全 文 ：文章编号:1002-8110(2004)03-0030-03
收稿日期:2004-02-16
作者简介:苏庆辉(1974-), 男 ,黑龙江省人 ,硕士。
啤酒酵母中核苷酸的提取研究
苏庆辉1 ,吴晓丹2 ,马兴胜2 ,王长宇3
(1.黑龙江商业大学 ,哈尔滨　150076;2.黑龙江省丰缘麦业有限公司 ,哈尔滨　150076;3.黑龙江省轻工科学研究院哈尔滨　150001)
摘　要:对压榨啤酒酵母粉进行处理 ,采用盐热法提取核酸液 , 利用 5 -磷酸二酯酶把核酸分解为 4 种核苷
酸 , 按核苷酸的不同特性 ,用树脂对其进行分离 , 使 4种核苷酸都能得到较好的分离。
关键词:核苷酸;AMP;树脂;分离
中图分类号:TS262.5;TS261.9　　　　文献标识码:A
0　引言
5 -腺嘌呤核苷酸(5 -AMP)又称腺苷酸或腺苷一磷
酸 ,是生物体细胞核糖核酸的组成成分之一 , 是能量传递物
质 ,具有显著的扩张末梢血管和降压作用。临床用于播散性
硬化症 、肝病 、静脉曲张性溃疡并发症。用以腺苷酸成分为
主的复合物制成滴眼剂 ,可治疗眼疲劳 、中心视网膜炎 、角膜
翳等疾病。在医药工业上 , 用于生产 ATP、CoA、Col 、3 , 5 -
环腺苷酸和阿糖腺苷等的重要原料。 5 -腺嘌呤核苷酸可
以用碱或酶水解核糖核酸制得。用 5 -磷酸二酯酶降解核
糖核酸 ,得到四个 5 -单核苷酸。核苷酸是一类在代谢上极
为重要的生化物质 ,它几乎参与细胞的所有生化过程[ 1] 。 核
苷酸是由碱基 、戊糖与磷酸组成 ,核糖核酸是由成千上万个
四种不同的核苷酸互相联接而成的高分子聚合物。核糖核
酸用 5 -磷酸二酯酶催化水解 , 控制反应条件 , 可选择地获
得 5 -鸟苷酸(5 -GMP)、5 -腺苷酸(5 -AMP)、5 -胞苷
酸(5 -CMP)、5 -尿苷酸(5 -UMP)[ 2] , 其中 5 -GMP 与
5 -AMP的脱氨产物 5 -肌苷酸(5 -IMP)因具有特殊的化
学结构-磷酸与戊糖的 5 位碳原子形成酯键 ,其碱基为 6 位
碳原子上具有羟基的嘌呤碱而呈鲜味[ 3] 。核苷酸用处很广 ,
最主要用途之一是作食品助鲜剂。
1　实验部分
1.1　实验材料与仪器
1.1.1　实验材料
压榨啤酒酵母粉　哈尔滨啤酒厂
食　　盐 　　　　　　　市 　　　售
盐　　酸(AR)　　　哈尔滨市新春花工厂
氢氧化钠(AR) 天津市河北区红星化工包装厂
麦芽根 哈尔滨啤酒厂
聚醚砜超滤膜 中国科学院上海研究所 ,
截留相对分子量 2千。
AMP 广东江门制药厂(纯度 95%)
1.1.2　实验仪器
UV-120型紫外分光光度计　　　　岛津
电热恒温干燥箱 启东电器二厂
pH S-25型酸度计 上海伟业仪器厂
ALC-2104电子天平 北京赛多利斯天平有限公司
80-2 离心机 上海浦东物理光学仪器厂
LXJ-6400离心机 北京医疗仪器修理厂
SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司
万能高速粉碎机 天津泰斯特 FW-80型。
HL-2S恒流泵 上海泸西分析仪器厂
SBSZ100数控计滴自动部份收集器 上海泸西分析仪器厂
HD-93-1型核酸蛋白检测仪 上海金达生化仪器厂
XWT-S小型台式记录仪 上海自动化仪表三厂
R-201旋转蒸发器 上海申胜生物技术有限公司
DF-102集热式磁力加热搅拌器 北京制药工业研究所
W-201B恒温水浴锅 上海申胜生物技术有限公司
80-2离心机 上海浦东物理光学仪器厂
1.2　核酸液的提取
压榨啤酒酵母粉(10%)加食盐(盐浓度 15.5%)、水 , 高
温抽提(94℃)6h※冷却 4℃※离心※上清液(核酸液)
1.3　5 -磷酸二酯酶粗酶液的提取
麦芽根※粉碎※过 100 目筛※提取※过滤※离心分离
※抽滤液※灭杂酶※粗酶液。在抽滤液中含有多种核苷酸
类物质的降解酶 , 需利用它们性质的差异 , 进行纯化。本实
验中利用核苷酸降解酶对热的敏感程度不同进行提取。 加
入Zn2+可提高 5 -磷酸二酯酶的耐热性。而其它核苷酸
降解酶是不耐热的 , 用温度 67℃, 时间 15min 的热处理。 通
过这种热处理 ,可以使不耐热的酶失活 , 然后可获得相对纯
化的 5 -磷酸二酯酶。
1.4　核酸溶液含量的测定[ 4]
RNA含量=AOD260(样品)-BOD260(对照)
0.022×C样品 μg/mL
1.5　5 -磷酸二酯酶活力的测定
5 -磷酸二酯酶活力的测定:紫外分光光度计法[ 5]
酶液活力(单位/mL)=ΔO·D×α×4×50
0.1×15 ΔO·D×a×133.
3
α—酶液测定活力前预先稀释的倍数。
1.6　核酸降解
第 31卷　第 3期
2 0 0 4 年 5 月　　　　　　　　　　　　　　　　　　
酿　　酒
LIQUORMAKING
　　　　　　　　　　　　　　　　　 　Vol.31 , No.3
May , 　2004
核酸的浓度为 2%, 升温至 68℃, 将 pH 值调至 5.1 ～ 5.
3 ,在核酸溶液中加入预处理的粗酶液 , 预处理见 3.3.1 ,每克
RNA约加酶 4000U。继续升温至 70℃, 搅拌 , 恒温在 70℃～
75℃之间 ,保持 2h , 并流加碱液将 pH 值控制在 5.1～ 5.3 之
间 ,间断搅拌。 酶解结束后 , 迅速升温至 90℃, 保温·10min ,
终止酶反应 ,使蛋白质沉淀 , 迅速冷区至常温[ 6] 。酶解液用 2
千的超滤膜超滤 ,除杂蛋白。
1.7　树脂分离核苷酸
1.7.1　树脂的预处理
将干的强酸型(强碱型)树脂水浸过夜或搅拌 2h , 使充分
溶胀 , 再用 4倍体积的 2mol/L的盐酸(氢氧化钠)浸泡 1h 或
搅拌0.5h ,倾去上层液 , 用去离子水洗至中性再用 2mol/L 的
氢氧化钠(盐酸)溶液处理 , 做法同上 , 最后用 2mol/ L的盐酸
(氢氧化钠)如上法处理 ,洗至中性待用。
将氢型树脂装柱 , 当柱的顶部快干的时候 , 加入 6mL
10g/ L的氯化钠溶液 , 使流入柱内。待溶液的弯月面正好在
树脂的顶端时 , 用水洗脱。收集 40mL洗脱液。用 0.1mol/ L
标准氢氧化钠滴定收集的洗脱液。计算钠离子的交换率[ 7] 。
Na+的交换率=(NV)NaOH×58.5MG
6mL×10mg/mL ×100%
1.7.2　核苷酸上柱分离
取经预处理 732阳离子树脂 20克于离子交换柱内 , 用与
料液相同 pH1.5的平衡液平衡柱子数小时 ,直到流出液与平
衡液的 pH 一致。将一定浓度将超滤后的酶解清液用HCl调
至 pH1.5 , 上柱量相当于阳离子交换树脂全交换量的 5%～
7%。按 pH 值范围收集洗脱液 , 在 pH4.5※3.5※4.5 流出液
为AMP溶液 ,收集液减压浓缩至 80～ 90mg/mL , 加入硅藻土
搅拌30min , 过滤 ,滤液用 6mol/L盐酸调 pH 为 2.5 , 搅拌至结
晶完全析出 ,放置在 10℃以下结晶 1h , 再过滤 ,收集结晶用无
水乙醇洗涤 3次 , 抽干 , 60℃真空干燥 ,得 AMP成品[ 8] 。
1.8　酵母核酸降解液中 5 -核苷酸的定性 、定量鉴定
1.8.1　酵母核酸降解液中 5 -核苷酸的定性鉴定
采用纸层析分离方法进行定性分析 ,展层剂为饱和硫酸
图 1　纸层析图
铵∶异丙醇∶水(79∶2∶19), 其中标样的点样浓度为 5 -核苷
酸5μg/mL , 酵母核酸降解液混合单核苷酸稀释至 205μg/ mL
左右 ,上行显层法 , 上行 10h[ 4] , 结果如图 1
1.8.2　酵母核酸降解液中 5 -核苷酸的定量鉴定 样品 1mL
加 1mL沉淀剂后 ,稀释 100 倍 , 260nm 处测 OD[ 6] 。
5 -核苷酸(mg/ mL)=OD260×200
40
200为稀释倍数。
40 为核苷酸 1mg/mL的消光系数
1.9　AMP的测定
过碘酸氧化法[ 9]
AMP(mg/mL)=AMP磷量μg×347.22
31
× D
1000
D=为样液稀释倍数;
2　实验结果与分析
2.1　阳离子交换柱分离的四种核苷酸(图略)
2.2　5 -AMP的洗脱情况
5 -AMP的洗脱情况见表 1 , 四种 5 -核苷酸吸收光谱
的标准比值见表 2。
表 1 pH4.5※3.5※4.5 时 , 5 -AMP在不同波段下的 OD值
OD值
×50
管　　　　号
1 2 3 4 5 6 7 8
250 0.140 0.176 0.322 0.497 0.648 0.779 0.547 0.278
260 0.158 0.208 0.382 0.588 0.762 0.921 0.640 0.319
270 0.035 0.047 0.082 0.129 0.170 0.208 0.141 0.068
280 0.005 0.006 0.010 0.017 0.023 0.029 0.021 0.011
　　从表 2的吸收光谱比值对照四种单核苷酸吸收光谱的
标准比值表可知 , 在 pH4.5※3.5※4.5 时 , 流出液光谱符合
5 -AMP的吸收光谱。
2.3　洗脱液 pH 值条件的影响
单核苷酸和一些可解离基因 , 如磷酸基 、氨基 、烯醇基
等 ,在不同的 pH 值条件下离子化程度不同 , 所以通过调节
pH 值 , 使单核苷酸的这些可解离基因解离。各种单核苷酸都
有各自特定的 pH 值条件进行充分解离 , 以带上大量相应的
电荷 , 供离子交换树脂进行交换。 核酸酶解液上阳柱时 , 5
-AMP、5 -GMP、5 -CMP 具有氨基 , 在 pH1.5 条件下氨基
被解离 ,带有正电荷 , 故首先与阳离子交换树脂进行离子交
换而被吸附 , 而 5 -UMP无氨基 ,因此不被吸附 ,直接流出。
由于嘌呤与苯乙烯树脂骨架有亲和性 ,虽然 5 -CMP氨基离
解常数略高于 5 -AMP ,但却先于 5 -AMP 被洗脱[ 11] 。随
·31·第 3期　　　　　　　　　　　苏庆辉 ,等:啤酒酵母中核苷酸的提取研究　　　　　　　　　　　　　　　　
着 pH 的变化 , 其它三种核苷酸的氨基解离程度不同 , 所带电
荷亦不同 , 在无离子水洗脱时 , 先后失去阳离子树脂的吸附
能力 ,分别被洗脱出来。在 pH 值为 2.0 ～ 3.5 时为 5 -GMP
与5 -CMP 混合液 ,在 pH 值 3.5 ～ 4.0 时为 5 -CMP 流出
液 ,在 pH4.5※3.5※4.5 时为 5 -AMP 流出液 , 通过控制 pH
值 ,能够使四种单核苷酸得到较为理想的分离 。
表 2　四种 5 -核苷酸吸收光谱的标准比值 [ 10]
核苷酸 pH 值 250/ 260nm 280/ 260nm 290/ 260nm
5 -CMP 2.0 0.46 2.10 1.55
7.0 0.84 0.99 0.30
5 -AMP 2.0 0.85 0.22 0.03
7.0 0.80 0.15 0.003
5 -UMP 2.0 0.74 0.38 0.03
7.0 0.73 0.40 0.03
5 -GMP 2.0 1.22 0.68 0.40
7.0 1.15 0.68 0.40
2.4　5 -UMP、5 -CMP、5 -GMP的分离情况
如上所述 ,阳离子树脂分离时 ,在 pH 值 1.5～ 2.0 时 , 5
-UMP直接流出 ,可进行收集分离。在 pH2.0 ～ 3.5 时流出
液为5 -GMP与 5 -CMP的混合液 , 将此混合液调 pH4.0 ～
4.5上阴离子交换树脂柱 , 5 -GMP被吸附 , 5 -CMP直接流
出 ,用紫外检测 , 当 5 -CMP 流出液不纯时 , 停止上柱 , 并改
用0.04mol/ L氯化钠和 0.05mol/L盐酸洗除柱内余留的 5 -
CMP至出现 5 -GMP。 再用 50℃3%氯化钠的水溶液洗脱
GMP。根据 pH变化控制洗脱 , pH 由 7.0 先升至 9.0 后下降
至 6.0 , 洗脱结束[ 12] 。
2.5　装柱和流速的选择
装柱的高度直接影响吸附交换和洗脱。装柱过高 ,因重
力让溶液通过树脂 ,易使树脂被压缩而间隙小 , 接触面紧贴 ,
不利于核苷酸的吸附和洗脱;装柱过低 ,吸附量少 , 难充分利
用交换柱 ,吸附和洗脱时间长。一般阳柱为 70mL～ 80mL , 阴
柱为 100mL～ 120mL。
上柱时 ,若流出液的流速太快 ,核苷酸来不及与树脂中
的离子交换而流出 ,造成浪费;流速太慢 , 虽然进行了充分交
换 ,但工艺时间太长 , 不适宜工业化生产 , 且树脂被压紧 , 使
某些接触面内物质无法洗脱。以 8mL/min 的流速上柱和洗
脱较理想[ 13] 。
3　结论
酵母核酸酶解液 pH 调到 1.5 上柱分离 , 流出液为 5 -
UMP。后用无离子水洗脱 , 在 pH 值为 2.0 ～ 3.5 时为 5 -
GMP与 5 -CMP混合液 , 将混合液调 pH 至 4.0 上阴离子柱
分离 , 流出液为 5 -CMP , 用 3%NaCl(50℃)溶液洗脱 , 流出
5 -GMP。在 pH 值 3.5 ～ 4.0 时为 5 -CMP流出液 ,在 pH4.
5※3.5※4.5时为 5 -AMP 流出液。将收集的 AMP 流出液
pH 调至 7.0 , 在 60℃下减压浓缩到 80 ～ 90mg/mL , 加入硅藻
土搅拌 30min , 过滤 ,滤液用 6mol/L盐酸调 pH 为 2.5 ,搅拌至
结晶完全析出 ,放置在 10℃以下结晶 1h ,再过滤 , 收集结晶用
无水乙醇洗涤 3次 , 抽干 , 60℃真空干燥 , 得 AMP 成品 , 产品
纯度可达 90%。
采用离子交换树脂法分离酵母核酸酶解液中的 5 -
AMP对生产设备和原材料要求不高 ,产品收得率和纯度都较
高。但处理液中不得含太多的蛋白质类物质 , 因它对离子交
换分离核苷酸影响很大 ,所以在进行发酵液处理时要除弃蛋
白质类物质。
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