培养过程中 ,采用及时转接
的方法 ,从第二代起 ,每隔 25 d继代 1次 ,就能及时
有效地减轻有害代谢物质的积累 。以八角莲成熟种
子为材料诱导出愈伤组织的发生是一个复杂的过
程 ,除了与种子材料本身有联系外 ,还与外界的调控
有关联 ,是在内外因素的共同作用下发生的。综上
所述 ,对八角莲愈伤诱导有促进作用的因素有:种子
切段处理;激素配比 ,NAA 与 6-BA 配合效果很好 ,
最佳培养基为 MS+6-BA 2 mg/L +NAA 0.2 mg/
L ;在黑暗的条件下进行。
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