全 文 ：160℃下烤制 15 min进行二次上色，即可达到最佳上
色效果。
本试验采用电烤炉进行烤制，在烤制过程产生的
热量低于油炸，不存在高温油炸过程中所产生的醛、
酮、酸，聚合物等有害物质，更加有益于人体健康。在
烤制上色过程中的温度和时间更容易控制，易于批量
化生产，使产品质量稳定。此工艺避免了在油炸上色
生产过程中需要不断更新食用油的弊端，还可以为企
业节约成本，提高利润。虽然烤制上色的感官略差于
油炸上色，但差别不大，而且避免了油炸上色的多种
缺点，因此，烤制上色可以替代油炸上色成为一种更
好的上色方法。
参考文献：
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74
收稿日期：2013-01-05
酶法提取山苍子精油研究
谢永芳，梁亦龙，王芳霞，熊文娟，徐亚，刘小赟
（重庆邮电大学生物信息学院，重庆 400005）
摘 要：以重组膨胀素和纤维素酶为材料，对山苍子进行破壁处理后于常压提取山苍子精油。检测山苍子精油提取
得率。结果表明，常规蒸馏山苍子，所得精油为 4.58，单位为 ms/ks；纤维素酶解破壁山苍子精油，为 12.35，纤维素酶加
膨胀素酶解破壁山苍子提取为 17.67，膨胀素酶加纤维素酶破壁的山苍子的精油含量最高，大约比纤维素酶解法高 1/
3。复合酶法提取山苍子精油效果最好。
关键词：山苍子；膨胀素；精油
Study on Enzymatic Extraction of Litsea Cubeba Pers Oil
XIE Yong-fang，LIANG Yi-long，WANG Fang-xia，XIONG Wen-juan，XU Ya，LIU Xiao-yun
（College of Bioinformatie，Chongqing University of Post and Telecommunication，Chongqing 400005，China）
Abstract：Based on the heterologous expressed expansin and the cellulase，we study on treating Litsesa cubeba
Pers. The broken cell wall can be made by cellulase and expansin. The production oil was elucidated. The result
showed that it was higher by using compound enzymes than by conventional distillation and cellulose enzyme to
break wall. The essential oil was 4.58 ms/ks by conventional distillation， Cellulose enzyme wall-breaking had
12.35 l oils， it was 17.67 by cellulase and expansin over 1/3 higher than cellulose enzymatic hydrolysis. The
best effect is by composite enzyme to get oil.
Key words：Litsesa cubeba pers；expansin；oil
基金项目：重庆市科委基金（cstc D2009-17）；重庆市教委基金（KJ130520）
作者简介：谢永芳（1971—），女（苗），副教授，博士，研究方向：生物工程。
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.14.016
食品研究与开发
Food Research And Development
2013年 7月
第 34卷第 14期
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2013年 7月
第 34卷第 14期工艺技术
57
山苍子，别名山鸡椒（Litsesa cubeba Pers），为樟科
木姜子属植物，是我国的特有香料植物，在中西部资
源十分丰富。由于其叶、果实含有大量挥发性油成分，
其主要成分是柠檬醛。具有较强的抗菌作用，可治疗
流行性感冒、平喘化痰、具有一定的抗过敏、抗血栓、抗
心律失常、抗微生物及阴道滴虫、抗植物害虫、降解黄
曲排毒素等作用。其独特的香味是合成香料无法比拟
的，而且无毒副作用，因此在医药、香料工业以及化妆
品上应用极为广泛。目前，关于从山苍子中提取精油
的方法研究报道有很多，如蒸馏法、溶剂提取法、压榨
法等[1-3]，但用酶解法提取精油的研究鲜有报道。该研
究以低浓度的 NaCl溶液作为盐析试剂，并协同生物
酶法作用对山苍子精油的提取工艺进行研究，旨在
探索出简便的提取工艺，为其资源的开发提供科学
的参考。
1 材料与试剂
1.1 材料
山苍子：采于重庆南山植物园。川棉 2802：重庆邮
电大学生物信息学院药用植物重点实验室保存。
1.2 试剂
巴氏毕赤酵母菌株（P.pastors GSll5）和表达载体
pPICZαA均为 Invitrogen的产品。质粒 pMD18-T、反转
录试剂盒、限制性内切酶、DNA 酶、dNTPs 均购自为
Takara公司产品。DNA片段回收试剂盒购自百泰克生
物工程公司；Trizol、葡萄糖、3，5-二硝基水杨酸等化学
试剂均为国产分析纯；纤维素酶由郑州龙和化工有限
公司提供。
1.3 培养基
YPAD培养基：1 %酵母粉，2 %蛋白胨，2 %葡萄
糖，0.01 %腺嘌呤；LB培养基。
2 方法
2.1 棉花膨胀素（Ghexp）的获得[4]
2.1.1 引物设计与合成
根据棉花膨胀素基因序列（NCBI No．AF512542），
利用 Primer Premier 5.0软件设计基因特异性引物，引
物由上海生物工程技术服务有限公司合成。
上游引物：TATTCAACACATCAGCAAGCTT 下游
引物：ACCCAATGCAGTAAAAGGGCCC
2.1.2 Ghexp克隆
棉种子萌发至 2 cm~3 cm，提取总 RNA。以总
RNA为模板，反转录合成 cDNA第一链。具体反应体系
和反应条件参照 TaKaRa公司的 RNA PCR试剂盒的使
用说明[5]。以 cDNA单链为模板，反应条件：95℃，5 min，
1次循环；（92 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min）30 次循
环，最后 72 ℃延伸 10 min。经质量浓度 1 %琼脂糖电
泳后，回收目的片段并连接 pMD18-T 载体，转化
E.coli DH5α，提取质粒，限制性内切酶酶切鉴定正确
后送交上海生物工程技术服务有限公司测序。
2.1.3 Ghexp的表达及酶活性检测
不含信号肽编码序列的 Ghexp基因经双酶切后
与采用同样酶切的表达载体 pPICZαA连接，转化 E.
coli DH5α，提取质粒，经线性化后，根据毕赤酵母表达
说明转化 GS115菌株[6]。提取转化子基因组 DNA进行
PCR检测。用 SDS-PAGE分析重组毕赤酵母培养液。
利用膨胀素破坏滤纸结晶结构，使滤纸屑脱落的能力
测定其活性。按照文献[7]的方法测定混合液的滤纸酶
活性。
2.2 膨胀素、纤维素复合酶对山苍子的破壁处理
先称取 100 g山苍子果实，加入 500 mL含表达膨
胀素的发酵液，放入组织匀浆器中匀浆。并移入锥形
瓶中，向锥形瓶中 2.5 g纤维素酶，6 gNaCl，将锥形瓶
于 42 ℃（恒温摇床中充分振荡。反应时间为 24 h，反应
完毕后，取混悬液镜检。同时用不加膨胀素，不加纤维
素酶的做为对照。
2.3 精油提取
充分搅拌后冷藏静置（如果表面己有油层，可先
取出，即得部分粗精油），利用高速离心机（3 000 r/min
以上）分离油水混合液，得到粗精油；将粗精油进行精
制（分子蒸馏），得到优质精油。常规蒸馏山苍子精油
粉，记为 s1；纤维素酶解破壁山苍子精油，记为 s2；纤
维素加膨胀素酶解破壁山苍子提取记为 s3。提取出的
挥发油用无水硫酸钠除去水分，密封置于-20 ℃冷藏。
3次重复。精油提取率（ms/ks）=得油量／称取量。
3 结果与分析
3.1 Ghexp基因序列克隆
获得 Ghexp基因序列，大小为 760 bp的基因序
列，验证序列准确性，经比对与 No.AF512542 的基因
99 %的同源性。结果见图 1。
3.2 Ghexp的表达
Ghexp基因经酶切、连接、转化后，转化子经双酶
切鉴定。经电转化毕赤酵母，提取转化重组子 DNA进
行 PCR鉴定，以表达载体阳性对照，筛选阳性重组
子。以阳性菌株 DNA为模板，分别以合成的特异性
引物进行 PCR 扩增，扩展长度与理论一致，说明
Ghexp基因已经整合于毕赤酵母 GS115的基因组中。
谢永芳，等：酶法提取山苍子精油研究 工艺技术
58
图 1 PCR扩增结果
Fig.1 Amplification results of PCR
M为 DNA Marker；1为 Ghexp PCR产物
200
500
750
1 000
2 000
bp1 M
Ghexp基因表达基因产物能够有效提高纤维素酶的滤
纸酶活（30.21 %）。滤纸崩解实验表明，经 Ghexp基因
表达的处理后的滤纸比 GS115培养物上清液处理后
的薄，透光性好，纤维较松软，边缘崩解明显。
3.3 不同方式处理山苍子精油得率的比较
通过不同方式处理山苍子，常规蒸馏山苍子，所
得精油记为 s1；纤维素酶解破壁山苍子精油，记为 s2；
纤维素酶加膨胀素酶解破壁山苍子提取记为 s3。结果
如图 2 显示，s1为 4.58 ms/ks，s2 为 12.35 ms/ks，s3 为
17.67 ms/ks。
从图 2结果可见，膨胀素酶加纤维素酶破壁的山
苍子的精油含量最高，大约比纤维素酶解法高 1/3。
4 讨论
膨胀素（expansin）对细胞壁的松弛作用是在细胞
壁中的纤维素微纤丝和基质多糖交叉处，以一种非水
解方式作用于微纤丝表面，使多聚体网络间的非共价
键（氢键）可逆断裂，从而聚合物可发生滑动，引起细胞
壁的伸展，膨胀素的作用在于打断纤维素微纤丝与半
纤维素之间的氢键，但不破坏营养物质。膨胀素与壁
水解酶相互配合，能促进细胞壁膨胀，从而达到细胞
的破壁但却不损失营养成分[10-13]。本实验引入基因工
程手段，成功地构建了棉花 Ghexp的表达载体，利用
棉花膨胀素发酵液与纤维素酶共同作用能有效提高
精油的得率，其精油的提取较机械破壁法、单独使用
纤维素酶更高，大约比纤维素酶解法高 1/3，为 17.67。
用此法可节约成本，相对经济有效，发酵液中添加的
甲醇，可以通过离心弃去，在大规模生产中，精油在蒸
馏过程中甲醇等有害物质可以被去除干净，不具危害
性。因此，使用基因工程产物膨胀素可成为值得探索的
一种提取精油的新方法，本研究表明复合酶法提取精
油比单纯的纤维素酶法提取、蒸馏法提取要效率高。
参考文献：
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收稿日期：2012-10-09
谢永芳，等：酶法提取山苍子精油研究
图 2 不同方式提取精油的比较图
Fig.2 Oil from Litsesa cubeba by several shell-broken power
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
精
油
含
量
/（
m
s/k
s）
s1 s2 s3
工艺技术
59