全 文 ：第 31 卷　第 4期
2009 年 7 月
北　京　林　业　大　学　学　报
JOURNAL OF BEIJING FORESTRY UNIVERSITY
Vol.31 , No.4
Jul., 2009
收稿日期:2008--06--30
http: www.bjfujournal.cn , http: journal.bjfu.edu.cn
基金项目:国家自然科学基金项目(30271083)、黑龙江省国际合作项目(WC05C01)。
第一作者:计红芳 ,博士。主要研究方向:食品生物技术。电话:0373--3040107　Email:jhf300@126.com　地址:453003河南省新乡市河南科
技学院食品学院。
责任作者:宋瑞清 ,教授 ,博士生导师。主要研究方向:菌物开发及利用。电话:0451--82190232　Email:songrq@public.hr.hl.cn　地址:
150040 东北林业大学林学院。
绒白乳菇发酵液提取物对杨树叶枯病菌
几种重要酶活性的影响
计红芳1　张令文1　宋瑞清2
(1 河南科技学院食品学院　2 东北林业大学林学院)
摘要:为进一步明确绒白乳菇发酵液提取物对杨树叶枯病菌生长的抑制机理 , 研究了该提取物对叶枯病菌糖酵解
途径中己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)与乳酸脱氢酶(LDH)及 TCA 循环中琥珀酸脱氢酶(SDH)与苹果酸脱氢酶
(MDH)活性的影响。结果表明:对照组菌体代谢旺盛 , 随处理时间的延长 , 5 种酶活性总体呈上升趋势;提取物处理
组菌体5 种酶活性呈显著的下降趋势 , 其中处理 24 h 的 SDH 活性与处理 48 h 的HK 、PK、MDH 活性均已降至为零 ,
而处理 48 h 的 LDH 活性仅为对照组的 14.09%。绒白乳菇发酵液提取物对 5 种酶的活性均具有较强的抑制作用 ,
严重干扰了叶枯病菌菌体糖酵解途径与 TCA 循环的顺利进行。
关键词:绒白乳菇;提取物;叶枯病菌;酶活性;抑制
中图分类号:S718.81　　文献标志码:A　　文章编号:1000--1522(2009)04--0051--04
JI Hong-fang1 ;ZHANG Ling-wen1;SONG Rui-qing2.Effects of Lactarius vellereus fermenting liquor
extraction on the activity of several important enzymes in mycelia of Alternaria alternata.Journal of
Beijing Forestry University (2009)31(4)51-54 [Ch , 13 ref.]
1 School of Food Science ,Henan Institute of Science and Technology ,Xinxiang City ,453003 ,P.R.China;
2 School of Forestry ,Northeast Forestry University ,Harbin ,150040 ,P.R.China.
To further explore the inhibition mechanism of Lactarius vellereus fermentation extraction on the mycelia
growth of Alternaria alternata , effects of extraction on the activity of hexokinase (HK),pyruvate kinase (PK)
and lactate dehydrogenase (LDH)in glycolysis were assayed , and on the activity of succinate dehydrogenase
(SDH)and malata dehydrogenase (MDH)in tricarboxylic acid cycle(TCA cycle)were studied.The results
showed that , in control group , mycelia of A.alternata grew well , and the activity of HK ,PK ,LDH ,SDH and
MDH generally increased over time.On the other hand , in the treated group , activity of these five enzymes in
mycelia decreased over time;the activity of SDH decreased to zero within for 24 hrs and those of HK ,PK ,MDH
decreased to zero within 48 hrs.The activity of LDH treated with fermentation extraction for 48 hrs was only
14.09%of that in control.These results indicate that the extraction could significantly inhibit the activity of
HK ,PK ,LDH ,MDH and SDH , and therefore severely disrupt the glycolysis and TCA cycle in mycelia of A.
alternata.
Key words　Lactarius vellereus;extraction;Alternaria alternata;enzyme activity;inhibition
　　由链格孢菌(Alternaria alternata)引起的杨树叶
枯病是东北地区苗圃近年来较为流行的主要林木病
害之一 。作为防治该病主要措施的化学药剂 ,已经
造成了严重的环境污染 ,所以开发高效 、低毒 、无公
害的微生物农药已迫在眉睫 。据报道 ,乳菇属中某
些真菌含有多种活性物质 ,在抑菌 、抗虫 、抗病毒等
方面显示出了巨大的开发潜力[ 1-5] 。迄今为止 ,未见
利用绒白乳菇(Lactarius vellereus)中的活性物质对杨
DOI :10.13332/j.1000-1522.2009.04.017
树叶枯病进行防治的报道 ,因而其对该病害的抑菌
机理还不是很清楚。纵观国内外学者对各种抑菌剂
抑菌作用的研究 ,总结出各种抑菌剂的作用机理主
要包括:①作用于细胞壁和细胞膜系统;②作用于遗
传物质或遗传微粒结构;③作用于细胞内的酶系统
或功能蛋白[ 6] 。笔者的前期研究表明 ,绒白乳菇发
酵液提取物对杨树叶枯病菌生长具有较强的抑制活
性 ,对叶枯病菌菌体的细胞壁及细胞膜系统均有较
强的破坏作用[ 7-8] 。为进一步明确该提取物对叶枯
病菌生长的抑制机理 ,本文在此基础上 ,研究了该提
取物对叶枯病菌糖酵解途径中己糖激酶(HK)、丙酮
酸激酶(PK)与乳酸脱氢酶(LDH)及 TCA循环中琥
珀酸脱氢酶(SDH)与苹果酸脱氢酶(MDH)活性的影
响 ,为该提取物在林业病害生物防治中的应用奠定
科学的理论基础 。
1　材料与方法
1.1　菌株及培养基
绒白乳菇与杨树叶枯病菌菌株均由东北林业大
学提供。
PDA培养基:马铃薯 200 g ,葡萄糖 20 g ,MgSO4
1.5 g ,NaH2PO4 3 g ,琼脂 20 g ,蒸馏水 1 000 mL , pH
为 6.0 。PD培养基:在 PDA 培养基的成分中去除
琼脂 。
1.2　绒白乳菇发酵液提取物制备
将绒白乳菇菌株接种到 PD 培养基中 , 25℃摇
床(转速为 120 r min)培养 15 d后 ,将菌体滤出后余
为发酵液。按 V(发酵液)∶V(正丁醇)=1∶3萃取 1
次后 ,正丁醇层用 R--201 型旋转蒸发器旋干 ,旋干
后的物质以 10%吐温-80水溶液定容至原发酵液体
积的 1 10 ,为发酵液提取物 。
1.3　粗酶液制备及酶活性测定
用直径0.5 cm无菌打孔器 ,切取 PDA培养基上
培养 7 d的叶枯病菌菌片 ,接种到装有 10 mL PD培
养基的培养皿中 ,在 25℃的培养箱中培养 3 d ,长成
直径约为 3 cm的菌片 。将直径约为 3 cm 的菌片 ,
用无菌水洗净 、无菌滤纸吸干水后 ,置于 6 mL 的发
酵液提取物中 ,分别浸泡处理 2 、4 、6 、8 、10 、12 、24 、
48 h;对照则采用 10%吐温-80水溶液处理 ,每处理
重复 5次。
将上述用提取物及 10%吐温-80水溶液分别处
理2 、4 、6 、8 、10 、12 、24 、48 h 的叶枯病菌菌片 2 g ,加
入适量 0.1 mol L pH7.0的磷酸缓冲液冰冻研磨 ,
8 000 r min离心 15 min后 ,取上清 ,定容至 2 mL ,4℃
保存备用 ,为 HK 、PK 、LDH 3种酶的粗酶液。测定
SDH活性时所需线粒体与测定MDH活性时所需粗
酶液的制备方法同文献[ 9] 。
5种酶活性测定严格按南京建成生物工程研究
所提供试剂盒的说明书进行操作 。HK活性单位定
义为:在 37℃、 pH7.6的条件下 ,每克菌丝体在本反
应体系中每分钟生成 1 mmol L NADPH 为一个酶活
单位。PK活性单位定义为:在 37℃、pH7.6 的条件
下 ,每克菌丝体每分钟将 1μmol的 PEP 转变成丙酮
酸为一个酶活单位 。LDH 活性单位定义为:每克菌
丝体 37℃与基质作用 15 min , 在反应体系中产生
1μmol丙酮酸为一个酶活单位。SDH活性单位定义
为:每克菌丝体每分钟使反应体系的吸光度降低
0.01为 1个比活性单位。MDH 活性单位定义为:每
克菌丝体每分钟使反应体系的吸光度增加 0.01为1
个比活性单位 。
1.4　数据处理
采用软件 SPSS11.5进行统计分析 ,处理间的差
异显著性分析采用 LSD检验法。
2　结果与分析
2.1　提取物对糖酵解途径中 HK 、PK与 LDH活性
的影响
HK是一种调节酶 ,具有调节糖酵解途径的作
用 ,催化葡萄糖形成葡萄糖--6-磷酸 。PK 是糖酵解
途径中的一个重要变构调节酶 ,催化磷酸烯醇式丙
酮酸转变为丙酮酸并产生 1个 ATP 分子 。对照组
HK与 PK活性随处理时间的延长持续上升 ,48 h时
达到最高值 ,分别为 2 h时的 1.36与 1.31倍;提取
物处理组 HK与 PK活性随处理时间的延长始终呈
下降趋势 ,2 h时的活性与对照组相比 ,差异均显著 ,
48 h时的活性已降至为零 ,与对照组相比 ,差异均达
到显著水平(见图 1)。
LDH 广泛存在于动物 、植物与微生物中 ,是糖
酵解中生物氧化的关键酶类 ,是所有生物均具有的
产能方式 ,在辅酶 Ⅰ(NAD+ 、NADH)存在下 , LDH 催
化乳酸脱氢形成丙酮酸或者使丙酮酸还原为乳酸。
对照组 LDH活性随处理时间的延长呈现持续上升
状态 ,但彼此间差异不显著;提取物处理组 LDH 活
性大体呈下降趋势 ,但在 8 h时略有小幅度上升 ,与
6 h时的活性相比 ,差异不显著;48 h时的活性仅为
对照组的 14.09%,下降显著(见图 1)。结果表明 ,
对照组菌体糖酵解代谢途径活跃 ,能够进行正常的
生命活动 ,而发酵液提取物对 HK 、PK 与 LDH 均有
显著的抑制作用 ,严重干扰了叶枯病菌糖酵解途径
的正常进行。
52 北　京　林　业　大　学　学　报 第 31卷　
图 1　提取物对HK、PK和 LDH 活性的影响
FIGURE 1　Effect s of extraction on the activity of HK , PK and LDH
注:不同字母表示处理间在 P<0.05水平上差异显著 ,下图同。
图 2　提取物对 SDH 与MDH 活性的影响
FIGURE 2　Effects of extraction on the activity of SDH and MDH
2.2　提取物对 TCA 循环中 SDH与 MDH活性的
影响
TCA循环是生物细胞中十分重要的有氧分解代
谢途径 ,它不仅供给生物体能量 ,而且还是糖 、脂 、蛋
白质三大物质转化的枢纽 。SDH 与MDH是 TCA循
环中两个重要的氧化还原酶 ,这两种酶是细胞生长
代谢和繁殖所必需的 ,它们能否正常进行催化反应 ,
直接影响到整个 TCA循环能否顺利运转。
对照组SDH 与MDH 活性均随处理时间的延长
持续上升 , 48 h 时均达到最高值 ,分别为 2 h 时的
2.83与 4.42倍 ,与其他处理时间的酶活性相比 ,差
异均显著;提取物处理组 SDH 与 MDH 活性均随处
理时间的延长持续下降 ,2 h 时的 SDH 活性与对照
组相比无显著变化 ,8 h时急剧下降 ,24 h时降至为
零;2 h时的MDH活性与对照组相比差异显著 , 8 h
时急剧下降 ,48 h时降至为零(见图 2)。结果表明 ,
提取物能够强烈抑制 SDH 与 MDH 的活性 ,导致两
种酶活性降低 ,不仅影响了 TCA循环的正常进行 ,
而且会引起能量物质 ATP 和还原力 NADH 亏缺 ,所
有的合成代谢受阻 ,活性的动态膜结构不能维持 ,代
谢趋向于水解方向进行 。
3　结论与讨论
近年研究表明 ,乳菇属真菌能够有效抑制某些
微生物的生长 。柯丽霞[ 10] 采用松乳菇(Lactarius
deliciosus)热水提取多糖工艺的各部分提取物进行抗
菌活性实验 ,结果表明 ,松乳菇的抗菌成分主要存在
于有机相中 ,对细菌 、真菌有较为明显的抑制作用 ,
水相对放线菌和部分真菌有抑制作用 。凌建亚
等[ 11] 研究表明 ,浓香乳菇(Lactarius camphoratus)中
含有有机酸类物质 ,有较强的抑杀酵母菌和真菌的
作用 。Krawczyk[ 1] 与 Basaran等[ 4] 对乳菇的抑菌活性
进行了研究 ,表明其提取物对某些G +与G -细菌有
明显抑制效果 ,而对酵母菌没有效果 。对乳菇属真
菌抑菌机理及其在林业病害防治中应用的相关报道
却始终未见 ,而本课组一直致力于应用毒蘑菇中的
活性物质来防治林业病害的研究工作[ 12-13] 。探明绒
白乳菇发酵液提取物对杨树叶枯病菌的抑菌机理 ,
对于该提取物在林业病害防治中的应用具有重要的
指导意义 。
本文研究了绒白乳菇发酵液提取物对杨树叶枯
病菌糖酵解途径中 HK 、PK与 LDH 及 TCA 循环中
SDH与MDH 活性的影响。结果(且综合文献[ 7-8]
的结果)表明:经发酵液提取物处理 48 h后的菌体 ,
此5种酶的活性受到了显著抑制 , 与此同时 ,菌体
53第 4期 计红芳等:绒白乳菇发酵液提取物对杨树叶枯病菌几种重要酶活性的影响
SOD 、CAT 、POD活性下降显著 ,MDA含量增加 ,膜脂
过氧化严重 ,电导率及呼吸强度最终均呈现下降的
变化趋势[ 7] ;通过显微观察发现 ,此时的菌体局部发
生溶壁现象 ,内含物外渗 ,细胞结构遭到了严重破
坏[ 8] 。由此可以推断 ,发酵液提取物对叶枯病菌生
长的抑制机理是十分复杂的 ,从叶枯病菌菌体受外
界胁迫后所发生的种种生理变化来看 ,发酵液提取
物虽然能够显著抑制 HK 、PK 、LDH、SDH 与MDH活
性 ,严重干扰了叶枯病菌糖酵解途径与 TCA循环的
正常进行 ,引起能量物质 ATP 与还原力的缺乏及
糖 、脂肪 、蛋白质合成代谢速率的下降 ,但这仅可能
是该提取物抑制杨树叶枯病菌生长的机理之一 ,是
否存在其他机理还有待于进一步研究揭示。
参 考 文 献
[ 1 ] KRAWCZYK E.Antiviral act ivity of N-benzoylphenylisoserinates of
Lactarius sesquiterpenoid alcohols in vitro [ J] .Planta Medica ,
2003 , 69(6):552-554.
[ 2 ] WLODZIMIERZ M D , GUMULKA M , PRZESMYCKA D , et al.
Sesquiterpenes of Lactarius origin , antifeedant structure-activity
relationships[ J] .Phytochemistry , 1994 , 38(5):1 161--1 168.
[ 3 ] WLODZIMIERZ M D , GUMULKA M , TRUSZEWSKA D , et al.
Monohydroxylactones of Lactarius vellereus [ J] .Phytochemistry ,
1995 , 41(4):1 093--1 096.
[ 4 ] BASARAN D , FADIME Y , FAHRETTIN G.Antimicrobial activity of
　　　　
some Lactarius species[ J] .Pharmaceutical Biology , 2002 , 40(4):
304--307.
[ 5 ] KOPCZACKI P , GUMULKA M , MASNYK M , et al.Synthesis and
ant ifeedant properties of N-benzoylphenylisoserinates of Lactarius
sesqui terpenoid alcohols[ J] .Phytochemistry , 2001, 58(5):775--
787.
[ 6 ] 宁正祥 ,高建华.食品防腐剂的抗菌机理及构效关系[ J] .广
州食品工业科技, 1997 , 13(3):1--4.
[ 7 ] 计红芳 ,宋瑞清 , 杨谦.绒白乳菇发酵液提取物对杨树叶枯
病菌保护酶活性、丙二醛含量及电导率的影响[ J] .北京林业
大学学报 ,2007 , 29(6):156-160.
[ 8] 计红芳 ,张令文 , 宋瑞清.绒白乳菇发酵液提取物对杨树叶
枯病菌抑菌机理的初步研究[ J] .北京林业大学学报 , 2008 , 30
(4):156--159.
[ 9] 徐明生 ,陈锦屏 ,上官新晨.鱼精蛋白对黑曲霉细胞内的琥珀
酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶的影响[ J] .食品科学 , 2005 , 26(4):
48--51.
[ 10] 柯丽霞.松乳菇的抗菌活性研究[ J] .安徽师范大学学报(自
然科学版),2002 , 25(1):63--64.
[ 11] 凌建亚 ,秦红敏,张长铠.浓香乳菇菌丝抗菌活性的研究[ J] .
食品科学 ,2000 , 21(4):40--42.
[ 12] 祁金玉 ,宋瑞清.毒蘑菇菌株及毒素粗提液对樟子松枯梢病
菌生长的影响[ J] .林业科技 , 2006 , 31(3):20--23.
[ 13] 宋瑞清 ,冀瑞卿.四种毒蘑菇菌株及其毒素对杨树烂皮病菌
生长的抑制作用[ J] .北京林业大学学报 ,2005 , 27(2):88--91.
(责任编辑　董晓燕)
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