全 文 ：第４０卷　第４期
２０１２年４月
西北农林科技大学学报（自然科学版）
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔ．Ｓｃｉ．Ｅｄ．）
Ｖｏｌ．４０ Ｎｏ．４
Ａｐｒ．２０１２
网络出版时间：２０１２－０３－２１　１７：０９
网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／６１．１３９０．Ｓ．２０１２０３２１．１７０９．００８．ｈｔｍｌ
山苍子（Ｌｉｔｓｅａ　ｃｕｂｅｂａ）可培养内生细菌的多样性
＊
游　玲ａ，魏　琴ａ，郭　华ｂ，张　云ｂ
（宜宾学院ａ发酵资源与应用四川省高校重点实验室，ｂ生命科学与食品工程学院，四川 宜宾６４４０００）
［摘　要］　 【目的】研究山苍子可培养内生细菌的多样性。【方法】利用添加植物组织浸提液的营养琼脂培养基
分离山苍子根、茎、叶及果实中的可培养内生细菌，采用１６ＳｒＤＮＡ序列鉴定法对分离获得的山苍子可培养内生细菌
进行鉴定。同一组织内，对１６ＳｒＤＮＡ序列及形态完全一样的菌株合并冗余，用Ｃｌｕｓｔａｌｘ对分离得到的菌株１６ＳｒＤ－
ＮＡ进行排序，构建Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ系统进化树，并计算Ｊａｃｃａｒｄ指数和多样性指数。【结果】共分离得到５２株山苍
子可培养内生细菌（根２３株、茎８株、叶７株、果实１４株），分属于芽孢杆菌属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、类芽孢杆菌属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、
Ｐａｅｎｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ、普罗威登斯菌属（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、假单胞菌属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、鞘氨醇单胞菌属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）和Ｌｙ－
ｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ共７个属的１６个种，其中芽孢杆菌属细菌４０株，与Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｅｑｕｉｌｅｎｓｉｓ、解淀粉芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅ－
ｆａｃｉｅｎｓ）、苏云金芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）３个种最接近的内生细菌占分离细菌株数的６９．２％；根及果实中的可培
养内生细菌数量及种属均最丰富，其多样性指数高于茎、叶；叶与果实可培养内生细菌的Ｊａｃｃａｒｄ指数最高，达０．５６，其余
均较低。【结论】山苍子可培养内生细菌在植株内部的分布既有种属特异性，又有器官相似性。
［关键词］　山苍子；可培养内生细菌；多样性
［中图分类号］　Ｑ９３８ ［文献标识码］　Ａ ［文章编号］　１６７１－９３８７（２０１２）０４－０２１０－０７
Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ｃｕｌｔｉｖａｂｌｅ　ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａ
ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｌｉｔｓｅａ　ｃｕｂｅｂａ
ＹＯＵ　Ｌｉｎｇａ，ＷＥＩ　Ｑｉｎａ，ＧＵＯ　Ｈｕａｂ，ＺＨＡＮＧ　Ｙｕｎｂ
（ａＫｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ａｔ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ　ｏｆ　Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，
ｂ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｆｏｏｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｙｉｂｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙｉｂｉｎ，Ｓｉｃｈｕａｎ６４４０００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙ　ｗａｓ　ｄｏｎｅ　ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｉｎ　Ｌｉｔ－
ｓｅａ　ｃｕｂｅｂａ．【Ｍｅｔｈｏｄ】Ｗｅ　ｔｏｏｋ　ｎｕｔｒｉｅｎｔ　ａｇａｒ　ｍｅｄｉｕｍ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｗａｔｅｒ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｆ　Ｌｉｔｓｅａ　ｃｕｂｅｂａｆｏｒ　ｉｓｏ－
ｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｗｅｒｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅｉｒ　１６ＳｒＤＮＡ　ｐａｒｔｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｒｅ－
ｄｕｎｄａｎｔ　ｉｓｏｌａｔｅｓ　ｗｅｒｅ　ｆｕｓｅｄ　ｉｎ　ａ　ｃｅｒｔａｉｎ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｐａｒｔｉａｌ　１６ＳｒＲＮＡ　ｇｅｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ａｎｄ　ｃｏｌｏｎｙ　ｍｏｒ－
ｐｈｏｌｏｇｙ，ｔｈｅｎ　１６ＳｒＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅｓｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ　ｂｙ　Ｃｌｕｓｔａｌｘ，ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ｗａｓ　ｃｏｎ－
ｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ，Ｊａｃｃａｒｄ　ｉｎｄｅｘ　ａｎｄ　ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｉｎｄｅｘ　ｗｅｒｅ　ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅ－
ｌｙ．【Ｒｅｓｕｌｔ】５２ｎｏｎ－ｒｅｄｕｎｄａｎｔ　ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｉｓｏｌａｔｅｓ　ｗｅｒｅ　ａｓｃｅｒｔａｉｎｅｄ，ｏｆ　ｗｈｉｃｈ，２３ｉｓｏｌａｔｅｓ　ｗｅｒｅ
ｆｒｏｍ　ｒｏｏｔｓ，８ｆｒｏｍ　ｓｔｅｍｓ，７ｆｒｏｍ　ｌｅａｖｅｓ　ａｎｄ　１４ｆｒｏｍ　ｆｒｕｉｔｓ．５２ｓｔｒａｉｎｓ　ｂｅｌｏｎｇｅｄ　ｔｏ　１６ｓｐｅｃｉｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　７ｇｅｎｅｒａ
ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｐａｅｎｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ，Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ，Ｌｙｓｉｎｉ－
ｂａｃｉｌｌｕｓ．４０ｓｔｒａｉｎｓ　ｂｅｌｏｎｇｅｄ　ｔｏ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ，ａｎｄ　１６ＳｒＤＮＡ　ｐａｒｔｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　３６ｓｔｒａｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｎｅａｒｅｓｔ　ｔｏ　Ｂａ－
ｃｉｌｌｕｓ　ｔｅｑｕｉｌｅｎｓｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗｈｉｃｈ　ａｃｃｏｕｎｔｅｄ　ｆｏｒ
６９．２％ｏｆ　ａｌ　ｉｓｏｌａｔｅｓ；ｍｏｒｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ａｎｄ　ｍｏｒｅ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｒｏｏｔｓ　ａｎｄ　ｆｒｕｉｔｓ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
＊ ［收稿日期］　２０１１－１０－１３
［基金项目］　四川省教育厅青年基金项目“山苍子内生菌分离及应用研究”（０９ＺＢ１０３）
［作者简介］　游　玲（１９８１－），女，四川武胜人，助理研究员，主要从事应用微生物学研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｏｕｌｉｎｇ８１０５２１＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
DOI:10.13207/j.cnki.jnwafu.2012.04.001
ｗｅｒｅ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｓｔｅｍｓ　ａｎｄ　ｌｅａｖｅｓ；ｔｈｅ　Ｊａｃｃａｒｄ　ｉｎｄｅｘ　ｏｆ　ｌｅａｖｅｓ　ａｎｄ　ｆｒｕｉｔｓ　ｗａｓ　０．５６，ｍｕｃｈ　ｌｏｗｅｒ　ｔｈａｎ　ｏｔｈ－
ｅｒｓ．【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｕｌｔｉｖａｂｌｅ　ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｉｎ　Ｌｉｔｓｅａ　ｃｕｂｅ－
ｂａ　ｗａｓ　ａｌｉｅｄ　ｔｏ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａ，ａｎｄ　ｓｉｍｉｌａｒ　ｔｏ　ｓｏｍｅ　ｅｘｔｅｎｔ　ａｍｏｎｇ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｏｒｇａｎｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｌｉｔｓｅａ　ｃｕｂｅｂａ；ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａ；ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
　　植物内生菌是指那些在其生活史的一定阶段或
全部阶段，生活于健康植物各种组织和器官内部或
细胞间隙的真菌、细菌、放线菌，他们与宿主植物之
间存在明显的互惠共生关系。已有研究表明，植物
中的内生细菌对宿主具有抗病促生的作用［１］，作为
生物菌剂在生物防治方面和促进植物生长方面有着
重要的应用价值，目前已有许多类似研究。
山苍子（Ｌｉｔｓｅａ　ｃｕｂｅｂａ），俗称山鸡椒，是樟科木
姜子属的落叶灌木或小乔木，广泛分布于南方各省，
是我国重要的香料树种，其主要产物柠檬醛可用于
制造紫罗兰酮等系列高级香料，这种香料的国内外
市场需求量很大。我国年产山苍子油２　０００余ｔ，出
口量居世界首位，宜宾山苍子野生面积超过３　０００
ｈｍ２，人工栽培面积也较大，是宜宾重要的芳香油植
物资源。目前，本研究小组已对油樟、香樟及岩桂这
３种樟科香料植物的内生细菌区系进行了研究，明
确了一些樟科香料植物内生细菌分布的规律，发现
部分内生细菌有促进这些植物次生代谢产物积累的
作用（结果待发）。山苍子作为本区域内重要的香料
植物，开展其内生细菌区系分布规律研究，不仅有助
于探明在相似的地理气候条件下，不同樟科植物内
生细菌的区系分布特征，分析内生细菌分布与环境
及樟科植物遗传背景之间的关系，丰富内生细菌的
基础理论，对山苍子油产量及油中柠檬醛的含量的
提高具有潜在的现实意义；而且还可将分离所得菌
种与油樟、香樟和岩桂内生细菌一起，初步建立樟科
香料植物内生菌的菌种库，搭建此类微生物资源保
护与利用的平台，为宜宾香料植物的进一步开发利
用提供理论基础。本研究对存在于山苍子各组织中
的可培养内生细菌进行了分离与鉴定，并对其区系
关系进行了分析，现将结果报道如下。
１　材料与方法
１．１　材　料
１．１．１　山苍子样品的采集　山苍子采自四川省宜
宾县双龙镇山苍子人工林内，采样时间为２００９－０９，
在山苍子林中５０ｍ２ 范围内，选取无明显植物病害、
树龄接近的植株２０株，分别采集其不同器官（根、
茎、叶和果实），采集当天带回实验室进行内生菌分
离。
１．１．２　山苍子组织无菌水浸液的制备　取健康山
苍子植株的根（直径１～５ｍｍ）、茎（１～２年生枝条，
直径５～１０ｍｍ）、叶（随机选取）和果实各５０ｇ，分别
打碎后等质量混合，称取８０ｇ混合样品，加２００ｍＬ
水，１１５℃灭菌２０ｍｉｎ，然后用无菌纱布过滤，收集
滤液备用。
１．１．３　主要试剂和仪器　ＰＣＲ仪及梯度电泳仪均
为Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司产品；ＤＮＡ提取扩增所用试剂为上
海生物工程技术服务有限公司（Ｓａｎｇｏｎ）产品；其余
试剂均为国产分析纯试剂。
１．２　山苍子可培养内生细菌的分离及鉴定
１．２．１　分　离　分离培养基采用１／２牛肉膏蛋白
胨培养基＋山苍子植物组织水浸液＋制霉菌素５０
ｍｇ／Ｌ。随机挑选根、茎、叶、果实各１００ｇ，洗净风
干，用体积分数７５％乙醇分别浸泡２，３，１，１ｍｉｎ，无
菌水冲洗６次，无菌滤纸吸干；用１ｇ／Ｌ升汞分别浸
泡５０，６０，４０，４０ｓ，无菌水冲洗６次，取最后一次的
无菌水洗液涂于相应平板上，以检测表面消毒是否
彻底。取上述消毒彻底的样品，加无菌石英砂研磨，
用无菌水梯度稀释至１０－３。取上述样品稀释液，涂
布分离平板，每一稀释梯度涂布１０个平板，定期观
察分离平板，挑取单菌落划线接种于牛肉膏蛋白胨
斜面上，培养。
１．２．２　鉴　定　根据文献［２］的方法并作适当改
进，采用１６ＳｒＤＮＡ序列相似性分析方法对山苍子
可培养内生细菌进行鉴定。试验所用引物为通用引
物： ２７ｆ： ５′－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＴＧＧＣＴＣＡＧ－３′，
１５４１ｒ：５′－ＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＧＣＣＧＣＡ－３′。引
物由上海生物工程技术服务有限公司（Ｓａｎｇｏｎ）合
成。提取上述培养物基因组ＤＮＡ，参照文献［３］的
方法扩增其１６ＳｒＤＮＡ，将ＰＣＲ产物送上海生物工
程技术服务有限公司（Ｓａｎｇｏｎ）纯化并测序。对从
同一器官内分离到的１６ＳｒＤＮＡ序列完全相同的菌
株，根据其菌落颜色、大小、突起特征、边缘特征、表
面度和透明度等肉眼可辨的特征合并冗余。对所测
序列用ＥｚＴａｘｏｎ　ｓｅｒｖｅｒ　２．０在线软件［４］进行相似性
分析，将其所对应的菌株鉴定到属，并用ｄｏｔｕｒ软件
进行０．００及０．０１序列差异度下的分类［５］。
１１２第４期 游　玲，等：山苍子（Ｌｉｔｓｅａ　ｃｕｂｅｂａ）可培养内生细菌的多样性
１．３　基于１６ＳｒＤＮＡ的山苍子可培养内生细菌的
系统发育分析
用ＣｌｕｓｔａｌＸ软件按照最大同源性对所有纯培
养菌株的１６ＳｒＤＮＡ序列进行排序，参考文献［５］，
采用Ｋｉｍｕｒａ　２软件计算核苷酸差异值，并用 Ｂｉ－
ｏＥｄｉｔ　５．０．９软件进行检验，最后用 Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎ－
ｉｎｇ法［６］构建系统进化树，自展数（Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ）为
１　０００。
１．４　山苍子可培养内生细菌的区系分析
计算山苍子不同器官分离获得的可培养内生细
菌间的Ｊａｃｃａｒｄ指数（Ｃ），分析山苍子各器官可培养
内生细菌菌株区系分布的相似性。
Ｃ＝ｊ／（ａ＋ｂ－ｊ）。
式中：ａ，ｂ为不同器官的物种数，ｊ为２种器官共有
的物种数。
多样性指数（香农指数，Ｈ′）的计算公式为：
Ｈ′＝－∑Ｐｉｌｎ　Ｐｉ。
式中：Ｐｉ＝Ｎｉ／Ｎ，其中Ｎｉ 为器官某物种的个体数，
Ｎ 为个体总数［７］。
２　结果与分析
２．１　山苍子可培养内生细菌的分离与鉴定
山苍子根、茎、叶和果实各器官经表面消毒后，
用最后一次冲洗的无菌水接种于相同的分离平板
上，结果均未见细菌生长，表明表面消毒彻底，后续
试验分离到的细菌为山苍子可培养内生细菌。
试验共分离到６５株可培养内生细菌，其１６Ｓ
ｒＤＮＡ序列长度为１　０００～１　１００ｂｐ，合并冗余后，得
到５２株可培养内生细菌，其１６ＳｒＤＮＡ序列 Ｇｅｎ－
Ｂａｎｋ登录号为：ＪＮ２５２０５１～ＪＮ２５２１０１、ＪＮ２５６０３４。
由表１可知，分离的５２株可培养内生细菌分属于７
个属的１６个种，其中４６株可培养内生细菌为产芽
孢细菌，占山苍子可培养内生细菌的８８．５％。从根
中分离到的２３株可培养内生细菌全部是产芽孢细
菌，分属于芽孢杆菌属（１８株）的３个种、类芽孢杆
菌属（４株）的２个种和Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属（１株）的１
个种；从茎中分离的８株可培养内生细菌分属于芽
孢杆菌属（６株）的１个种、鞘氨醇单胞菌属（１株）的
１个种，还有１个未定种；从叶中分离的７株菌属于
芽孢杆菌属（５株）的３个种、假单胞菌属（１株）的１
个种和普罗威登斯菌属（１株）的１个种；从果实中
分离的１４株菌属于芽孢杆菌属（１０株）的３个种、
类芽孢杆菌属（１株）的１个种、假单胞菌属（１株）的
１个种、普罗威登斯菌属（１株）的１个种和Ｐａｅｎｏ－
ｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ属（１株）的１个种。从果实中分离得
到的可培养内生细菌种数及株数均高于根、茎和叶，
不管是０．００差异度还是０．０１差异度（即种级水平）
下，其多样性指数均明显高于根、茎和叶，其中茎中
可培养内生细菌的多样性指数最低。总体上，山苍
子整体及各个部位的可培养内生细菌多样性均明显
低于土壤及其他自然生态环境［８］，表明山苍子植株
对环境细菌具有明显的选择富集作用。
表１　山苍子可培养内生细菌的分离
Ｔａｂｌｅ　１　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｉｎ　Ｌｉｔｓｅａ　ｃｕｂｅｂａ
来源
Ｒｅｓｏｕｒｃｅ
属
Ｇｅｎｕｓ
分离菌株数
Ｎｏ．ｏｆ
ｉｓｏｌａｔｅｓ
操作分类单位个数
Ｎｏ．ｏｆ　ｏｐｅｒａｔｉｏｎ　ｔａｘｏｎｏｍｙ　ｕｎｉｔｓ
０．０１序列差异度
Ｕｎｉｑｕｅ＝０．０１
０．００序列差异度
Ｕｎｉｑｕｅ＝０．００
多样性指数
Ｓｈａｎｎｏｎ　ｉｎｄｅｘ
０．０１序列差异度
Ｕｎｉｑｕｅ＝０．０１
０．００序列差异度
Ｕｎｉｑｕｅ＝０．００
根
Ｒｏｏｔｓ
芽孢杆菌属Ｂａｃｉｌｕｓ　 １８
类芽孢杆菌属Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　 ４
Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　 １
６　 ９　 ０．６１　 ０．８５
茎
Ｓｔｅｍｓ
芽孢杆菌属Ｂａｃｉｌｌｕｓ　 ７
鞘氨醇单胞菌属Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　 １
３　 ４　 ０．３２　 ０．５３
叶
Ｌｅａｖｅｓ
芽孢杆菌属Ｂａｃｉｌｌｕｓ　 ５
普罗威登斯菌属Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ　 １
假单胞菌属Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　 １
５　 ５　 ０．６７　 ０．６７
果实
Ｆｒｕｉｔｓ
芽孢杆菌属Ｂａｃｉｌｌｕｓ　 １０
类芽孢杆菌属Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　 １
Ｐａｅｎｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ　 １
普罗威登斯菌属Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ　 １
假单胞菌属Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　 １
７　 ９　 ０．７２　 ０．８７
合计Ｔｏｔａｌ　 ７　 ５２　 １３　 １６　 ０．７８　 ０．９８
２．２　山苍子可培养内生细菌的系统发育分析
从图１可看出，基于１６ＳｒＤＮＡ序列的相似性，
可将从山苍子根、茎、叶、果实中分离到的５２株可培
养内生细菌分为Ａ～Ｆ　６个类群，Ａ类群最大，包括
２１２ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４０卷
４１株细菌，其中根、茎、叶和果实可培养内生细菌分
别为１９，７，５，１０株。Ａ类群又可分为７簇，其中以
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｅｑｕｉｌｅｎｓｉｓ、解淀粉芽孢杆菌和苏云金芽孢
杆菌为代表的３个簇包含３６株菌，占分离总数的
６９．２％，可见以这３个种为代表的可培养内生细菌
为山苍子内生环境中的优势细菌。
图１　山苍子可培养内生细菌的１６ＳｒＤＮＡ系统发育树
自展数为１　０００；各分支上的数据表示聚类概率；图中“／”前数据代表某器官菌株数，“／”后数据代表该分支的菌株总数
Ｆｉｇ．１　Ｄｅｎｄｒｏｇｒａｍ　ｆｏｒ　ｃｕｌｔｉｖａｂｌｅ　ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍＬｉｔｓｅａ　ｃｕｂｅｂａ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｐａｒｔｉａｌ　１６ＳｒＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
Ｔｈｅ　ｓｃａｌｅ　ｂａｒ　ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　２０ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ　ｐｅｒ　１　０００ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ｏｆ　１６ＳｒＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｓｅｑｂｏｏｔ　ｖａｌｕｅｓ　ｗｅｒｅ
ｓｈｏｗｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｂｒａｎｃｈｅｓ．Ｔｈｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ｂｅｆｏｒｅ“／”ｍｅａｎｓ　ｔｈｅ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ｏｆ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｔｉｓｓｕｅ，
ａｎｄ　ｔｈｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ａｆｔｅｒ“／”ｍｅａｎｓ　ｔｈｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｂｅｌｏｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｂｒａｎｃｈ
　　芽孢杆菌属细菌在环境中大量存在，从多种植 物内均可分离到。从图１可看出，芽孢杆菌属细菌
３１２第４期 游　玲，等：山苍子（Ｌｉｔｓｅａ　ｃｕｂｅｂａ）可培养内生细菌的多样性
在山苍子根、茎、叶和果实各个器官均有分布，其中
以Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｅｑｕｉｌｅｎｓｉｓ种为代表的可培养内生细菌
在根、茎、叶、果实４个器官均有分布；以解淀粉芽孢
杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）为代表的可培养
内生细菌在根、茎、果实中均有分布；以苏云金芽孢
杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）为代表的可培养内生
细菌在根、叶、果实中均有分布。按与相应种模式菌
株对应序列相似性大于９９％即可认为是同种的原
则［９］可知，山苍子有１株属于Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂａｄｉｕｓ种的
可培养内生细菌仅在根内分布，１株属于Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｄｒｅｎｔｅｎｓｉｓ种的可培养内生细菌仅在茎内分布；Ｌｙ－
ｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属仅包括１株分离自根内的细菌；类芽
孢杆菌属的５株菌中，有２株仅在根内分布的菌属
于Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｘｙｌａｎｉｌｙｔｉｃｕｓ、有２株仅在根内分
布的菌属于Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｅｒｒｉｇｅｎａ，有１株分离自
果实的可培养内生细菌属于Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌａｕｔｕｓ
种；属于假单胞菌属、普罗威登氏菌属的可培养内生
细菌（各１株）仅在果实及叶中存在；属于Ｐａｅｎｏ－
ｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ 属Ｐａｅｎｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ　ｇａｌｌｉｎａｒｉｉ种的
细菌（１株）仅在果实中存在；属于鞘氨醇单胞菌属
Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｎａｔａｔｏｒｉａ种的细菌（１株）仅在茎部
存在。
Ｂ类群中的类芽孢杆菌属细菌是土壤中常见的
产芽孢细菌，Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｘｙｌａｎｉｌｙｔｉｃｕｓ与Ｌｙｓｉｎｉ－
ｂａｃｉｌｌｕｓ属的Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｘｙｌａｎｉｌｙｔｉｃｕｓ细菌均
可分解木质素，可能是来自于土壤的腐生细菌。Ｃ
类群中Ｐａｅｎｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ　ｇａｌｌｉｎａｒｉｉ是２００９年发
现的一个新种［１０］，分离自谷仓内，国内尚未见报道，
本试验从山苍子果实中分离到１株与该种较为接近
的菌株。Ｄ类群中鞘氨醇单胞菌属细菌可降解多种
芳香物质［１１］，Ｅ类群中的Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ　ｒｅｔｔｇｅｒｉ曾作
为脱氮菌用于环境污染治理［１２］，本试验从山苍子植
株茎中分离到１株鞘氨醇单胞菌属细菌，从果实及
叶中各分离到１株与Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ　ｒｅｔｔｇｅｒｉ种最接
近的细菌，这３株细菌可能在环境保护方面有一定
的应用价值，这有待进一步研究。
２．３　山苍子可培养内生细菌分布的相似性及特异
性分析
根据１６ＳｒＤＮＡ序列０．００差异度条件下的物
种统计，由表２可知，山苍子果实中的可培养内生细
菌与叶中的可培养内生细菌相似性最高，为０．５６，
即山苍子果实中超过一半的可培养内生细菌１６Ｓ
ｒＤＮＡ序列与叶中完全相同；果实、叶与根、茎可培
养内生细菌区系相似性均较低，说明叶、果实与根、
茎可培养内生细菌的来源有较大差异，叶、果实可培
养内生细菌主要来源于空气、雨水，而根、茎可培养
内生细菌则更可能直接来自土壤；果实与根可培养
内生细菌区系相似性为０．２９，低于果实与叶的相似
性，高于果实与茎的相似性，且果实与根共有的类芽
孢杆菌属可培养内生细菌不能在茎或叶中分离到
（图１），说明果实与根相同的可培养内生细菌不完
全是通过茎转移至果实的，还存在其他转移途径，如
空气、雨水等。
山苍子茎与根、叶、果实可培养内生细菌区系的
相似性均较低，８株茎可培养内生细菌中的６株属
于Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｅｑｕｉｌｅｎｓｉｓ 和Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａ－
ｃｉｅｎ这２个在植株内广泛分布的优势种，除此之外，
茎与根、叶、果实之间再无同种可培养内生细菌，说
明茎不是山苍子可培养内生细菌在各组织间转移传
递的良好介质；茎中独有的分属于Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ
ｎａｔａｔｏｒｉａ和Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｒｅｎｔｅｎｓｉｓ的２株可培养内生
细菌，可能直接来自于空气，也可能经由根、叶、果实
转移而来，但由于种种因素，其在原组织中衰亡，最
终仅在茎内生长定殖。
表２　山苍子不同器官可培养内生细菌间的Ｊａｃｃａｒｄ指数（０．００序列差异度下）
Ｔａｂｌｅ　２　Ｊａｃｃａｒｄ　ｉｎｄｅｘ　ａｍｏｎｇ　ｔｈｅ　ｆｌｏｒａ　ｏｆ　ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｏｒｇａｎｓ　ｉｎ　Ｌｉｔｓｅａ　ｃｕｂｅｂａ（Ｕｎｉｑｕｅ＝０．００）
Ｊａｃｃａｒｄ指数
Ｊａｃｃａｒｄ　ｉｎｄｅｘ
根
Ｒｏｏｔｓ
茎
Ｓｔｅｍｓ
叶
Ｌｅａｖｅｓ
果实
Ｆｒｕｉｔｓ
根Ｒｏｏｔｓ　 １．００ － － －
茎Ｓｔｅｍｓ　 ０．１８　 １．００ － －
叶Ｌｅａｖｅｓ　 ０．１７　 ０．１３　 １．００ －
果实Ｆｒｕｉｔｓ　 ０．２９　 ０．１８　 ０．５６　 １．００
３　讨　论
可培养法及免培养法均可用于植物内生菌的区
系研究，通常认为免培养法可覆盖更多的细菌种属，
广泛用于植物微生态研究［１３］，但本研究发现，即使
采用了与水稻内生细菌相同的片段扩增法［１４］进行
ＰＣＲ－ＤＧＧＥ，经过对体系条件的多次优化，叶绿体
及线粒体仍会对山苍子内生细菌的ＤＧＧＥ条带多
样性造成严重干扰，导致无法通过ＰＣＲ－ＤＧＧＥ进行
细菌种属的多样性分析，加之可培养细菌相对于不
４１２ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４０卷
可培养的细菌而言，具有更好的潜在应用价值，故本
研究仅讨论山苍子可培养内生细菌。为了保证试验
结果的可靠性，采样点选择多年生山苍子人工林，并
将多株植株的样品进行混合，从而在一定程度上避
免了植物个体差异和环境条件偶然变化对试验结果
造成的影响；试验对山苍子不同器官表面消毒的条
件进行了优化，这在一定程度上避免了表面消毒条
件过于剧烈或过于温和对内生菌多样性的影响［１５］；
同时，本试验采用在分离平板中添加分离样品汁液
的方法，以使培养条件尽可能接近可培养内生细菌
在宿主中的生活条件，保证可培养内生细菌最大可
能地被分离出来［１６］。
在对分离所得山苍子可培养内生细菌进行鉴定
时，本研究沿用了当今细菌鉴定的主流方法———１６Ｓ
ｒＤＮＡ序列鉴定法，但该方法也存在偏保守和可能
出现多操纵子等问题。本研究发现，某些１６ＳｒＤ－
ＮＡ序列相似性在９９％以上的菌株，其形态及生理
生化特征仍有明显差别，因此本研究将１６ＳｒＤＮＡ
序列相同但菌落形态不同的菌株认定为不同菌株；
同时，利用ｄｏｔｕｒ软件进行不同差异度下的细菌类
群划分，有助于理清各菌株间的相互关系。
从山苍子可培养内生细菌的种属分布来看，一
方面，其与本地另外２种重要香料植物油樟［１７］和香
樟［１８］的内生细菌存在较大的相似性，Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｅ－
ｑｕｉｌｅｎｓｉｓ、苏云金芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、Ｂａｃｉｌ－
ｌｕｓ　ｄｒｅｎｔｅｎｓｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｅｒｒｉｇｅｎａ在３种樟科
香料植物内均有分布，且根据从多个数据库中检索
的关于内生细菌的文献中，Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属细菌仅
在这３种植物中作为内生细菌被分离到。但山苍子
与油樟、香樟的内生细菌区系相似性明显低于油樟
与香樟内生细菌区系相似性，这可能是由于山苍子
与油樟、香樟的亲缘关系不如油樟与香樟的亲缘关
系密切所致。与其他地区或种属的植物相比，樟科
植物均体现出对Ｂａｃｉｌｌｕｓ属细菌的偏好，说明植物
内生细菌区系构成可能与其遗传背景有关。同时，
芽孢杆菌属细菌也是从该地区的其他环境中分离到
的优势种属细菌（相关研究成果待发），表明影响植
物内生细菌分布的主要因素仍然是自然环境。
本研究首次对山苍子可培养内生细菌的区系进
行了分析，结果发现，其可培养内生细菌类群存在多
样性（分属于７个属的１６个种），且植物不同器官的
可培养内生细菌区系具有程度不同的相似性，这种
相似性在一定程度上揭示了山苍子可培养内生细菌
的来源及其在植株内部的迁移过程。本研究得到了
植物内生菌区系与植株本身遗传背景有关的推论，
获得了一些微生物资源，为进一步的应用研究提供
了材料。
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
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（上接第２０９页）
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ｗｉｔｈ　ｓａｌｉｃｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｃｏｌｄ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｉｎ　ｒｅｄ　ｆｅｓｃｕｅ（Ｆｅａｔｕａ
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ｏｇｅｎｏｕｓ　ｓａｌｉｃｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　ｏｎ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｏｆ　ｓｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｏｍａｔｏ　ｔｏ
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［２０］　李才生，秦　燕，宗　盼．水杨酸对玉米幼苗生长及细胞膜的
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６１２ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４０卷