全 文 ：2009年第 1期 牡丹江教育学院学报 No.1 , 2009(总第1 13期) JOU RNAL OF M UDANJIANG COLLEGE OF EDUCATION Serial No.113
[ 收稿日期] 2008-07-18
[ 作者简介] 李立君(1973-),女 ,湖南益阳人 ,吉首大学实验师。
三月泡提取物分离纯化及抑菌活性研究
李 立 君
(吉首大学 , 湖南 张家界 427000)
[ 摘 要] 采用液液萃取和柱层析方法对三月泡叶醇提取物进行分离纯化 , 通过抑菌实验对其活性进行跟
踪检测来分析其不同方法中的抑菌效果。
[ 关键词] 三月泡 ;液液萃取 ;柱层析 ;抑菌作用
[ 中图分类号] O625 [ 文献标识码] A [ 文章编号] 1009-2323(2009)01-0123-03
三月泡又名悬钩子 、龙船泡 、泡儿刺 、双叶悬钩子。悬
钩子属植物 ,作为药用植物在国内外均有很长的历史 , 且
应用广泛。目前对三月泡的研究主要集中在资源调查和食
品应用与加工方面 ,而对其药理研究方面比较欠缺 ,关于它
的药效成分 、药理方面的研究还未见报道 , 其叶之药用价值
未被重视。加强对三月泡叶药用有效成分的分析与生物活
性研究 , 从中开发新型的 、无毒的中药 ,对合理开发利用巨
大的中药资源宝库与探索新的天然药物具有深远的意义 ,
市场前景也非常广阔。
一 、材料及方法
(一)材料
原材料:三月泡叶 , 2007 年 9 月采于吉首大学张家界
校区后山 ,阴干粉碎备用。
试剂:乙醇 、石油醚 、蒸馏水 、丙酮 、氨水 、乙腈 、CMC-
Na、硅胶 G(山东青岛海洋化工有限公司制造)、蛋白胨 、牛
肉膏 、琼脂(国产生物制剂)。
供试菌种:金黄色葡萄球菌 、大肠杆菌 、痢疾志贺氏菌 ,
购于湖南省疾病预防控制中心 ,实验室冷冻保藏。
主要仪器:薄膜旋转蒸发仪 、PH 酸度计 、磁力搅拌器 、
烘箱 、培养箱 、超净工作台 、超低温冰箱 、高压蒸汽灭菌器 、
1/万天平 、AM-8 均化器 、脚踏式离心机 、真空干燥器 、层
析玻璃柱 、FD-1 冷冻干燥机 、WT-150 小型粉碎机 、B-
8200 超声波清洗器。
(二)方法
1.三月泡活性成分提取
称取 10.0Kg 粉碎的三月泡叶 , 加入 10 倍体积 80%的
工业乙醇搅匀 ,常温下浸提 48h 过滤。滤渣再重复提取一
次 ,合并滤液 , 浓缩成浸膏。
2.三月泡活性成分液液萃取分离纯化
将浸膏液用石油醚萃取 ,反复多次 , 直到石油醚萃取相
澄清为止 ,分得两层 , 上层为石油醚萃取相 ,下层为水层 ,呈
黄棕色;水层用 B 反复多次萃取 , 直至 B 萃取相澄清为止 ,
分得两层 ,上层为 B 萃取相 , 呈深棕色 , 下层水层为棕色;
将再次合并的水层用水饱和 C 反复多次萃取 , 直至 C 萃取
相颜色接近透明 , 分得两层 , 上层为 C 萃取相 , 呈深红色 ,
下层为水层 ,呈深红褐色。将石油醚层 、B 层 、C 层及水层
分别浓缩 ,冷冻干燥 , 备抑菌用。
3.三月泡活性成分柱层析分离纯化
(1)活化硅胶
称取硅胶 1Kg ,用乙醇少量多次清洗干净后 ,再用蒸馏
水清洗几遍 ,至无明显乙醇气味即可。将洗好的硅胶用瓷
盆铺开装好 ,放入烘箱中在 105℃下烘 6 小时 , 降温后拿出
即可装柱。
(2)装柱
采用湿法装柱, 将活化好的硅胶与 Ar混合, 用玻棒搅
匀 ,边搅边倾倒柱中 ,中间不能间隔太久 ,否则容易产生断层
现象 ,影响过柱效果。装柱的时候要注意平衡和没有气泡 ,
如果有气泡和不平衡可用玻璃棒搅拌并用吸耳球轻轻敲打
柱子 ,使硅胶沉降均匀。装好柱后 ,静置一天后再上样。
(3)上样
B 样品 35g , 用 B 溶解 , 加 70g 活化好的硅胶混合 , 搅
棒均匀后放置培养皿内 50℃烘干后上柱。
(4)洗脱
加洗脱液 ,逐级洗脱。本实验用 Ar 与 Br 进行梯度洗
脱 ,第 1梯度为纯 Ar 洗脱 , 其后各梯度为 Ar:Br=90:1 、
80:1 、65:1 、50:1、35:1 、20:1 , 最后为纯 Br 溶液洗脱;洗脱
液体积为 3 倍柱体积。
(5)柱层析样品的合并
柱层析完成后 , 合并洗脱液 , 统计共得洗脱液 110 瓶 ,
每 10 瓶合成为一个样 , 合并情况如下:1 ～ 10 、11～ 20、21 ～
30 、31～ 40、41 ～ 50 、51 ～ 60、61 ～ 70 、71 ～ 80、81 ～ 90 、91 ～
100、101 ～ 110。其中 2、3 、4 、6 、7 、9 、10组各占 2 个梯度 , 1 、
5、8、11 各为一个梯度内的洗脱液合并 , 每组样品中每瓶取
50mL 洗脱液 ,合并浓缩到 2mL 左右 , 用青霉素小瓶密封
放入冰箱冷藏备用。
4.薄层检测
采用硅胶 G 板 , 展开剂为 Gr , 将合并浓缩的样品和
20%乙醇样品进行点样 ,每个样品点样量为4ul , 上行展开 ,
展开后在紫外灯下观察其荧光。
5.三月泡活性成分的抑菌实验
采用牛肉膏蛋白胨培养基 , 其成分是蛋白胨 10g , NaCl
5g ,琼脂 20g , 牛肉膏 5g , 蒸馏水 1000mL , 配制培养基后
将培养基的 pH 调至 7.0 ～ 7.2。
方法是:
(1)提取液和液液萃取样品的供试样品的准备
每种样品称取 0.1g溶于 1m L无菌水中倒入事先灭菌
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装好滤纸片的小青霉素瓶中 , 水浴 65℃加热 15min 左右 ,
促使样品充分溶解 , 然后将青霉素小瓶放入烘箱中 , 保持
45℃(12h 以上), 直至滤纸片烘干为止。 对照为 4ug/m L
的庆大霉素。
(2)柱层析样品分段活性检测供试样品的准备
取出冷藏浓缩好的合并样 ,每个样取 1mL 放入青霉素
小瓶 ,每个小瓶中放入灭好菌的滤纸片 12 片 ,另取每种合
并相的回收液各 1m L , 各放入滤纸片 12 片 ,并与合并样统
一对应编号 ,配好庆大霉素(4ug/m L)对照 , 将各样品及对
照样放入烘箱内 45℃烘干备用。
(3)21 ～ 30 号和 31 ～ 40 号样品洗脱液中每两瓶的抑
菌效果供试样品的准备
将 21 ～ 30 号和 31 ～ 40 号洗脱液每瓶取 10mL , 浓缩干
燥后配成 0.1g/m L溶液 , 每种溶液中放入 9 片无菌干燥滤
纸片 , 4ug/m L的庆大为对照 , 将各样品及对照样放入烘箱
内 45℃烘干备用。
将保藏的菌种在平板培养基中活化 12h 后 , 在超净工
作台上把这 3 种细菌分别配成 2.0 ×108CFU/m L 的菌落
数 ,放入不同的 3 只试管 , 每个培养皿中加入 0.2mL 菌悬
液 ,用玻璃弯管涂抹使之分布均匀 , 把浸有样品的滤纸片放
入编号的培养皿中 ,每个样品做三组平行 , 在培养箱里培养
12h , 温度 37℃。
二 、结果与分析
(一)三月泡提取物和液液萃取样品的抑菌效果
由表 1可知:原液和 B层样的抑菌效果最好,对 3 种供试
菌种都有很强的抑菌效果。其中原液对金黄色葡萄球菌的抑
菌效果最好,其次为痢疾志贺氏菌和大肠杆菌 ,抑菌圈直径分
别为 2.5cm、2.43cm 、2.13cm , 与 4ug/ mL的庆大霉素相比 ,其
最大的抑菌圈要大 0.7cm;B层样对金黄色葡萄球菌的抑菌效
果最好,其次为痢疾志贺氏菌,最弱的为大肠杆菌,抑菌圈分别
为:2.3cm 、2.25cm 、1.43cm。原液对大肠杆菌的抑菌圈为2.13
cm ,比 B层样抑菌圈大了 0.7cm ,对痢疾志贺氏菌的抑菌圈为
2.43cm ,与抑菌效果相对较弱的B 层样抑菌圈相比较大了0.18
cm ,其与对照庆大霉素的抑菌效果无很大的差别;B 层样的抑
菌效果较强,只有对大肠杆菌的抑菌效果相对很弱 ,抑菌圈只
有1.43cm ,在所有供试样品的抑菌效果中是最弱的一个;C层
样的抑菌效果也较强 ,其对三种菌种的抑菌效果较 B 基本相
同,其对金黄色葡萄球菌和痢疾志贺氏菌的抑菌圈分别比 B
层样小了 0.14cm 和 0.12cm ,只有对大肠杆菌的抑菌效果较 B
层样大了 0.14cm;而 C沉淀物的抑菌效果与C 的差别不大,其
对金黄色葡萄球菌、痢疾志贺氏菌和大肠杆菌的抑菌圈分别
为2.16cm、2.13cm 和 1.57cm;原液沉淀物和石油醚层样则无
明显的抑菌效果。
表 1 三月泡提取液和液液萃取样品的抑菌效果
供试样品 供试菌种金黄色葡萄球菌 大肠杆菌 痢疾志贺氏菌
原液
原液沉淀物
石油醚层
B层样
2.50
—
—
2.30
2.13
—
—
1.43
2.43
—
—
2.25
B粘状样 1.77 1.6 1.73
B粒状样 2.00 1.77 1.67
C层样 2.16 1.57 2.13
C沉淀物 2.0 1.57 2.1
水层 2.13 1.47 1.9
庆大对照 2.33 2.33 2.13
﹡抑菌圈直径单位:cm ,为三组平行实验的平均值;“—”为无抑菌效果
(二)柱层析分段样品的抑菌效果
由表 2 可知:11 个合并相中抑菌效果最好的是 21 ～ 30
号和 31 ～ 40 号 ,其次是 61～ 70号和 71-80号。其中 21～
30 号对金黄色葡萄球菌 、大肠杆菌 、痢疾志贺氏菌的抑菌
圈大小分别为 1.93cm 、1.60cm 、1.97cm;其最大抑菌圈比
庆大对照最大抑菌圈还要大 0.24cm;31 ～ 40 号对金黄色
葡萄球菌 、大肠杆菌 、痢疾志贺氏菌的抑菌圈大小分别为
1.67cm、1.33cm 、1.53cm ,其最大抑菌圈比庆大对照最小抑
菌圈小 0.03cm;61～ 70 号 、71 ～ 80 的抑菌效果较好 , 比 21
～ 30 号 、31～ 40 号的抑菌效果稍弱些 , 其最大抑菌圈都为
1.4cm;41～ 50 号 、51 ～ 60 号 、91 ～ 100 号 、101 ～ 110 号的
抑菌效果较弱;1 ～ 10 号无抑菌作用;11 ～ 20 号无明显的抑
菌效果;81～ 90 号则只对金黄色葡萄球菌有轻微抑菌效
果 ,抑菌圈大小为 0.87cm ,其样品的回收液对照样均无抑
菌效果 ,由此可知其抑菌作用均为柱层析分离样品的作用。
柱层分离样品 21 ～ 30 号和 31 ～ 40 号 , 61 ～ 70 号和 71 ～
80 号可能是两种具有抑菌作用的不同物质。
表 2 柱层析分段样品的抑菌效果
供试样品 供试菌种金黄色葡萄球菌 大肠杆菌 痢疾志贺氏菌
1～ 10号合并相 — — —
1～ 10号对照 — — —
11～ 20号合并相 0.80 — 0.77
11～ 20号对照 — — —
21～ 30号合并相 1.93 1.60 1.97
21～ 30号对照 — — —
31～ 40号合并相 1.67 1.33 1.53
31～ 40号对照 — — —
41～ 50号合并相 1.13 1.00 1.13
41～ 50号对照 — — —
51～ 60号合并相 1.13 0.90 1.10
51～ 60号对照 — — —
61～ 70号合并相 1.40 1.10 1.31
61～ 70号对照 — — —
71～ 80号合并相 1.13 1.13 1.40
71～ 80号对照 — — —
81～ 90号合并相 0.87 — —
81～ 90号对照 — — —
91～ 100号合并相 1.23 1.07 1.17
91～ 100号对照 — — —
101～ 110号合并相 1.07 1.10 0.97
101～ 110号对照 — — —
庆大对照 1.73 1.70 1.70
﹡抑菌圈直径单位:cm ,为三组平行实验的平均值;“ —”为无抑菌
效果
(三)柱层析分离样品细分样品的抑菌效果
由表 3 可知:10 个合并相中抑菌效果最好的是 23 ～ 24
号合并相 ,其对 3种供试菌种都有较强的抑菌效果 ,对大肠
杆菌的最大抑菌圈达 1.68cm ,比其他合并相大 0.63cm ,与
庆大对照相对比较也只小 0.12cm;而在其他 9 个合并相
中 ,对 3种供试菌种都有抑菌效果的只有 25 ～ 26 号和 39
～ 40 号合并相 , 且抑菌圈都比较小 , 最大抑菌圈只有1.05
cm ,最小为 0.80cm;27～ 28 号合并相只对金黄色葡萄球菌
和大肠杆菌有抑菌效果 , 分别为1.00cm 和 1.05cm;31～ 32
号 、35～ 36号和 37 ～ 38 号合并相则只对大肠杆菌和痢疾
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志贺氏菌有抑菌效果 , 抑菌效果也较弱 , 最大抑菌圈只有
1.10cm , 最小为 0.80cm;29 ～ 30 号和 33 ～ 34 号合并相则
无明显的抑菌效果。
表 3 柱层析分离样品的抑菌效果
供试样品 供试菌种金黄色葡萄球菌 大肠杆菌 痢疾志贺氏菌
21～ 22号合并相 — — —
23～ 24号合并相 1.50 1.68 1.45
25～ 26号合并相 1.05 1.05 0.80
27～ 28号合并相 1.00 1.05 —
29～ 30号合并相 — — —
31～ 32号合并相 — 0.85 1.10
33～ 34号合并相 — — —
35～ 36号合并相 — 0.90 0.90
37～ 38号合并相 — 0.85 0.95
39～ 40号合并相 1.00 0.80 1.00
庆大对照 1.95 1.80 1.90
﹡抑菌圈直径单位:cm ,为三组平行实验的平均值;“ —”为无抑菌
效果
(四)薄层检测结果
对供试样品再进行薄层分离 , 根据样品在薄板上的荧
光斑点 ,其蓝色荧光最亮的荧光点为 21 ～ 30 号和 31 ～ 40
号合并相;而在稍后进行的与柱层析分离样品的细分实验
活性抑菌效果的对照实验中 ,其蓝色荧光最亮是 23 ～ 24 号
和 25 ～ 26 号合并相 , 与抑菌结果比较吻合。
三 、结果与讨论
使用不同菌种检验三月泡不同浸提样品的抑菌活性大
小 ,其实验结果为:原液和 B 层样抑菌效果较强 , C 层样 、C
沉淀物和水层抑菌效果较弱 , 原液沉淀物和石油醚层样则
无明显抑菌效果;柱层析洗脱液的抑菌试验结果明显 ,抑菌
效果最好的是 21～ 30 和 31 ～ 40 号合并相 , 其最大抑菌圈
达 1.97cm;21～ 30号和 31 ～ 40 号合并相中 , 其抑菌效果
最好的是 23～ 24号合并相 , 这为分离抑菌有效成分的单体
打下了很好的基础 ,也为综合开发利用三月泡资源提供了
依据。
薄层对照实验表明 , 1 ～ 110 号洗脱液的 11 个合并相
中 ,在 Rf=0.60 时 , 21 ～ 30 号和 31 ～ 40 号两个样品的蓝
色荧光最强 ,与柱层析分离样品的抑菌效果相符;在柱层析
分离样品的细分样品中 , 23 ～ 24 号和 25 ～ 26 号样品的蓝
色荧光最强 ,亦与实验结果相符。由此猜测其活性最好的
是 23 ～ 24 号和 25～ 26 号样品 , 但最亮最大蓝色荧光斑点
是否对应具有抑菌作用的物质 , 还需对薄板上的样品进行
进一步的活性研究。
[ 参 考 文 献]
[ 1] 江苏新医学院.中药大辞典[ M] .上海:上海人民出版社 , 1977.
[ 2] 陈建华 ,陈明皋 ,李忠海等.湘西树莓资源研究[ J] .湖南林业科
技 , 1994 , 21(1):22～ 25.
[ 3] 王世清 ,潘文刚 ,张志勇.苗族药三月泡的品种鉴定和成分研究
[ J] .中国民族民间医药杂志 , 2002 , (54):47～ 62.
[ 4] 宋平顺 ,卫玉玲 ,王勤忠.悬钩子属若干药用植物的本草学研究
[ J] .中药材 , 1997 , 20(2):100～ 104.
[ 责任编辑:丛爱玲]
(上接第 14 页)话 ,那么她对长安婚事的破坏则是出于本能
的嫉妒 ,一种补偿心理。那个时代男人和女人有着质的不
同 ,男人可以只有欲 , 而女人在欲之外更需要情感一类审美
性的东西。金钱婚姻在剥夺了七巧性欲的同时 , 又使她置
身于情感的荒漠 ,无爱的女人往往疯狂 , 弱者独自咀嚼生命
的苦涩 ,强者则将痛苦转嫁到他人身上。“爱情在一个人身
上不得满足 , 便需要三四个人的幸福与生命来抵偿”(傅
雷)。七巧情感的痛苦导致了其对女儿的摧残 , 曹七巧成为
了“父权社会的合作者 、共谋者” 。长安近三十几时 , 才经堂
妹介绍 , 认识了童世舫 ,不久两人订了婚 ,这是长安人生中
最愉快的时光。长安洋溢着幸福的表情刺痛了七巧内心的
伤痕。出于本能的嫉妒 ,为了满足自己的施虐欲 , 她百般挖
苦 、讥讽 ,骂长安“腥的臭的往家里拉” ,找“野男人” , 阻止破
坏婚姻 ,污蔑羞辱女儿“肚子里有了搁不住的东西” , 更恶毒
的是她虚设圈套 ,扼杀了长安“生命里顶完美的一段”:
长白说:“妹妹呢? ……。”七巧道:“她再抽两筒就下来
了。”世舫吃了一惊。睁眼望着她。 ……隔了些时 , 再提起
长安的时候 ,她还是轻描淡写地把那几句话重复了一遍。
她那平扁而尖刻的喉咙四面割着人像剃刀片。
就这样 ,曹七巧对和长安两情相悦的童世舫 ,编造了一
个阴毒的谎言:“他的幽娴贞静的中国闺秀是抽鸦片的!”从
而连唬带骗地像当年别人毁灭她一样 , 亲手毁灭了女儿的
青春和幸福。长安是七巧的悲剧命运在女性意识深处绵长
的历史延续的象征 ,她不光是男性世界的附庸 ,更是曹七巧
补偿心理下 ,诡计摆弄的玩物和她不幸命运的殉葬品。
弗洛伊德曾打过这样一个比喻:本我是匹马 ,自我是骑
手。曹七巧正是一匹失控的马 , 她的生活愿望被压抑后的
极端病态心理所带来的变态行动是一种没有分寸的疯狂。
她亲手扼杀了子女的幸福 ,在极端的自我贬损中 ,贪婪地从
中汲取沽沽涌流出的快感。
如果说作为女性的曹七巧在她的灵魂深处尚有一点美
好回忆的话 ,这种回忆也是最无奈的叹息 ,曹七巧进入男性
社会前后两种不同的场景之间是一幅苍凉可怖的人生图
景 ,充满了作家对宿命式的女性命运的追问和悲悯。曹七
巧的报复欲仅仅是一个屈服的姿态 , 无可挽回的癫狂是徒
有其表的挣扎。 对男性社会的大胆叛逆和极端的自我保
护 、情欲的压抑 , 最终导致了曹七巧人性的沦丧 ,她的灵与
肉带上了金钱的枷锁被推上了绞刑架。曹七巧的悲剧是
“洋场社会”吉凶莫测的黄金噩梦中的一出 , 黄金的光圈笼
罩着两性关系和婚姻形式 ,瓦解着温柔谦恭的东方伦理气
氛 ,扭曲了蠢蠢欲动的人的本能情欲。儒家道貌岸然的义
利之辩 ,化作了价值颠倒的人生把戏。张爱玲努力探究社
会环境 、文化情境 、人际关系对丑恶人性的诱发和催化作
用。曹七巧人性的扭曲说明建立在男性话语系统下的对男
性的挑战和反叛是徒劳的 ,它最终只能注定女性在现实中
永远缺席和被囚禁的命运。曹七巧的悲剧也从一个侧面 ,
深深地揭示了冷酷的封建性和腐朽的资本主义性交撞互渗
所造成的人性泯灭的巨大阴影 , 以及人们生存状态的 荒诞
混乱。
[ 参 考 文 献]
[ 1] [ 2] 金宏达 ,于青.张爱玲文集(第四卷)[ M] .合肥:安徽文艺出
版社 , 1992:40 ,173.
[ 3] 康正果.女权主义与文学[ M ] .北京:中国社会科学出版社 ,
1994:68 .
[ 4] 禹燕.女性人类学[ M ] .北京:东方出版社 , 1988:84 .
[ 5] 宋家宏.一级一级走进没有光的所在 [ J] .中国现代文学研究
丛刊 , 1988 ,(3).
[ 6] [ 保] 基里尔·瓦西列夫.情爱论[ M] .赵永穆 ,范国恩 ,陈行慧
译.北京:生活·读书·新知三联书店 , 1984:28 .
[ 责任编辑:朱君安]
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