全 文 ：农 药
AGROCHEMICALS
第 4 9 卷 第 9 期
2010年9月
Vol. 49, No. 9
Sep. 2010
山核桃外果皮中胡桃醌含量测定及抑菌活性
刘丹萍1，张立钦2，陈安良2，王 琦1
(1.吉林农业大学 中药材学院，长春 130118； 2.浙江林学院 林业与生物技术学院，浙江 临安 311300)
摘要：对山核桃外果皮中胡桃醌的含量进行测定，并对其抑菌活性进行了研究。 HPLC测定山核桃外果皮中胡桃
醌含量为0.001 04%(干样)。 胡桃醌对供试的9种病原真菌菌丝生长抑制的EC50值为水稻纹枯病菌7.022 6 mg/L，
苹果腐烂病菌13.145 6 mg/L，水稻稻瘟病菌299.097 6 mg/L。 胡桃醌对苹果炭疽病菌孢子萌发抑制EC50值为
0.5083 mg/L，对玉米大斑病菌EC50值为2.236 mg/L。 活体测定中，胡桃醌1 000 mg/L对番茄灰霉病菌保护作用率
为42.52%，胡桃醌750 mg/L对番茄灰霉病菌治疗作用率为20.92%，与对照药剂丙烷脒相当。
关键词：山核桃外果皮；胡桃醌；抑菌活性
中图分类号：S482.2 文献标志码：A 文章编号：1006-0413(2010)09-0686-03
Content Determination and Inhibition Effect of Juglone in the Husk of
Carya cathayensis on Phytopathogenic Fungi
LIU Dan-ping1, ZHANG Li-qin2, CHEN An-liang2, WANG Qi1
(1.School of Chinese Medical Material, Jilin Agriculture University, Changchun 130118, China; 2.School of Forestry and
Biotechnology, Zhejiang Forestry College, Linan 311300, Zhejiang, China)
Abstract: Content determination of juglone in the husk of Carya cathayensis and the inhibition effect of juglone were
carried on. Content of juglone in the husk of Carya cathayensis was 0.001 04%. EC50 of juglone against Rhizoctonia
solani was 7.0226 mg/L; EC50 of juglone against Valsa mali was 13.145 6 mg/L and agaist Pyricularia oryzae was
of 299.0976 mg/L. The virulence test for the two phytopathogenic fungi by sproes germination method revealed that
the antifungal activity of juglone was higher against Glomerella cingulata (EC50 of 0.508 3 mg/L) than against
Exserohilum turcicum(EC50 of 2.236 mg/L). The detection of inhibition effect on Botrytis cinerea in vivo indicates
that the protective effect rate of juglone of 1 000 mg/L was 42.52% and therapy effect rate of 750 mg/L was 20.92%. This
result matchs with propane amidine.
Key words: husk of Carya cathayensis; juglone; anti-fungi activity
山核桃Carya cathayensis又名核桃楸、胡桃、胡桃楸、
小核桃，是国家三级保护濒危植物[1-2]。 主要分布于浙、皖
两省交界的天目山区。 在山核桃的生产加工过程中作为
废弃物的外果皮是一种有毒物质，可以导致鱼虾大量死
亡。 山核桃外果皮的处理问题一直困扰着产区的地方政
府和农民[3]。 目前尚未有理想的处理方法，绝大部分外果
皮都是随意倾倒于河边、路旁，任其腐烂发酵。 而关于山
核桃外果皮的研究国外尚无报道。
根据苏秀、林君阳[4-5]的研究可知：山核桃外果皮对植
物病原菌具有较高抑制活性，为寻找其中的活性成分，本
文分析测定了山核桃外果皮中胡桃醌的含量，测定了其抑
菌活性，以探讨胡桃醌作为山核桃外果皮杀菌剂有效成分
的可能性。
1 材料与方法
1.1 供试药品
胡桃醌(纯度99%)，购自上海云峰药业有限公司。
山核桃外果皮由浙江林学院天则山核桃科技开发有
限公司提供，于9月初山核桃收获季节采摘新鲜的手剥外
果皮，阴干，备用。
1.2 供试菌种
供试植物病原真菌：松针褐斑病菌Lecanosticta acicola、
番茄早疫霉病菌Alternaria solani 、苹果腐烂病菌Valsa
mali、小麦赤霉病菌Fusarium graminerum、水稻纹枯病菌
Rhizoctonia solan、水稻稻瘟病菌Pyricularia oryzae、大麦
赤霉病菌Gibberrella zeae、番茄灰霉病菌Botrytis cinerea、
玉米大斑病菌Exserohilum turcicum 、苹果炭疽病菌
Glomerella cingulata，均由浙江林学院林业与生物技术学
院森林保护学科提供。
1.3 仪器与试剂
仪器：Sartorius电子天平、人工气候箱、苏州安泰VS-
1300L-U型超净工作台、上海博讯YXQ-LS-18SI型手提
式灭菌器；Waters600高效液相色谱仪。
试剂：葡萄糖、琼脂、甲醇(分析纯，杭州大方试剂厂)，
磷酸二氢钠。
收稿日期：2010-03-30，修返日期：2010-04-12
作者简介：刘丹萍，女，研究方向：中药化学。 E-mail：ldpjl2006@sina.com。
应用技术
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2 实验方法
2.1 山核桃外果皮中胡桃醌含量测定
胡桃醌含量测定采用外标法[6-7]，色谱条件：C18反相色
谱柱(0.46 mm×250 mm)；甲醇-5%磷酸二氢钠溶液(体积比
60∶40)为流动相；检测波长250 nm；流速0.8 mL/min；柱温
为室温；进样量20 µL；保留时间12 min。
2.1.1 标准曲线的绘制
称取胡桃醌标准品溶解于甲醇中，配制成质量浓度分
别为0.6、1.2、2.4、4.8 mg/L的标准溶液。 用0.45 µm微孔滤
膜过滤。 分别取20 µL依次进样，以峰面积值对样品质量浓
度绘制标准曲线。
2.1.2 供试液的制备
将山核桃外果皮阴干，粉碎。 精确称取2 g山核桃外
果皮粉末，用滤纸包裹，置于烧杯中。 加入氯仿超声提取
30 min，过滤。 重复提取2次，合并提取液，浓缩至干。 用少
量甲醇溶解，定容至10 mL，进样前用0.45 µm微孔滤膜过
滤，用HPLC检测。
2.2 胡桃醌抑菌活性测定(生长速率法)
将胡桃醌用甲醇溶解配制成2 g/L的原液。 用甲醇将
原液稀释至1 g/L，250、125、62.5、31.25、15.625 mg/L备用。
采用生长速率法[8-9]测定胡桃醌的抑菌活性。 待对照
培养皿长满后取出培养皿，用游标卡尺量菌落直径(十字
交叉量取2次，用其平均数)。 按下列公式计算抑制率：
菌落直径(cm) = 菌落直径平均数- 0.5(菌饼的直径)
抑制率(%) = 对照菌落直径-处理菌落直径×100
对照菌落直径
用几率值分析法，求出毒力回归方程、抑制中浓度和
相关系数。
2.3 胡桃醌抑菌活性测定(孢子萌发法)
采用孢子萌发法 [10-12]测定胡桃醌对苹果炭疽病菌
和玉米大斑病菌进行孢子萌发的抑制作用。
2.3.1 孢子悬浮液制备
将5 mm的玉米大斑病菌和苹果炭疽病菌的菌饼分
别接于PDA培养基上，在25 ℃恒温培养箱内培养7~10 d
后产孢，加入5%葡萄糖蒸馏水溶液，用纱布过滤得孢子
悬浮液，用葡萄糖蒸馏水溶液调整至107个/L的孢子悬
浮液。
配制胡桃醌甲醇溶液质量浓度分别为4、8、12、16、20、
40、60、80 mg/L的溶液备用。
2.3.2 孢子萌发率检查及计算方法
经适当培养后镜检孢子萌发率，当对照萌发率大于
80%后，检查所有处理萌发率，以孢子萌发后芽管长度大
于孢子短半径为萌发。
孢子萌发率和孢子萌发抑制率，按照下列公式计算。
孢子萌发率(%) = 萌发孢子数 ×100
检查孢子总数

孢子萌发抑制率(%) = 对照孢子萌发率-处理孢子萌发率×100
对照孢子萌发率
用几率值分析法，求出毒力回归方程、半数效应质量
浓度和相关系数。
2.4 胡桃醌抑菌活性测定(活体测定)
番茄活体组织法保护作用与治疗作用的测定：将胡桃
醌配制成一定质量浓度的乳油。 保护作用测定时先在番
茄表面均匀涂上配制好的胡桃醌溶液，晾干后在番茄上用
针在5 mm直径范围内刺10下，接入生长旺盛的同一圆周
上的直径为5 mm的番茄灰霉菌饼，正面朝下，每个番茄接
2个菌饼，每组3个番茄，接好菌后放入温度为20 ℃、湿度
为90%的培养箱中培养。 治疗作用测定时先在番茄上接入
菌饼，后均匀喷施胡桃醌溶液。 设750、1 000 mg/L两个质
量浓度处理，以水为对照，1 000 mg/L丙脘脒处理为药剂
对照。 4~5 d后十字交叉法测量病菌直径2次取平均值，求
得保护效果。
防效(%) = 对照病斑平均直径-处理病斑平均直径×100
对照病斑平均直径-菌饼直径
3 结果与分析
3.1 胡桃醌标准曲线及山核桃外果皮中胡桃醌含量
胡桃醌标准曲线为y=1.48×105x+6.06×104，线性范围
1.2×10-2~9.6×10-2 µg，r=0.997222，RSD=5.783 750%。 山
核桃外果皮中胡桃醌含量为0.001 04%。
山核桃外果皮样品的HPLC图见图1。
图1 山核桃外果皮样品中胡桃醌的保留时间
3.2 对9种供试病原真菌菌丝生长的抑制作用及毒力
测定
胡桃醌对9种病原菌菌丝生长毒力测定见表1。 由
表1可知：胡桃醌对水稻纹枯病菌菌丝的生长抑制作
用最好(EC50值为7.022 6 mg/L)，其次为苹果腐烂病菌
(EC50值为13.145 6 mg/L)，再次为松针褐斑病菌(EC50值
为17.827 4 mg/L)对水稻稻瘟病菌作用最差(EC50值为
刘丹萍，等：山核桃外果皮中胡桃醌含量测定及抑菌活性
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299.097 6 mg/L)。
表1 胡桃醌对9种病菌菌丝生长抑制毒力测定
供试病原真菌 回归方程 EC50值/ 相关
(y=) (mg·L-1) 系数
水稻纹枯病菌 3.855 4+1.352 1x 7.0226 0.9366
苹果腐烂病菌 3.238 8+1.574 2x 13.1456 0.9782
松针褐斑病菌 3.520 8+1.182 3x 17.8274 0.9634
大麦赤霉病菌 3.460 1+0.928 2x 45.6017 0.9936
番茄灰霉病菌 3.113 7+0.827 0x 190.9631 0.9686
玉米大斑病菌 2.862 7+0.898 9x 238.6146 0.9855
水稻稻瘟病菌 2.417 8+1.043 0x 299.0976 0.9852
小麦赤霉病菌 3.576 2+0.898 6x 38.4184 0.9477
番茄早疫霉病菌 3.441 3+0.759 6x 112.7055 0.9931
3.3 对2种供试病原真菌孢子萌发的毒力测定
胡桃醌对供试病菌孢子萌发的毒力见表2。 胡桃醌对苹
果炭疽病菌的孢子萌发抑制作用较好(EC50值为0.508 mg/L)，
对玉米大斑病菌作用较差(EC50值为2.236 mg/L)。
表2 胡桃醌对2种病菌孢子萌发抑制作用的毒力方程
供试病原真菌 回归方程(y=) EC50值/(mg·L-1) 相关系数
苹果炭疽病菌 -4.701 8+3.585 2x 0.508 0.9309
玉米大斑病菌 -4.442 5+2.819 1x 2.236 0.9767
3.4 活体抑菌活性测定结果
采用组织法进行了胡桃醌对番茄灰霉病保护和治疗
2种作用，测定结果见表3。 由表3可见：胡桃醌750 mg/L
的保护和治疗作用率分别为30.23%和20.92%，胡桃醌
1 000 mg/L的保护和治疗作用率分别为42.52%和35.83%，
1 000 mg/L丙脘脒的保护和治疗作用率分别为45.42%和
21.04%，保护作用明显优于治疗作用。 1 000 mg/L丙脘脒
的保护作用明显高于所有质量浓度胡桃醌，而治疗作用
却不如胡桃醌。
表3 胡桃醌对番茄灰霉病的保护作用测定
作用方式 胡桃醌/(mg
·L
-1) 丙烷脒/(mg·L-1)
750 1 000 1 000
保护作用/% 30.23a 42.52c 45.42b
治疗作用/% 20.92a 35.83c 21.04b
注：表中同行数据标不同字母表示在P=0.05差异显著。
4 讨论
本文对山核桃外果皮中胡桃醌进行含量测定并进行
抑菌活性研究，来探讨胡桃醌是否可以作为山核桃外果皮
抑菌活性成分进行植物源农药开发。
所测得山核桃外果皮中胡桃醌含量为0.001 04%(干
样)，根据孙墨珑等[6]测得的核桃楸外果皮中胡桃醌含量为
0.002 29%。 林君阳[5]对山核桃外果皮具有生物活性的氯
仿萃取相进行了分离，其中主要含有黄酮类化合物，如乔
松酮、Flavokawain B等；作者亦对其具有生物活性的正丁
醇萃取层分离得到了胡桃醌及4,8-二羟基-5-(3,4,5-三羟
基-6-(羟甲基)四氢-2H-吡喃-2-氧基)-3,4-二氢-1(2H)-
萘酮等化合物(另文发表)。 但是这些化合物中只有胡桃醌
含量比较高，为其作为山核桃外果皮中抑菌活性成分奠定
了含量基础。
据研究，山核桃外果皮甲醇提取物对水稻纹枯病菌
的菌丝生长抑制作用最好(EC50值为29.8 g/L)，其次为番
茄灰霉病菌(EC50值为31.1 g/L)，对玉米大斑病菌作用最
差(EC50值为46.2 g/L)[4]，氯仿和正丁醇相10 g/L时抑菌效
果好[5]。 而本文所得的胡桃醌抑菌活性EC50值测定结果与
其相当。 因此为胡桃醌可以作为山核桃外果皮中抑菌活
性成分奠定了生物活性基础。
近年来开发出的植物源农药品种较多，典型代表为
川楝、印楝、苦皮藤和鱼藤，而将它们开发成植物源农药
的研究思路主要是寻找一种含量较高、生物活性较强的
化合物作为活性成分的代表。 如川楝中的川楝素开发成
0.5%川楝素杀虫乳油，其800~1 000倍液对菜青虫防效达
90%以上 [13]；印楝中的印楝素开发成0.3%印楝素乳油，其
500~1 000倍液对茶小绿叶蝉具有良好防治效果[14]，施药
量为1.5 L/hm2时对稻纵卷叶螟具有较好防治效果[15]；苦皮
藤中的苦皮藤素开发成0.2%苦皮藤素乳油，其1 500倍液对
茶尺蠖有较高防效，500倍液对小绿叶蝉具有一定防效[16]，
1%苦皮藤素乳油施药量0.6 L/hm2时对蝗虫防效最好，达
到90.07%[17]；鱼藤中的鱼藤酮开发成7.5%鱼藤酮乳油，其
1 000倍液对蔬菜蚜虫防效最好，达到95%以上[18]，2.5%鱼
藤酮乳油施药量为18.75~37.5 g/hm2时对稻纵卷叶螟有良
好的防治效果[19]。 它们都是在植物中含量较高、并且具有
较高生物活性的物质，现已逐步被开发成植物源农药。 由
此可以得出结论：胡桃醌可作为山核桃外果皮杀菌剂活性
成分，以其制定产品标准等。
参考文献：
[1] 蔡德海, 陈虹, 董小青, 等. 核桃外皮的抗真菌作用研究[J]. 武警
医学, 2006, 17(4): 266-267.
[2] 杜旭, 王明晶, 姜力伟, 等. 中药青龙衣镇痛作用机理的研究[J].
中国中医药科技, 1997, 4(3): 155-156.
[3] 宋朝枢. 自然保护区工作手册[M]. 北京: 中国林业出版社,
1988: 41-43.
[4] 苏秀. 山核桃外果皮提取物抑菌活性的初步研究[J]. 浙江林学
院学报, 2008, 25(3): 355-358.
[5] 林君阳. 山核桃外果皮提取物化学成分及抑菌活性的初步研
究[J]. 浙江林学院学报, 2009, 26(1): 100-104.
[6] 孙墨珑, 宋湛谦, 方桂珍. 核桃楸总黄酮及胡桃醌含量测定[J].
林产化学与工业, 2006, 26(2): 93-95.
[7] 索绪斌, 高奎滨, 张云凌, 等. 高效液相色谱法测定青龙衣中胡
桃醌含量[J]. 中药材, 2003, 26(11): 793.
[8] 方中达. 植病研究方法[M]. 3版. 北京: 中国农业出版社, 1998: 152.
[9] WHEATLEY R. Effect of Substrate Composition on Production
of Volatile Organic Compounds from Trichoderma spp. Inhibitory
to Wood Decay Fungi[J]. International Biodeterioration &
Biodegradation, 1997, 39(2/3): 199-205.
(下转第701页)
701第9期
记申请，同时提交降低风险资料的第3部分(环境影响)并在
封面中明确指出申请登记的种类，环保局会考虑优先审批。
4.2 审批程序
通常在收到申请后的1个月左右，降低风险委员会安排
会议，环保局的最终决定也在该会议上产生。 对于新的化
学产品申请降低风险使用和第一食品使用服从已登记的化
学产品审批程序，如果不能如期完成，委员会则等到环保局
将其最终资料全部完成才制定相关会议时间。 提交申请的
1~2周内将收到通知常规降低农药风险会议召开时间的电
话。 大多数情况下都将会被邀请参加常规降低农药风险会
议。 已注册登记的常规降低农药风险的有效成分的新使
用、有机磷代替情况和更改先前决定的情况例外。
4.3 降低农药风险委员会会议内容
内容：1)申请人简要介绍10~15个在申请降低农药风
险登记的理由；2)委员会成员将向公司技术代表提问，了
解申请降低风险登记中的情况；3)委员会内部讨论；4)形
成会议决定。 会议结束后，将给申请登记人发送1份最终决
定文件。 如果环保局拒绝申请人的降低风险申请，从收到
环保局的书面决定文件开始，申请人有30 d的时间提交反
驳意见。 该反驳意见应该邮寄或通过特快专递交给降低
风险评估项目负责人。 随后委员会将根据补充资料重新
考虑并开会重新评估降低风险决定。
5 对已批准降低常规农药风险的产品申请新用途
的程序
如果已收到过关于农药使用的降低风险批准证书，并
且正在申请同一种农药的不同使用的降低风险申请，环保
局则提供一份该程序审核的精简程序。 这个简化程序是
假定目前提交的报告由降低风险委员会审议并没有任何
问题。 通常情况下，在收到降低风险资料后30 d之内环保
局将做出同意降低农药风险申请登记的决定，并且也不需
要召开委员会会议。
环保局接受已经同意登记降低风险有效成分的新用途
的资料。 申请的格式应类似于一个支持表格信息的扩充摘
要。 说明需提交地点、多少份资料以及相关的申请手续。
以下的例子不适合精简程序：1)化学制剂需求的风险
描述中有大量变动(如首次申请登记使用作物和防治对
象)；2)以前降低风险的决定涉及复杂或难以解决的问题；
3)化学制剂中新的信息需要大量分析资料；4)和代替产品
相比，风险评估结论清晰而且最初提交的材料就获得降低
风险评估登记；5)申请不充分。
在这些情况下，委员会将要求申请者提供一个更加详
细的资料，并有可能参加委员会的正式常规降低农药风险
会议。 如果选择采用精简程序提交降低风险登记，则申请
应包括：1)拟定农药使用场所，并控制这些使用地点的虫
害；2)提供拟定使用的产品，常规降低农药风险评估登记，
使用质量是主要原因；3)整体描述农药使用风险时将改变
这些新用途(例如参考剂量使用百分之多少，如何降低非
把标物种超出量和一些新风险担忧的关注水平等)；4)拟定
用途理由(例如耐药性问题、有限替代品等)；5)对使用上述
地点和虫害需要替代的农药列出清单，该清单应该包括美
元和英亩的市场份额处理，并包括目前使用的主要产品以
及最新的风险选择；6)预计在5年内的市场份额和从什么
产品中采用这种市场份额；7)制表总结产品的毒理学和环
境影响，按照上述中的第5部分比较产品；8)制表总结应用
比率并按照上述中的第5部分比较产品性能；9)产品的配
方及使用方法；10)要求使用的场所有效成分代表季节性
治疗方案；11)统计需求使用模型中减少的数据，并与当前
使用的典型项目相比较(确保这些项目确实是在典型的主
产区)；12)复制建议标签。
参考文献：
[1] EPA. What Is the Conventional Reduced Risk Pesticide Program.
责任编辑：李新
[10] OUEDRAOGO R M. Inh ib i t ion of Funga l Growth in
Thermoregulating Locusts, Locusta migratoria , Infected by
the Fungus Metarhizium anisopliae var acridum[J]. Journal of
Invertebrate Pathology, 2003, 82: 103-109.
[11] 吴文君. 植物化学保护实验技术导论[M]. 西安: 陕西科学技术
出版社, 1987: 141-145.
[12] 张兴, 王兴林. 植物化学保护实验指导[M]. 陕西: 西北农林科技
大学, 2000: 66-67.
[13] 张兴, 杨崇珍. 西北地区杀虫植物的筛选[J]. 西北农业大学学
报, 1999, 27(2): 21-27.
[14] 柳有广, 韦君学. 0.3%印楝素乳油防治茶小绿叶蝉田间药效试
验[J]. 广西植保, 2009, 22(3): 21-22.
[15] 杨成琴, 邵耕耘. 0.3%印楝素防治稻纵卷叶螟试验[J]. 植物医
生, 2009, 22(5): 38-39.
[16] 韦静风, 文兆明. 0.2%苦皮藤素乳油防治茶尺蠖等害虫药效试
验研究[J]. 植物保护科学, 2007, 23(6): 488-492.
[17] 郭娅琚, 梁振英, 王利武, 等. 1%苦皮藤素乳油防治农牧交错区
蝗虫药效试验[J]. 内蒙古科技与经济, 2008(10): 100.
[18] 卢杰, 石冠超. 7.5%鱼藤酮乳油对蔬菜蚜虫和柑桔红蜘蛛的防
效[J]. 长江蔬菜, 2009(10): 65-67.
[19] 陈红福, 陈爱大. 植物源农药鱼藤酮对稻纵卷叶螟和褐飞虱的
防治效果[J]. 江苏农业科学, 2008(5): 114-115.
责任编辑：李新
(上接第688页)
吕崟崟：美国采用措施降低常规农药风险