全 文 ：山核桃×薄壳山核桃花粉直感效应与后代分析
王正加 1，张 斌 2，夏国华 1，黄有军 1，洪丹丹 1，黄坚钦 1*
（1浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地，浙江临安 311300；
2海盐县农业经济局 林果特产技术推广站，浙江海盐 314300）
摘 要： 以山核桃为母本， 薄壳山核桃为父本进行人工控制授粉， 对收获果实和种子进行各性状测定， 然后利用
AFLP 和 SSR 分子标记对播种苗进行了鉴定。 结果发现，薄壳山核桃花粉对山核桃授粉坐果良好，4 个组合均收获大
量果实，收获果实颜色、形状发生较大变异，性状测定发现单果质量、果长、果径、果形指数、壳厚、壳质量、仁质量等
都显著优于山核桃自然授粉果实； 播种幼苗表型与母本一致，AFLP 和 SSR 分子标记对后代鉴定发现授粉后代不是
真杂种，果实变异为花粉直感效应。 山核桃可能存在无融合生殖现象。
关键词： 山核桃； 薄壳山核桃； 种间杂交； 花粉直感效应
中图分类号：S664．1 文献标识码：A 文章编号：1009－9980(2010)06－908－06
Analysis of the progeny of Carya cathayensis×C. illinoensis and the xenia
effect
WANG Zheng-jia1， ZHANG Bin2， XIA Guo-hua1， HUANG You-jun1， HONG Dan-dan1， HUANG Jian-
qin1*
（1Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture，Zhejiang A & F University， Lin’an，Zhejiang 311300 China；
2Extension Station for Technology of Forestry， Fruit and Special Product， Bureau of Agricultural Economics of Haiyan， Haiyan，Zhejiang
314300 China）
Abstract: Some characters of harvested fruits and seeds from the cross between Carya cathayensis and C. illinoensis were
determined， and their seedlings were tested with AFLP and SSR marker technology. The results showed that mother hickory
trees got good fruit setting after pollinated with pollens from C. illinoensis. Considerable fruits and seedlings were obtained
from all of the four cross combinations. Variations in the color and shape of the fruits were observed. The single fruit weight，
fruit length， fruit diameter， fruit shape index， shell thickness， shell weight and nut weight of the hybrid seeds were signifi-
cantly superior to that of the female parent’s natural fruits. There were no obvious differences in the phenotype between
seedlings and the mother tree. AFLP and SSR analysis indicated that the obtained seedlings were not the true hybrids and the
variation of fruits resulted from xenia effect. This study provided some cues for revealing the reproductive mechanism of
Carya.
Key words: Carya cathayensis； C. illinoensis； Inter-specific crossing； Metaxenia
山核桃 （Carya cathayensis Sarg.） 属于胡桃科
（Juglandaceae）山核桃属（Carya Nutt.），是优质干果
和重要的木本油料树种，其仁营养丰富、郁香浓厚、
风味独特，深受欢迎，具很高的经济价值[1]。但山核桃
栽培以实生繁殖为主，童期长，缺乏优良品种，同时
其种皮厚涩、子小核壳厚，制约了其产业的进一步发
展。 薄壳山核桃（C. illinoensis）是同为山核桃属的优
质干果，原产北美，品种繁多，其子大、核壳薄、童期
短、适应性广，但存在香味不足、口感偏差等缺点。通
过远缘杂交， 打破种间生殖隔离， 综合 2 者优良性
状，实现杂种优势是山核桃育种的有效方式。前人研
究表明， 地理间隔离的鹅掌楸 （Liriodendron chi-
nense）与北美鹅掌楸（Liriodendron tulipifera）表现出
明显的杂种优势 [2]。 早在 1959—1960 年叶茂富等 [3]
收稿日期： 2010－03－15 接受日期: 2010－07－12
基金项目： 国家自然科学基金（NO.30872047）；浙江省自然科学基金重点项目（Z307534）；浙江农林大学 B 类创新团队项目（2007）；浙江
省科技厅重大项目（2007C12023）；浙江农林大学博士启动基金（2351000754）
作者简介： 王正加，男，副教授，博士。 Tel: 0571-63695836， E-mail: wzhj21@163.com
觹 通讯作者。 Author for correspondence． Tel: 0571-63740278， E-mail: Huangjq@zjfc.edu.cn
果 树 学 报 2010，27（6）: 908～913
Journal of Fruit Science
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2010.06.031
进行了山核桃与薄壳山核桃之间的正反交试验，并
认为杂交果实在形态上发生了变化， 但后代小苗生
长情况与母本完全相同。 1970—1975年浙江林学院
黎章矩[4]进行了多点、多年、多组合的杂交试验，发现
山核桃种间杂交存在明显的花粉直感现象， 但遗憾
的是后代未得到妥善保存。
我们以山核桃为母本、 薄壳山核桃为父本进行
控制授粉试验，调查坐果率并测定果实和种子性状，
并用 SSR和 AFLP标记对播种苗进行鉴定。 发现收
获果实存在明显的花粉直感效应， 同时推测山核桃
可能存在无融合生殖现象， 为人工辅助授粉利用提
供了依据，也为山核桃的育种提供了重要参考。
1 材料和方法
1.1 材料
试验点设置在浙江省临安市马啸乡浪广村，海
拔 860 m，属亚热带湿润气候，年平均气温 15.9 ℃，
年降水量为 1 500 mm， 土壤母岩为石灰岩与花岗
岩。2006年选择 2株树龄为 60 a左右生长健壮的山
核桃树为母本（♀1 和♀2），进行了控制授粉试验，
薄壳山核桃花粉（长林 1、金华 85，分别用♂1 和♂2
表示）由中国林科院亚热带林业研究所提供，以自然
授粉♂0为对照， 收获成熟果实，100粒用于表型性
状分析，100 粒用于质量性状分析， 其余全部播种。
随机摘取♀1♂2 组合 80 株小苗幼叶，-70 ℃保存，
用于 AFLP 与 SSR 分析。 AFLP 与 SSR 分析所用试
剂均购自上海生物工程技术有限公司，AFLP引物选
用 EcoR I 和 Mse I 组合，SSR 引物参照 Grauke 等 [5]
的薄壳山核桃基因组 DNA微卫星引物，均由上海生
物工程技术有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 控制授粉 山核桃雌雄同株异花， 观察发现
其雌、雄花花期基本一致，因此在雌花柱头开始由青
绿转为微红色时去除雄花序套袋隔离。 具体做法：
（1）去除着生在结果枝基部的雄花序，防止把雄花序
套进袋中；（2）用上下开口、两侧缝合，透光防水的亚
硫酸纸袋把整个雌花序套入亚硫酸纸袋内， 套袋时
将雌花序总梗下方的叶子折回留在下袋口外， 上袋
口反折 1次，用回形针封口，便于授粉操作。
授粉前对雌花的跟踪观察有利于确定最佳授粉
时期。杂交授粉以雌蕊柱头由红色转为紫红色，柱头
上有黏液时为最佳授粉时期。 每一标准大枝授同一
父本的花粉后标记，以利于跟踪观察。 5~7 d去除纸
袋，跟踪观察统计坐果率。
1.2.2 收获果实与种子性状测定 对♀1♂1、♀1♂
2 和♀1♂0（自然授粉，对照）组合的各性状进行了
分析，利用分析天平称量单果质量、仁质量、壳质量，
用游标卡尺测量果长、果径、壳厚，分别计算果形指
数、果径与壳厚比例及出仁率。粗脂肪测定采用索式
提取法[6]，粗蛋白测定采用凯氏定氮法。 各性状分析
数据结果采用 SAS（Statistical Analysis System）软件
进行统计分析。
1.2.3 杂交后代 AFLP 与 SSR 鉴定分析 基因组
DNA提取采用 CTAB法[8]。 AFLP实验流程主要参照
Vos等[9]方法。
酶切连接：DNA（250 ng）1μL， Tango buffer （10×）
2.5 μL，T4 buffer （10×）2.5 μL，接头 1（ E1/E2 接头）
1μL，接头 2 （M1/M2接头）2 μL限制性内切酶 EcoRI
（10U） 0.25 μL限制性内切酶 MseI （10 U）0.25 μL，
T4 DNA 连接酶 0.4 μL，ddH20 至 25 μL。 37 ℃温浴
过夜。
预扩增: 酶切与连接产物 2 μL，10×PCR buffer 5
μL，MgC12（25 mmol·L-1） 1.6 μL，引物 E3（20 μmol·
L-1） 1 μL， 引物 M3 （20 μmol·L-1） 1 μL，dNTPs（10
mmol·L-1）0.5 μL，Taq 聚合酶 （5 U·μL-1）0.25 μL，
ddH20至 20 μL。反应条件：94℃ 1 min 30 s；94℃ 30
s，56℃ 1 min，72℃ 1 min，30循环；72℃ 5 min。
产物于 1.0% agarose gel 上电泳，应能看到一弥
散带。
选择性扩增：预扩增产物稀释 10 倍，用于选择
性扩增。 10×PCR buffer 2 μL，MgC12 （25 mmol·L-1）
1.2 μL，预扩增稀释产物 2 μL，特异性引物 1（15 ng）
1 μL，特异性引物 2（15ng）1.5μL，dNTPs （10mmol·L-1）
0. 5 μL，Taq酶（5U·μL-1）0.2 μL，ddH20至 20 μL。 反
应条件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 1
min，13 循环 （每循环 1 次复性温度下降 0.7 ℃）；94
℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，25 循环；72 ℃ 4 min；
4℃保存。
电泳银染：PCR 产物用 6%的变性 PAGE 胶电
泳检测，电泳缓冲液为 1×TBE。 电泳结束后用硝酸
银染色观察结果。 根据刘建斌等[10]的银染方法并有
所改进。
SSR 方法：参照艾呈祥等 [11]方法。 PCR 反应体
系 ： 1 ×PCR Buffer，Taq 聚合酶 2.0 U， dNTP 0.20
mmol·L-1， 引物 0.13 μmol·L-1，Mg2+ 1.5 mmol·L-1，模
板 DNA 600 ng，加 ddH2O至 30 μL。 反应条件：94℃
3 min；94℃ 30 s，T（引物对的退火温度）30 s，72 ℃ 1
min，35个循环；72℃ 3 min。 PCR产物用 6%变性聚
王正加等: 山核桃×薄壳山核桃花粉直感效应与后代分析6 期 909
果 树 学 报 27 卷
注： 字母相同表示没有显著性差异，字母不同表示有极显著性差异。
Note: The same letter in multi-compare means no significant difference and with different letter means significant difference.
表 2 收获果实和种子品质分析
Table 2 Quality analysis of fruits and seeds
指标
Items
亲本组合
Combination of parents F 值 *
F vaule
亲本组合
Combination of par-
ents
多重比较
(Duncan)
Multi-compare♂0♀1 ♂1♀1 ♂2♀1
单果质量
Single fruit mass/g
果长
Fruit length/cm
果径
Fruit width/cm
果形指数
Fruit shape index
壳厚
Shell thickness/cm
果径/壳厚
Fruit width/Shell thickness
壳质量
Shell mass/g
仁质量
Kernel mass/g
出仁率
Kernel percentage/%
含油率
Oil content/%
粗蛋白
Crude protein/%
2.81 ±0.44
2.20 ±0.15
1.78±0.11
1.23 ±0.09
0.09± 0.01
19.67±2.90
1.49± 0.20
1.32± 0.29
0.47± 0.05
0.54±0.04
11.38±2.25
3.79 ±0.75
2.38 ±0.16
2.01±0.16
1.19 ±0.07
0.10±0.01
19.80±2.35
1.98±0.37
1.80 ±0.42
0.47 ±0.04
0.56±0.04
11.21±1.82
3.85±0.71
2.40±0.21
2.05±0.17
1.18±0.08
0.11±0.02
19.48±11.52
1.98±0.34
1.86±0.38
0.48±0.03
0.53±0.16
11.26±1.72
0.000 0
0.000 0
0.000 0
0.000 0
0.000 0
0.955 3
0.000 0
0.000 0
0.021 2
0.000 6
0.848 4
♂2♀1
♂1♀1
♂0♀1
♂2♀1
♂1♀1
♂0♀1
♂2♀1
♂1♀1
♂0♀1
♂2♀1
♂1♀1
♂0♀1
♂2♀1
♂1♀1
♂0♀1
♂1♀1
♂0♀1
♂2♀1
♂2♀1
♂1♀1
♂0♀1
♂2♀1
♂1♀1
♂0♀1
♂2♀1
♂1♀1
♂0♀1
♂1♀1
♂2♀1
♂0♀1
♂0♀1
♂2♀1
♂1♀1
A
A
B
A
A
B
A
A
B
A
B
B
A
B
C
A
A
A
A
A
B
A
A
B
A
A B
B
A
A
B
A
A
A
表 1 2006 年山核桃×薄壳山核桃坐果情况统计
Table 1 Statistics of the fruit setting of C. cathayensis×C.illinoensis in 2006
母本
Female
♀
父本
Male
♂
授粉时间
Date of
pollination/M·D
去袋时间
Date of
taking off bag/M·D
授粉袋数
No. of
pollination bag
授粉雌花数
No.of pollinated
female flower
收获种子数
No. of harvested
seed
播种苗
Number of
seedling
♀1
♀2
♂1
♂2
♂1
♂2
05·14
05·16
05·25
05·25
705
601
234
185
3 525
3 005
936
740
2 115
1 953
561
370
1 410
1 110
392
259
丙烯酰胺凝胶电泳， 电泳结束后用硝酸银染色观察
结果。
2 结果与分析
2.1 坐果情况统计
4个杂交组合共收获果实 4 999粒，其中♀1♂1
收获 2 115粒，♀1♂2收获 1 953粒，♀2♂1 收获果
实 561 粒，♀2♂2 收获 370 粒。 种子经催芽播种共
获得幼苗 3 171株。
2.2 果实与种子性状分析
对不同授粉组合收获果实与种子的比较观察表
明，种间杂交组合间不存在显著性差异，杂交组合与
对照间存在显著性差异（表 2），其中单果质量、果
长、果径、果形指数、壳厚、壳质量、仁质量、含油率均
存在极显著差异，组合排列依次为♀1♂2>♀1♂1>
♀1♂0。多重比较结果显示，亲本组合♀1♂2、♀1♂
910
6 期 王正加等: 山核桃×薄壳山核桃花粉直感效应与后代分析
图 2 AFLP 引物筛选
1~6 分别为 6 对不同引物，每对引物从左至右为 4 个后代，1 个母本♀1 和 1 个父本♂1
Fig. 2 The result of AFLP amplification of 6 pairs of primers
1 to 6 were six different primers， from left to right are four filial generations， mother （♀1） and father （♂1）
1间果形指数存在显著性差异，在♂1♀1、♂0♀1 间
不存在显著性差异； 而其余 5个表型指标中亲本组
合♀1♂2、♀1♂1 间不存在显著性差异，而与♀1♂
0存在显著性差异。 含油率存在极显著性差异，含量
由高到低的亲本组合依次为： ♀1♂1>♀1♂2>♀1
♂0。 出仁率存在显著性差异，亲本组合仅♀1♂2与
♀1♂1、♀1♂0间存在显著性差异。3个亲本组合收
获果实果径/壳厚、粗蛋白不存在显著性差异。 这些
结果表明采用薄壳山核桃花粉授粉能极大影响山核
桃果实的表型指数，并使果实明显增大。
从外观上（与对照相比）可以明显的看出，薄壳
山核桃花粉授粉收获果实果色由对照的锈黄色变为
黄绿色，对照果实果皮遍布黄色腺鳞，而种间授粉果
实果顶及棱附近布黄色腺点，但棱间为绿色。对照果
皮上棱脊从顶部达基部，突出均匀，而种间授粉果实
果棱变浅而残缺不全，外皮皱缩，中心下陷，果形变
大，颜色变绿，且表面凹凸不平（图 1），整个果实变
为长卵圆形或梨形。 研究结果与黎章矩 [4]的研究结
果一致。
2.3 AFLP鉴定
经过引物筛选（图 2），最终获得了 10 对引物组
合（E+/M+）用于最后的扩增。 共获得 137条带，多态
性条带为 0，在同一对引物中，母本与后代间无差异
条带，表现为单态性，父本和母本、后代间则有明显
的差异条带。 图 3是 E2M5是 46-65号样品 PCR扩
增结果。
2.4 SSR鉴定分析
本试验对父本、母本和 81个杂交后代样品分别
用 19 对引物进行了 SSR 分析， 引物对 PM-CA10、
PM-GA31、PM-CIN4 和 PM-CIN27 在薄壳山核桃扩
增出了如 Grauke 等[5]特异片段，且父本和母本、后代
有显著的差异条带，但母本与后代间则无差异条带；
引物对 PM-GA19、PM-GA28、PM-GA38、PM-GA39、
PM-GA41、PM-CIN13、PM-CIN20、PM-CIN22和 PM-
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
图 3 E2M5 引物扩增结果
1~21 为 21 个不同的样品；22 为♀1；23 为♂1
Fig. 3 The result of amplification of E2M5
1 to 21 were different simples, 22 was♀1，23 was♂1
911
果 树 学 报 27 卷
图 4 PM-CIN20 的扩增结果
泳道 1 为♂1（薄壳山核桃），2 为♀1（山核桃），3~15 为 13 个不同的后代样品
Fig. 4 PCR results of PM-CIN20
1 was♂1； 2 was♀1； 3 to 15 were different simples
CIN23 在父本薄壳山核桃上扩增出了如 Grauke 等[5]
中报道的特异片段，但父本、母本和后代间无差异条
带（图 4 ）。
3 讨 论
3.1 山核桃的花粉直感现象
野外人工授粉结果发现，以薄壳山核桃为父本、
山核桃为母本种间授粉收获的果实和种子表现出了
明显变异。 表现为果实增大，出仁率提高，外表皮颜
色及果实形状均发生很大变异，播种苗形态也表现
为母性性状 [12]。 这与黎章矩 [4]认为山核桃种间杂交
存在着明显的花粉直感现象的描述相符。花粉直感
是指外源花粉对种子或果实性状和发育的效应。近
年来利用花粉直感效应改善果实品质的研究在苹
果、京白梨、荔枝、板栗等几十种园艺作物上取得进
展[13-16]。 花粉直感的形成机理目前尚未有满意的解
释， 但目前研究显示激素在其中扮演重要角色。
Denney[17]研究发现，直感效应是由于 IAA、CTKs、GA3
浓度的不同而造成。 这种花粉直感效应不仅表现在
质量性状，也涉及到一些如仁大小、出仁率等与经济
价值有关的数量性状。 在山核桃生产利用种间传粉
花粉直感效应，需确定杂交园父母本的种植比例、花
粉的空间有效隔离距离、 母本简而易行的去雄方法
以及优良的杂交组合等，提高山核桃的商品价值。
3.2 山核桃的生殖机制
植物双受精过程中， 来自父本的精核 n 与来自
母本的极核 2n融合形成初生胚乳核，之后发育为胚
乳， 因此胚乳为 3n，3n胚乳性状的遗传规律不同于
2n的其他组织。 胚乳表现父本现象（如颜色、饱满度
等）的称为胚乳直感或种子直感，种皮或果皮表现父
本现象的称果实直感。胚乳直感是受精的结果，而果
实直感的原因则更为复杂。 利用 AFLP 和 SSR 分子
标记手段对种间授粉后代进行鉴定， 发现后代与母
本之间不存在差异， 而与父本之间有明显的差异条
带。根据孟德尔遗传规律，杂交子代基因的分离应为
3∶1，本试验结果与之不符。 这似乎表明山核桃与薄
壳山核桃种间传粉后代的基因型与母本完全一致，
没有父本的遗传信息， 而杂交当代果实和种子性状
测定发现包括出仁率、 种仁含油率等品质性状的差
异又不能完全否定花粉的效应， 由此推测山核桃可
能存在无融合生殖现象。 另外的线索也支持了该推
测，在山核桃的种子催芽播种试验中，选择自然授粉
的种子进行催芽， 在出苗的 586 粒种子中多胚率为
9.04%左右，但多数为双胚，极少量三胚，未发现四
胚及更多的胚存在于单个胚珠中。 对于山核桃的生
殖机制的研究前人未有报道，同为核桃科的核桃早在
20 世纪 40 年代就已报道存在无融合生殖现象 [18]，
Sartorius 等 [19]进一步对德国的一些栽培种进行研究
得出核桃无融合生殖为二倍体孢子生殖， 其胚可能
来源于卵细胞。 陈耀锋等[20]报道 3 个具无融合生殖
能力的核桃品种其胚胎来源于卵细胞。 虽然有些双
苗或多苗也不一定都是无融合生殖 [21]，但这种现象
与无融合生殖密切相关。
为进一步证实我们的推测，2008 年对同一授粉
母树进行了控制授粉试验， 结果显示套袋不授粉也
有极少量结果 0.4%，2，4-D 处理坐果率略有提高为
4%，而杀死处理（反复冻融处理）薄壳山核桃花粉和
杀死处理（反复冻融处理）山核桃居群内混合花粉的
200
bp
300
100
912
6 期 王正加等: 山核桃×薄壳山核桃花粉直感效应与后代分析
坐果率则分别为 7.6%和 8.4%， 表明在缺乏花粉或
花粉杀死情况下，山核桃也有可能坐果，笔者认为山
核桃可能存在无融合生殖，但需要进一步证明。
4 结 论
以 2株山核桃优树为母本， 分别授以 2 个品种
薄壳山核桃花粉， 均获得一定数量的种仁发育饱满
的种子。测定种间授粉收获的果实及种子性状，发现
单果质量、果长、果径、果形指数、壳厚、壳质量、仁质
量等性状都优于对照，差异显著，含油率与对照果实
也有差异达到极显著，3个亲本组合果径/壳厚、粗蛋
白不存在显著性差异。种间授粉收获果实在果色、果
型等果实外观上与对照相比也存在较大变异， 花粉
直感效应明显。 播种苗表型与母本相似，AFLP 和
SSR分子标记鉴定发现后代与母树以及后代之间无
差异条带，而后代与薄壳山核桃、母树与薄壳山核桃
间存在差异条带，推测山核桃可能存在无融合生殖。
（本文图版见插 1）
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