全 文 ：OCH 3), 6. 30(1H , d, J=15. 84, H-3), 6. 93(1H , d, J=8. 10, H-8),
7. 11(1H , dd, J=8. 22, 1. 8, H-9), 7. 05(1H , d, J=1. 92, H-5),
7. 71(1H , d, J=15. 84, H-2), 与阿魏酸光谱数据基本一致 [ 4] , 且
与对照品阿魏酸薄层具有相同的 Rf值 ,故鉴定化合物Ⅳ为阿魏
酸( fe rulic ac id)。
化合物Ⅴ:无色片状结晶 , mp 188 ～ 190℃, 1H-NMR(CDC l3)
δ:5. 55(1H , dd, J=7. 98, 3. 06, H-3), 7. 36(1H , t, J=7. 65, H-6),
7. 47(1H , d, J=7. 62, H-5), 7. 01(1H , d, J=7. 92, H-7), 2. 31,
1. 77(各 1H , m , H-8), 1. 39(4H , m , H-9, H-10), 0. 90(3H , t, J=
7. 08, H-11), 5. 72(1H , s, 4-OH)。 13C-NM R(CDC l3)δ:170. 7(C-
1), 80. 7(C-3), 136. 1(C-3a), 150. 4(C-4), 120. 0(C-5), 130. 6
(C-6), 117. 8(C-7), 128. 5(C-7a), 32. 4(C-8), 26. 8(C-9), 22. 4
(C-10), 13. 9(C-11)。以上物理常数及光谱数据与文献报道 4 -
羟基-3-丁基苯酞相符 [ 4] 。故鉴定化合物Ⅴ为 4-羟基-3-丁基苯酞
(4-hy-d roxy-3-bu ty l-phtha lide)。
化合物Ⅵ :无色片状结晶 , m p 191-193℃, 1H-NMR(CDC l3),
13C-NMR(CDC l3),二维谱数据与文献孕烯醇酮标准图谱 [ 5]一
致 , 且与对照品孕烯醇酮的薄层具有相同的 Rf值 ,与对照品孕烯
醇酮混合测熔点不下降 , 故确定化合物 Ⅵ 为孕烯醇酮 (preg-
neno lone)。
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收稿日期:2007-01-24;　修订日期:2007-03-12
基金项目:国家 “ 863”计划重点资助项目(N o. 2002AA2Z3217)
作者简介:邹盛勤(1970-),男(汉族),江西奉新人 ,现任江西省天然药物活性
成分研究重点实验室副教授 ,主要从事天然药物成分提取与分析研究工作.
*通讯作者简介:陈　武(1944-),男(汉族),江西奉新人 ,现任江西省天然药
物活性成分研究重点实验室教授 ,主要从事天然药物与生物技术研究工作.
反相高效液相色谱法测定
冬凌草中乌索酸和齐墩果酸的含量
邹盛勤 , 陈　武*
(江西省天然药物活性成分研究重点实验室 宜春学院生物工程研究所 ,江西 宜春　336000)
摘要:目的 建立反相高效液相色谱(RP-H PLC)法测定冬凌草中乌索酸和齐墩果酸的含量。方法 色谱柱为 NUCLEO-
DUR C18RP柱(250 mm × 4. 6 mm , 5 μm);流动相为甲醇-水(87∶13);流速 0. 8 m l m in- 1 , 光电二极管阵列检测器 , 检
测波长 210 nm , 柱温 25℃。结果 在选定色谱条件下线性范围良好 , 乌索酸和齐墩果酸的样品加样回收率分别为 96. 2%
和 98. 7%, RSD 为 1. 9%和 0. 9%。结论 该方法快速简便 , 结果准确可靠。
关键词:冬凌草;　乌索酸;　齐墩果酸;　反相高效液相色谱;　含量测定
中图分类号:R284. 2　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2007)07-1577-02
Determ ination ofU rsolic Acid andO leanolic Acid inRabdosia rubescens by RP-HPLC
ZOU Sheng-qin, CHEN W u*
(K ey Laboratory of Province forR esearch on Active Ingredients in Na turalMedicines, B ioeng ineering R esearch In-
stitute ofY ichunUniversity, Y ichun 336000, Ch ina)
Abstract:Objective To develop a quantitative m ethod for de te rm ina tion o f urso lic acid and o leano lic acid in Rabdosia rubescens
by RP-HPLC. Methods HPLC w as carried out on NUCLEODUR C18 RP column (4. 6 mm ×250 mm, 5 μm) at 25℃ using
m ethanol-w ater (87∶ 13) as m ob ile phase w ith a flow ra te of 0. 8 m l m in- 1 and de tection w ave length was a t 210 nm.
R esu lts The good linea r rela tionship w as ob ta ined under the optim um conditions. The recoveries of the standards added for urso lic
ac id and o leano lic ac id we re 96. 2 % and 98. 7%, respec tively, w hile the re lative standard devia tions w e re 1. 9 % and 0. 9%.
Conc lu sion The me thod is rapid and precise.
Key words:Rabdosia rubescens;　Urso lic acid;　O leano lic ac id ;　RP -HPLC;　Con tent determ ina tion
　　冬凌草为唇形科香茶菜属植物碎米亚 Rabdosia rubescens
(H em s.l )H ara的干燥全草 , 广布于黄河 、长江流域 , 主产地在河
南济源太行山一带。 冬凌草味甘 、苦 ,性微寒 , 具清热解毒 , 消炎
止痛 , 健胃活血及抗肿瘤之功效 [ 1] 。用于治疗咽喉肿痛 、扁桃体
炎 、蛇虫咬伤及食管癌 、贲门癌 、肝癌 、乳腺癌等。临床实验证明
冬凌草对食管癌 、贲门癌 、肝癌等有一定疗效 ,对食管上皮增生有
显著疗效 [ 2] 。 1991年我国卫生部批准将其干燥叶及地上部分作
为中药材 ,收入部颁中药材标准。冬凌草中的主要有效成分为冬
凌草甲素 、冬凌草乙素 、乌索酸和齐墩果酸。近年药理研究表明 ,
不仅冬凌草甲乙素具有很强的抗癌作用 ,乌索酸和齐墩果酸也具
有一定的抗肿瘤活性 [ 3 ～ 5] 。 笔者采用反相高效液相色谱法同时
测定了不同产地冬凌草中乌索酸和齐墩果酸的含量 ,为控制药材
质量提供依据。
1　仪器与材料
W aters高效液相色谱仪 (515泵 , 2996光电二极管矩阵检测
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LISH IZHEN M EDIC INE AND MATER IA MED ICA RESEARCH 2007 VOL. 18 NO. 7 时珍国医国药 2007年第 18卷第 7期
器 , 7725 I进样阀 , Em pow er中文色谱工作站 ), RO-MB-10D高纯
水机(杭州永洁达膜分离设备厂), CP225D分析天平(德国 Sa rto-
rius公司 ), FW100型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限
公司), 202-26A型数显电热恒温干燥箱(上海阳光实验仪器有限
公司), KS-1500超声提取仪器(宁波科盛仪器厂)。
甲醇为色谱纯 (色谱纯 , 上海陆忠试剂厂), 水为高纯水 ,
95%乙醇(分析纯 ,江西同盟试剂化工厂), 乌索酸和齐墩果酸对
照品 (中国药品生物制品检定所提供 , 批号 110742-200314,
110709-200304,供含量测定用)。冬凌草(市售 , 购自樟树药材市
场),经本所生药室鉴定为唇形科香茶菜属植物碎米亚 Rabdosia
rubescens(H em s.l )H ara的干燥叶和地上部分。
2　方法与结果
2. 1　溶液的制备
2. 1. 1　对照品混合溶液的配制 精密称取乌索酸和齐墩果酸对
照品 3. 22 mg和 1. 28 m g,置 50 m l容量瓶中 ,加甲醇溶解并稀释
至刻度 , 摇匀 ,配制成对照品混合溶液 ,备用。
2. 1. 2　样品溶液的配制 取冬凌草样品于 60℃恒温干燥 8 h,粉
碎 , 精密称取约 3 g, 加入 95 %乙醇溶液 40 m l, 超声提取 120
m in,冷却至室温 , 滤过 ,滤渣洗涤 2次 , 合并滤液于 50 m l容量瓶
中 , 乙醇定容 ,摇匀 , 经 0. 45 μm微孔滤膜过滤 , 得样品溶液。
2. 2　检测波长的确定 取乌索酸和齐墩果酸对照品混合溶液进
样 , 在 190 ～ 500 nm波长范围进行光谱扫描 , 其在流动相中的最
大吸收波长均为 203. 4 nm (图 1), 但由于流动相在短波长处有
末端吸收 , 为了减少干扰 ,提高信噪比 , 提取不同波长的色谱图进
行比较 , 选择 210 nm为检测波长信噪比高 , 峰形好 ,基线平稳 [ 6] 。
2. 3　色谱条件 色谱柱为 NUCLEODUR C18 RP柱(4. 6 mm ×250
mm , 5 μm);流动相为甲醇-水 (87∶ 13, V /V);流速 0. 8 m l
m in- 1;检测波长 210 nm;柱温 25°C ,进样量 10 μl。乌索酸和齐
墩果酸理论塔板数均大于 10 000,分离度大于 1. 5。乌索酸和齐
墩果酸对照品混合溶液及冬凌草样品溶液的 HPLC色谱见图 1。
图 1　乌索酸和齐墩果酸对照品紫外光谱
2. 4 　线性关系实验 分别精密吸取对照品混合溶液 1. 0, 5. 0,
10. 0, 15. 0, 20. 0 μl, 按选定的色谱条件进样并测定峰面积。以
峰面积(μV s)对进样量(μg)进行线性回归 , 乌索酸和齐墩果
酸的回归方程分别为:
Y
UA
=1. 12×105X +3. 68×103 , r=0. 999 6,
YOLA =1. 35×105X +2. 11×103 , r=0. 999 5
表明当乌索酸进样量在 0. 064 4 ～ 1. 288 μg, 齐墩果酸进样
量在 0. 025 6 ～ 0. 512 μg时 ,线性关系良好。
2. 5　仪器精密度实验 精密吸取乌索酸和齐墩果酸对照品混合
溶液 10 μl进样 , 重复 5次 , 测得乌索酸峰面积的相对标准偏差
(RSD)为 0. 6 %(n=5),齐墩果酸的峰面积 RSD为 0. 9 %(n =
5),表明仪器精密度良好。
2. 6　方法重现性实验 精密称取冬凌草样品 5份 , 按上述方法配
制样品溶液 , 精密吸取 10 μl进样分析 ,测得乌索酸含量的 RSD
为 1. 6%(n=5),齐墩果酸含量的 RSD为 2. 2%(n=5),表明方
法重现性好。
2. 7　加样回收率实验 精密称取已知乌索酸和齐墩果酸含量的
冬凌草药材 6份 , 每组两份 , 按高 ,中 , 低 3种浓度分别加入适量
乌索酸和齐墩果酸对照品 ,制备样品溶液 , 进样分析 ,乌索酸和齐
墩果酸平均加样回收率分别为 96. 2 %和 98. 7 %, RSD 为 1. 9%
和 0. 9%。
a.对照品　b.样品　1 -齐墩果酸　 2 -乌索酸
图 2　对照品和样品的 HPLC谱图(210 nm)
2. 8　样品中乌索酸和齐墩果酸含量测定 精密称取不同批次的
冬凌草样品约 3 g, 制备样品溶液。精密吸取样品溶液 10 μl, 分
别进样 ,平行实验 3次 ,测定乌索酸和齐墩果酸峰面积 ,外标法计
算平均含量。结果见表 1。
表 1　样品中乌索酸和齐墩果酸的测定结果
产地 部位 乌索酸含量 C /mg g - 1　RSD(%)
齐墩果酸
含量 C /mg g - 1　RSD(%)
江西樟树 叶 0. 399 0. 6 0. 155 1. 0
地上部分 0. 267 1. 1 0. 112 1. 6
江西宜春 叶 0. 451 1. 3 0. 219 1. 3
地上部分 0. 324 1. 6 0. 201 0. 8
湖南 叶 0. 811 1. 2 0. 520 1. 2
地上部分 0. 538 0. 7 0. 316 0. 4
安徽 叶 1. 024 0. 9 0. 605 1. 8
地上部分 0. 879 1. 1 0. 536 2. 1
3　讨论
测定结果表明 ,冬凌草中乌索酸和齐墩果酸的含量较高 , 为
三萜酸类主要成分 ,两组份均具有抗肿瘤及抗炎抑菌等生物学效
应 , 这与冬凌草抗炎 、抗肿瘤的药理活性相一致。
冬凌草叶中乌索酸和齐墩果酸的含量明显高于地上部分 , 可
能是由于茎的纤维含量高 , 质地相对致密 , 两种三萜酸在茎中的
含量相对较低所致。中草药的药效不仅取决于活性组份的种类
和含量高低 ,其药用部位也是决定因素之一。
建立的定量分析方法准确 、快速 ,数据准确 , 重现性好 , 可用
于冬凌草中乌索酸和齐墩果酸的含量测定。
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时珍国医国药 2007年第 18卷第 7期 LISH IZHEN MED IC INE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2007 VOL. 18 NO. 7