全 文 ：[基金项目 ] 　浙江省卫生厅医药卫生科研项目 (2006C151)
[作者简介 ] 　丁钢强(1964-),博士 ,主任医师 , 主要从事营养与
保健食品研究。
【论著】
三叶青对小鼠细胞因子及免疫功能影响研究
丁钢强1 , 徐彩菊 1 , 孟佳 1 , 魏克民2 , 浦锦宝 2 , 傅剑云 1 , 郑军献 2 , 楼晓明 1 , 章荣华 1
(1.浙江省疾病预防控制中心 , 杭州　310009;2.浙江省中医药研究院 , 杭州　310000)
[摘要 ] 　目的:研究三叶青对免疫功能和细胞因子的影响。方法:三叶青提取物进行灌胃 , 研究免疫功能和细胞因子的
变化。结果:三叶青能明显提高小鼠免疫功能和 TNF-α、IFN-γ指标。结论:提示三叶青可进行进一步开发利用。
[关键词 ] 　三叶青;免疫;细胞因子
[中图分类号 ] 　R151.3　　　　[文献标识码 ] 　A　　　　[文章编号 ] 　1004-8685(2008)09-1724-03
Researchoftetrastigmahemsleyanumdielset.gilgoncelfactorsandimmunefunction
DingGang-qiang1 , XuCai-ju, MenJia1 , WeiKe-min2 , PuJin-bai2 , FuJian-yun1 , ZhengJun-xian2 , LouXiao-ming1 , Zhang
Rong-hua1
(1.ZhejiangCentreforDiseaseControlandPrevention, Hangzhou310009, China;2.ZhejiangInsitituteofTraditionalChinese
Medicine, Hangzhou310000, China)
[ Abstract] 　Objective:ToexplorethetetrastigmahemsleyanumDielset.Gilgofextendingtheimmunityanditsinfluenceon
cellproliferationandapoptosis.Methods:EthylacetatewereusedtoextractthedifferentchemicalsubstanceofTetrastigmahems-
leyanumthroughthecelculturetechniquemethodinvitrotoexploretheanti-tumorefect.Results:Theethylacetateextractof
TetrastigmahemsleyanumcanimprovetheimmunityandcelfactorsofTNF-α, IFN-γsignificantaly.Conclusion:Tetrastigma
hemsleyanumDielset.Gilgcanbeusedfurther.
[ Keywords] 　Tetrastigmahemsleyanumdielset.Gilg;Immunity;Celfactors
　　最近研究不断揭示肿瘤发病人数呈不断上升的趋势 , 根
据浙江省各类死因报告资料分析肿瘤的发病情况看 [ 1] , 肝癌 、
肺癌仍是威胁人群健康的主要肿瘤。对于这些肿瘤的治疗 ,
采用植物药提高机体免疫能力进行辅助治疗仍是方法之一。
为此选择三叶青开展对免疫作用的研究。三叶青 [ 2]为葡萄科
崖爬藤属植物 , 学名为三叶崖爬藤 TetrastigmaHemsleyanum
Dielset.Gilg。主要分布于我国西南及安徽 、浙江 、江西 、云南
等省。三叶青 [ 3, 4]以块根或全草入药 , 具有清热解毒 、祛风化
痰 、活血止痛的功能 ,用于治疗高热惊厥 、肺炎 、哮喘 、肝炎 、风
湿 、月经不调 、咽痛 、瘰疬 、痈疔疮疖等症 , 具有很好的疗效。
在民间三叶青还被用于肿瘤的治疗 , 被许多民间验方收载 ,并
认为具有很好的治疗作用。 大量的研究表明:中药具有免疫
调节作用 , 研究证明其不仅直接作用于细胞免疫 , 而且通过整
体作用来控制细胞免疫与细胞因子的活动。
本研究通过对三叶青酯溶性有效成分提取 , 将该提取物
对小鼠灌胃 , 通过检测小鼠体内各项细胞因子的变化以及各
项细胞免疫和体液免疫指标的变化 , 研究三叶青体内免疫调
节作用 [ 3] , 为进一步研究其抗肿瘤免疫机制奠定基础。
1　材料与方法
1.1　实验材料
1.1.1　主要仪器设备　酶标仪(MultiskanMK3,芬兰 , 上海雷
勃分析仪器有限公司经销),超净工作台(YJ-875SA, 江苏吴
江市净化设备总厂),普通离心机(LXJ-Ⅱ型 , 上海医用分析
仪器厂), 低速自动平衡离心机(LDZ-2, 北京医用离心机
厂), 显微镜(CH30 RF200, 日本奥林巴斯), 二氧化碳培养箱
(Heraeus, 德国), MouseIL-2 ELISA试剂盒 、MouseIL-6
ELISA试剂盒 、 MouseTNF-αELISA试剂盒 、 MouseIFN-
γELISA试剂盒(R＆D公司 , 美国)。
1.1.2　实验动物　清洁级雌性 ICR小鼠 , 浙江中医学院实验
动物中心提供(合格证号:医动字第 220010004, 清洁级 , 雌性 ,
体重 20±2g)。饲料由浙江省实验动物中心提供 , 执行标准
GB14924-2001。
1.2　实验方法
1.2.1　三叶青乙酸乙酯提取物 , 用蒸馏水配制成各剂量 ,实验
设 4个剂量组和一个蒸馏水对照组 , 4个剂量分别相当于人推
荐量的 5、10、30和 50倍(人推荐量为三叶青 30.0 g/日)。灌
胃给药 15 d, 第 15天灌胃 1h后处死 , 眼眶取血 , 离心备用。
灌胃剂量按 0.1ml/10g体重计 ,每组 5只小鼠。
1.2.2　ELISA法检测小鼠血清细胞因子的变化:小鼠血清检
测 IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ4个细胞因子。
1.2.3　ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验 、绵羊红细胞
(SRBC)诱导小鼠 DTH(足跖增厚法)、抗体生成细胞检测
(Jerne改良玻片法)、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验
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(半体内法)、 小鼠碳廓清试验:均按卫生部《保健食品检验与
评价技术规范(2003年版)》要求进行 [ 4] 。
1.2.4　数据处理:采用 SPSS10统计软件分析。
2　结果
2.1　三叶青对小鼠体内细胞因子含量的影响
小鼠用三叶青提取物灌胃 15 d后 , 体内 IL-2、IL-6含
量没有显著变化 , 各个不同灌胃剂量组间也无显著差异 , 如表
1所示。而 IFN-γ、TNF-α含量存在增长现象 , 并且随着药
物剂量增大 , 细胞因子增长量存在相应增高趋势。 IFN-γ含
量在剂量 30倍剂量组小鼠体内的增长最多 , 为 386.38 ±
42.71 pg/ml,与对照组(313.62±36.37pg/ml)比存在显著性
差异 , P<0.05。 TNF-α含量在剂量 50倍剂量组小鼠体内的
增长最多 , 为 214.48 ±38.53 pg/ml, 与对照组 (148.64 ±
37.27 pg/ml)比存在显著性差异 , P<0.05,见表 1。
表 1　三叶青对小鼠体内细胞因子含量的影响(x±s)
类别 对照组 5倍组 10倍组 30倍组 50倍组
IL-2
IL-6
TNF-α
IFN-γ
5.72±1.99
57.88±15.39
148.64±37.27
313.62±36.37
6.22±2.63
46.82±21.56
157.98±53.52
318.88±67.44
5.69±2.41
55.9±17.29
157.6±36.87
301.88±69.74
5.09±1.31
55.66±21.72
185.62±36.02
386.38±42.71＊
6.51±2.96
57.32±17.15
214.48±38.53＊
338.46±60.27
　　＊与对照组比较 , P<0.05
2.2　三叶青对 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响
与阴性对照组(蒸馏水)比较 , 5.0、 15.0、25.0 g/kg体重
三剂量组均能提高 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞的增殖能力 ,
差异均有显著性(q检验 , P<0.05), 结果见表 2。
表 2　三叶青对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响(x±s)
组别 动物数(只) 光密度差值
阴性对照(H2O) 10 0.178±0.029
2.5g/kg 10 0.171±0.019
5.0g/kg 10 0.215±0.015＊
15.0g/kg 10 0.204±0.020＊
25.0g/kg 10 0.219±0.015＊
F值 11.803
P值 0.000
　　＊与阴性对照比较, P<0.05
2.3　三叶青对绵羊红细胞诱导小鼠 DTH的影响
与阴性对照组(蒸馏水)比较 , 5.0、 15.0、 25.0 g/kg体重
三剂量组均能增加小鼠左后足跖部厚度差 24 h测量值 , 差异
均有显著性(q检验 , P<0.05), 见表 3。
2.4　三叶青对小鼠抗体生成细胞的影响
与阴性对照组(蒸馏水)比较 , 2.5、 5.0 g/kg体重两剂量
组均能提高小鼠溶血空斑数 , 差异均有显著性(q检验 , P<
0.05), 见表 4。
表 3　三叶青对绵羊红细胞诱导小鼠 DTH的影响(x±s)
组别 动物数(只) 左后足跖部厚度差(cm)24h
阴性对照(H2O) 10 0.026±0.007
2.5g/kg 10 0.031±0.008
5.0g/kg 10 0.035±0.007＊
15.0g/kg 10 0.038±0.006＊
25.0g/kg 10 0.038±0.004＊
F值 6.373
P值 0.000
　　＊与阴性对照比较 , P<0.05
表 4　三叶青对小鼠抗体生成细胞的影响(x±s)
组别 动物数(只) 溶血空斑数(个 /106脾细胞)
阴性对照(H2O) 10 58±11
2.5 g/kg 10 80±19＊
5.0 g/kg 10 94±19＊
15.0g/kg 10 72±18
25.0g/kg 10 64±12
F值 7.635
P值 0.000
　　＊与阴性对照比较 , P<0.05
2.5　三叶青对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的影响
与阴性对照组(蒸馏水)比较 , 15.0 g/kg体重剂量组能提
高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬指数 , 差异有显著
性(q检验 , P<0.05)。四剂量组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红
细胞的吞噬率和阴性对照组(蒸馏水)比较 , 差异无显著性
(方差分析 , P>0.05), 见表 5。
表 5　三叶青对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的影响(x±s)
组别 动物数(只) 吞噬率(%) 吞噬指数
阴性对照(H2O) 10 34.8±7.6 0.65±0.30
2.5g/kg 10 34.2±5.8 0.70±0.15
5.0g/kg 10 34.7±10.9 0.79±0.25
15.0g/kg 10 44.3±8.6 1.04±0.23＊
25.0g/kg 10 36.1±5.6 0.90±0.27
F值 2.416 3.405
P值 0.063 0.016
　　＊与阴性对照比较 , P<0.05
2.6　三叶青对小鼠碳廓清试验吞噬指数的影响
原始数据符合方差齐性要求(P>0.05), 与阴性对照组
(蒸馏水)比较 , 2.5、 5.0、 15.0、25.0 g/kg体重剂量组小鼠吞
噬碳末的吞噬指数 , 差异均有显著性(q检验 , P<0.05), 见
表 6。 　　
1725中国卫生检验杂志 2008年 9月第 18卷 第 9期　ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology, Sep2008;Vol18　No9
表 6　三叶青对小鼠碳廓清试验吞噬指数的影响(x±s)
组别 动物数(只) 吞噬指数
阴性对照(H2O) 10 5.00±0.38
2.5g/kg 10 5.46±0.36＊
5.0g/kg 10 5.63±0.59＊
15.0g/kg 10 5.66±0.66＊
25.0g/kg 10 5.73±0.31＊
F值 4.008
P值 0.007
　　＊与阴性对照比较, P<0.05
3　分析与讨论
3.1　三叶青提取物对小鼠细胞因子的影响
细胞因子 [ 6]是免疫细胞(单核 、巨噬细胞 、T细胞 、B细胞 、
NK细胞等)和某些非免疫细胞(如血管内皮细胞 、表皮细胞 、
纤维母细胞等)合成分泌的一类生物活性蛋白。按功能 , 细胞
因子可以分为介导天然免疫的 CK、介导特异性免疫的 CK、激
活炎性细胞的 CK、激活造血的 CK。介导天然免疫的 CK多数
为单核 /巨噬细胞产生的单核因子 [ 7] , 如 TNF-α、IL-1、IL-
6、IL-8、趋化因子 、IFN-α、IFN-β 等 ,它们参与抗病毒感染
和抗菌性炎症反应;介导特异性免疫的 CK主要由抗原激活的
CD4+T细胞产生 ,如 IL-2、IL-4、IL-5、TGF-β 等 , 它们介
导淋巴细胞激活 、增值并分化成抗原特异性效应细胞;激活炎
性细胞的 CK如 IFN-γ、MAF、IL-8、IL-10、IL-12、LT、MIF
等 , 其主要功能是激活非特异性效应细胞 , 介导细胞免疫的效
应过程;激活造血的 CK如 IL-3、CSF、EPO、IL-7等 , 它们强
烈刺激造血干细胞增殖 、分化成各种成熟血细胞 , 并形成细胞
集落 , 统称 CSF。细胞因子的产生 、生物学作用 、受体表达 、相
互调节具有网络特点 。一种 CK可作用于多个不同的靶细胞 ,
多种 CK可作用于同一种靶细胞 , CK之间还可以互相诱生。
研究三叶青对体内细胞因子的影响 , 意在探索三叶青抗肿瘤
的免疫学机制。
研究结果表明 , 三叶青可以使小鼠体内 TNF-α、IFN-γ
含量增高。 TNF-α具有明确的体内外杀伤肿瘤细胞的作
用 [ 8, 9] , TNF-α诱导的肿瘤细胞杀伤作用是通过其诱导细胞
凋亡实现的。肿瘤细胞表面有一种名为 Fas的分子 , 是 TNF
受体(TNFR)家族成员。细胞表面的或可溶性的 TNF与 TNFR
(P55)结合后 , 发出死亡信号导致肿瘤靶细胞凋亡。 IFN-γ
是由 T细胞产生 ,具有直接抑制肿瘤细胞增殖 ,增加表面 MHC
抗原和肿瘤坏死因子表达 , 抗肿瘤血管生成等多种抗肿瘤作
用。同时 , IFN-γ可以通过调控肿瘤细胞的 Fas/FasL表达以
及增强肿瘤细胞对 Fas所介导凋亡途径的敏感性 , 使肿瘤细胞
逃避免疫系统攻击的能力降低 , 从而抑制肿瘤细胞的恶性增
殖。 IFN-γ还可以促进 NK细胞的杀伤活性 , 其机制是增强
NK细胞识别结构的标定 , 并上调 NK细胞合成细胞毒因子 ,
NK细胞也是机体非特异抗肿瘤免疫的重要途径。
3.2　三叶青对小鼠免疫功能的影响
恶性肿瘤的发生发展与机体免疫功能低下有关 , 肿瘤的
生长又加重机体免疫抑制。机体的免疫应答过程是由一系列
复杂的免疫反应组成的。完整的免疫系统包含了细胞免疫 、
体液免疫 、单核 -巨噬细胞吞噬作用和自然杀伤细胞的攻击
作用。为了全面观察三叶青在改善小鼠免疫力方面的功能 ,
作者选择了反映细胞免疫功能的小鼠脾淋巴细胞转化试验和
迟发型变态反应试验;反映体液免疫功能的抗体生成细胞检
测和血清溶血素测定;反映单核 -巨噬细胞吞噬功能的小鼠
碳廓清试验和小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验。
三叶青剂量为 5.0、15.0、25.0 g/kgBW时其 ConA诱导的
小鼠脾淋巴细胞的 OD差值和小鼠左后足跖部厚度差 24h测
量值与对照组比较差异均有显著性 , 说明三叶青能提高小鼠
细胞免疫功能;2.5、5.0 g/kgBW两剂量组均能提高小鼠溶血
空斑数 , 与对照组比较差异有显著性;2.5、 5.0、 15.0、
25.0 g/kgBW四 剂 量 组 小 鼠 吞 噬 碳 末 的 吞 噬 指 数 ,
15.0 g/kgBW剂量组能提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞
的吞噬指数 , 与对照组比较差异均有显著性 , 说明三叶青能增
强单核 -巨噬细胞吞噬功能。
巨噬细胞除对异物 、死亡细胞进行吞噬和消化外 [ 9] , 还参
与识别 、吞噬和处理抗原 、传递免疫信息等免疫反应过程。在
细胞免疫反应中 , 巨噬细胞在胸腺依赖性抗原(TD抗原)致敏
T淋巴细胞的过程中起着重要的作用;在体液免疫反应中 , TD
抗原活化 B细胞也必须有巨噬细胞参与。因此 , 三叶青增强
小鼠免疫功能 , 可能与其首先激活巨噬细胞功能有关。 三叶
青免疫调节作用的功效因子及其机理有待于进一步的研究。
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(收稿日期:2008-03-31)
1726 中国卫生检验杂志 2008年 9月 第 18卷 第 9期　ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology, Sep2008;Vol18　No9