全 文 ：收稿日期:2009-04-16
基金项目:江苏省高技术研究项目(BG2006322);镇江市农业项目(NY200645)
作者简介:许梦云(1982-),女 ,江苏连运港人 , 在读硕士研究生 ,研究方向:农业生物环境与能源工程。
通讯作者:吴沿友(1966-),男 ,安徽池州人 , 教授 ,博士 , 博士生导师 ,主要从事植物生物技术育种研究 。
E-mail:yanyouwu@ujs.edu.cn
道地药材茅苍术的 ISSR分析
许梦云1 ,吴沿友1 , 2﹡,赵玉国1 ,杨晓勇1
(1.现代农业装备与技术省部共建教育部重点实验室/江苏省重点实验室 , 江苏大学 农业工程研究院 ,
江苏 镇江 212013;2.中国科学院 地球化学研究所 环境地球化学国家重点实验室 , 贵州 贵阳 550002)
摘要:道地中药材茅苍术具有广泛的形态多样性 。为了识别其遗传多样性 ,应用 ISS R分子标记技
术对 16个茅苍术基因组和 4个北苍术基因组进行了多态性分析 。结果发现 ,茅苍术 ISSR多态位
点百分率为 87.67%,北苍术 ISSR多态位点百分率为 53.33%,证明茅苍术比北苍术有更高的遗
传多样性。采用 SPSS13.0软件的 Within-g roup linkage 法对 20 个样品进行聚类分析。结果表
明 ,茅苍术具有明显的遗传分化 ,且与北苍术有很近的亲缘关系 。
关键词:茅苍术;ISS R;遗传多样性
中图分类号:S567.21+1　　文献标识码:A 　　文章编号:1004-3268(2009)07-0090-04
An ISSR Analy sis on Famous Region-drug Atracty lodes lancea
XU M eng-yun1 ,WU Yan-you1 , 2＊ ,ZHAO Yu-guo1 , YANG Xiao-yong1
(1.Key Laboratory of Modern Agricultural Equipment and Technology , Ministry of Education & Jiang su P rovince,
Institute of Agricultural Engineering , Jiangsu University , Zhenjiang 212013 , China;2.State Key Laboratory of
Environmental Geochemistry , Institute of Geochemistry , Chinese Academy of Sciences , Guiyang 550002 , China)
Abstract:Atracty lodes lancea , now in Chinese , is a very impo rtant famous region-drug.A s a w ild
species , Atracty lodes lancea is endemic to Jiang su province.ISS R analy sis w as conducted on 20
samples(16 samples o f A tracty l is lancea genome and 4 samples of Atracty l is chinensis genome)
to invest igate the genetic diversity.Fo r A tracty li s lancea , the po lymo rphic locus percentag e is
87.67%,while for A tracty l is chinensis ,53.33%;which indicated that the levels o f genetic diver-
sity existed in Atracty lodes lancea was higher than that in Atracty lodes chinensis.Othe rw ise , the
20 samples w ere perfo rmed cluster analysis using wi thin-g roup linkage method in SPSS 13.0 sof t-
ware.The analysis indicated that for Atracty lis lancea there is obvious gene tic differentiation , and
there is clo se af filiation between Atracty lodes lancea and A tracty lodes chinensis.
Key words:Atracty lodes lancea;ISSR;Genetic diversity
　　茅苍术 Atracty lodes lancea(简写 AL),也称之为
南苍术 ,为菊科植物。主要分布于江苏 、湖北和河南
等省份 ,江苏地区是茅苍术道地药材的产区。
从茅苍术植株形态可以看出 ,同一居群内分支的
有无 、叶片宽窄 、分裂程度以及叶柄有无是多种多样
的 ,难以做区分变种 、变型或者种的标准。由于茅苍
术主产区常年不规范采挖 ,野生资源逐年下降 ,而市
场需求却逐年升高 ,所以其优良品种的选育成为亟待
解决的问题。但由于其外观形态的多样性 ,品质参差
不齐 ,这些都为茅苍术的育种带来了很大困难。桑小
花等[ 1]研究发现:根据叶片的形状将茅苍术分成锯
齿叶型 、椭圆叶型 、长椭圆叶型以及尖叶型 4种类型;
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2009年第 7期
DOI :10.15933/j.cnki.1004-3268.2009.07.024
黄驰等[ 2] 对 4种类型栽培茅苍术种子的同工酶进行
分析 ,发现同种茅苍术的同工酶由于其生态型的不同
而有显著差异。郭兰萍等[ 3] 研究发现 ,苍术居群内的
总变异水平远远高于亚居群间和居群间变异。
ISSR(inter-simple sequence repeats)是一种新型
分子标记技术 ,用于检测SSR(simple sequence repeat)
间DNA序列差异。具有比 RAPD更高的可重复性
和稳定性[ 4] 。近年来 ,结合 PCR技术鉴别中药的研
究得到极大发展 ,并正在逐渐成为中药鉴定的一种新
方法[ 5 , 6] ,应用 ISSR分析技术对植物进行遗传多样性
研究已有较多报道[ 7 ～ 9] 。本研究利用 ISSR分析技术
对江苏省镇江农业科技示范园区内居群茅苍术的遗
传结构进行了研究 ,旨在揭示茅苍术群体的遗传结构
和遗传多样性水平 ,为有效保护茅苍术遗传资源提供
科学依据。
1　材料和方法
1.1　材料
供试品种茅苍术和北苍术 ,由江苏省镇江市农业
科技示范园区提供。取植株的幼嫩新鲜叶片为材料。
茅苍术取样分山顶 、半坡 、山底栽培区 3个范围进行 ,
每个地区根据茅苍术分布范围随机选取 5 ～ 8个不同
外观形态的样株(野生区间隔至少 10 m 以上)。北苍
术 Atracty lodes chinensis(简写 AC)共 4株 ,取自镇江
市农业科技示范园栽培区。每株采集的叶片迅速装
入封口袋放入冰盒保存。为保证重复取样的准确性 ,
对每株样的株高 、胸径进行测量和照相 ,并记录生存
环境和编号登记。
1.2　基因组 DNA提取与标定
总基因组 DNA 采用改进的 CTAB 高盐法提
取[ 10] 。DNA 大小及其完整性采用标准浓度的
λDNA/HandⅢ检测 ,采用岛津 Bio-spec-mini紫外分
光光度计测定各基因组 DNA的 A 260/ 280值 ,据此推知
各总 DNA的含量。
1.3　试验设计与 PCR扩增
参考甜槠 ISSR体系建立的研究报道[ 11] ,优化筛
选茅苍术的 ISSR-PCR体系。主要包括引物浓度 、
模板 DNA 的浓度 、dNTP 的浓度 、MgCl2 浓度 、Taq
酶的浓度等 5个 PCR关键因子的多水平的梯度筛
选 , 变性温度根据引物的 Tm 值变化 13℃[ 12] 。应用
含有 EB的1.2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物 ,以
100bp DNA LadderPlus(BBI)作为标准分子量标准对
照 ,用 TANON 紫外凝胶成像系统观察拍照。
1.4　数据整理与统计分析
ISSR是显性标记 ,同一引物扩增中电泳迁移率
一致的条带被认为具有同源性 ,按照相同迁移率位置
上有带(包括弱带)的记为“1” ,无带的记为“0”的方
法 ,记录 150 ～ 1500bp范围内的扩增条带 ,生成“0-
1”原始矩阵。
根据“0-1”原始矩阵 ,利用 SPSS13.0 软件的
Within-group linkage法对全部群体单株进行遗传系
统聚类分析。
2　结果与分析
2.1　总 DNA 质量及 ISSR-PCR体系的建立
通过检测和比对得知 ,茅苍术基因组 DNA 大小
约为 13kb。根据紫外分光光度计测得的 A 260/ 280和
A 260/230比值比较 , 改良的 CTAB 法提取的 DNA
A 260/280比值为1.66 ～ 1.90 ,A 260/230比值大于 1.6 ,表明
改良 CTAB 法所提取的 DNA 纯度较高 ,符合试验
要求。
根据 ISSR反应体系的正交设计直观分析 ,最优组
合是在 25μL 反应体系中含 Mg2+3mmo1/L , Taq 酶
1U ,模板 150ng ,dNTP 0.5mmol/ L ,引物 0.2μmol/ L。
2.2　茅苍术的 ISS R分子鉴别
从 100个引物中筛选出的 10个 ISSR引物(表
1),对 20 个基因组 DNA 进行 PCR扩增反应。结
果 10条引物扩增出的条带数目从 4 个至 10 个不
等 ,条带片段大小分布在 150 ～ 1500bp。10个 ISS R
引物扩增 16个茅苍术基因组 DNA 共产生了 73个
重复性好 、扩增谱带清晰的可统计的条带 ,其中具有
多态性的条带 64个 ,占 87.67%(表 2);4个北苍术
基因组 DNA 共产生了 60个重复性好 、扩增谱带清
晰的可统计的条带 ,其中具有多态性的条带 32个 ,
占 53.33%(表 2)。其中 , 引物 ISSR6 、ISSR7的扩
表 1　ISSR分析所用的引物编号及其序列
引物编号 引物序列(5′-3′) 引物编号 引物序列(5′- 3′)
ISSR1
AGAGAGAGAG
AGAGAGYC
ISSR6
GTGTGTGTGTG
TGTGTYA
ISSR2
AGAGAGAGAG
AGAGAGYT
ISSR7
AGAGAGAGAGA
GAGAGYC
ISSR3
GAGAGAGAGA
GAGAGAYA
ISSR8
ACACACACACA
CACACYT
ISSR4
GAGAGAGAGA
GAGAGAYC
ISSR9
AGAGTTGGTAC
GTCTTGAT
ISSR5
CTCTCTCTCTC
TCTCTRA
ISSR10
ACACACACACA
CACACCA
　注:R(A或 G), Y(C或 T)
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河南农业科学
表 2　茅苍术和北苍术扩增结果
引物编号 茅苍术扩增总位点数 多态性位点数 多态性(%)
北苍术
扩增总位点数 多态性位点数 多态性(%)
ISSR1 8 8 100.00 4 2 50.00
ISSR2 7 6 85.71 7 5 71.43
ISSR3 6 4 66.67 5 3 60.00
ISSR4 7 6 85.71 7 3 42.86
ISSR5 6 5 83.33 5 3 60.00
ISSR6 10 9 90.00 5 0 0.00
ISSR7 7 6 85.71 7 4 51.14
ISSR8 7 7 100.00 7 5 71.43
ISSR9 5 4 80.00 6 3 50.00
ISSR10 10 9 90.00 7 4 57.12
总计 73 64 87.67 60 32 53.33
增结果见图 1 、图 2。
从图 1可以看出 ,20株样品其共有带在 1100bp
左右 ,4株北苍术的电泳条带基本相同 ,而 16 株茅
苍术条带差异明显不同;从图 2可以看出 ,20株样
品其共有带在 250bp左右 , 4株北苍术的电泳条带
两两基本相同 ,而 16株茅苍术条带有明显差异 。
图 1　引物 ISSR6 扩增 20 个样品基因组 DNA的 ISSR电泳结果
图 2　引物 ISSR7 扩增 20 个样品基因组 DNA的 ISSR电泳结果
2.3　聚类分析及亲缘关系分析
利用 SPSS13.0 软件的 Within-g roup linkage
法对茅苍术进行系统聚类 ,聚类结果见图 3。
从图 3可以看出 ,茅苍术和北苍术品系个体间
的遗传距离表现出较大差异:4 株北苍术聚于一类 ,
编号为 A L13茅苍术样品聚类表现为与北苍术距离
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2009年第 7期
较近 ,其他 15株茅苍术聚于一类。
　图 3　茅苍术和北苍术 ISSR聚类结果
3　讨论
由试验结果计算多态性百分率得知 ,茅苍术的
多态性明显高于北苍术 。朱晓琴等[ 13] 通过对 4 个
居群的等位酶分析 ,发现苍术居群内遗传变异大于
居群间。本研究证明了茅苍术同一居群内遗传多样
性较高;同时 ,也验证了桑小花等[ 1]的研究以及黄驰
等[ 2]的研究 ,说明茅苍术不仅生理形态和同工酶表
现为多态性 ,其分子遗传特性也表现为多态性 。
ISSR分析得到茅苍术较高的多态性水平验证
了郭兰萍等[ 3] 的观点 ,说明茅苍术的变异水平亦较
高。由于茅苍术在长期适应环境的过程中 ,已经发
生遗传上的分化 ,茅苍术道地药材是遗传与环境交
互作用的产物。本课题所研究的茅苍术具有居群内
多样性较高 ,个体间遗传变异较大的特点 ,这一点与
郭兰萍等认为的茅山苍术具有居群多样性较低 ,居
群内个体间遗传变异较小的观点不一致 ,分析其原
因 ,可能是研究范围小 ,只局限于镇江农业科技示范
园的原因 ,虽然从表观上得到的结论是多样性水平
较高 ,且对比的北苍术样品只是采于栽培区 ,其本身
的多样性水平就被人为的降低了。
关于茅苍术和北苍术的相互关系的处理问题 ,意
见很不一致 。刘慎谔[ 14] 把北苍术定为种;石铸[ 15] 把
北苍术并入南苍术;傅舜谟等[ 16] 则把北苍术定为南
苍术的变种 。由聚类分析可以看出 ,编号为 AL13茅
苍术样品聚类表现为与北苍术距离较近 ,充分说明了
茅苍术和北苍术之间的亲缘关系很近 ,同源性大。可
认同石铸或者傅舜谟的观点 ,从而否定了刘慎谔的看
法。关于其两者亲缘关系的进一步验证 ,还应该选取
更多的样品并增加引物的数量来做进一步的探讨。
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河南农业科学