全 文 ：肿瘤药学2012年 10月第2卷第5期　Anti-tumor Pharmacy, October 2012, Vol. 2, No. 5 - 347 -
★基金项目：湖南省医药卫生科研计划项目资助（B2012-098）；湖南省科技厅科技计划项目资助（2012SK3249）。
作者简介：王小莉，女，讲师，研究方向：呼吸系统肿瘤，E-mail: wangxiaolif@163.com。
*通讯作者：周辉，男，博士，副主任医师，主要研究方向：肿瘤内科临床治疗与肿瘤机制研究，E-mail：zhouhui@hnszlyy.com。
●基础研究●
三叶青提取物对肺癌细胞株A549的影响★
王小莉1，曾　娟1，周　辉2*
（1湖南吉首大学医学院，湖南　吉首，416000；2中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院，湖南　长沙，410013）
摘要：目的　观察三叶青提取物对肺癌 A549 细胞的影响并探讨其作用机制。方法　体外培养 A549 细胞，用不
同浓度（10-1 g·L-1, 10-2 g·L-1, 10-3 g·L-1）的三叶青提取物处理，流式细胞术检测细胞凋亡率，western blot 法检测细胞中
caspase-3 的表达。结果　(1) 10-1 g·L-1、10-2g·L-1 三叶青提取物处理 A549 细胞后，细胞凋亡率明显高于对照组，差异有
统计学意义（P<0.05）。(2) 10-1 g·L-1、10-2 g·L-1、10-3 g·L-1 三叶青提取物处理后的 A549 细胞内，Caspase-3 蛋白的表达
水平均较对照组显著升高，并随着三叶青提取物作用浓度的增高而逐渐上升，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论　
三叶青提取物可促进 A549 细胞的凋亡，可能与其上调细胞内 Caspase-3 的表达有关。
关键词：三叶青提取物 ；肺癌细胞 ；Caspase-3
中图分类号：R285.5，R734.2　文献标识码：A　文章编号：2095-1264（2012）05-0347-04
doi ：10.3969/j.issn.2095-1264.2012.05.005
The Effect of Extract of Radix Tetrastigma Hemsleyani on Lung Cancer Cell Line A549
Wang Xiaoli1, Zeng Juan1, Zhou Hui2*
(1Medical College of Jishou University, Jishou, Hunan, 416000, China; 2The Tumor Hospital Affiliated to Xiangya
School of Medicine, Central South University, Changsha, Hunan, 410013, China)
Abstract: Objective To study the effect of extract of radix tetrastigma hemsleyani on lung cancer cell line A549 and its
mechanisms. Methods A549 cells were cultured in vitro and treated with different concentrations (10-1 g·L-1, 10-2 g·L-1, 10-3 g·L-1)
of extract of Radix Tetrastigma Hemsleyani. The apoptosis rate was detected by flow cytometry, and the expression of caspase-3
was detected by western blot. Results (1) Compared with the control group, the apoptosis rates of A549 cells treated by 10-1
g·L-1 or 10-2 g·L-1 extract of Radix Tetrastigma Hemsleyani both significantly increased (P<0.05). (2) Compared with the con-
trol group, the protein expression of caspase-3 in cells treated by 10-1 g·L-1, 10-2 g·L-1 or 10-3 g·L-1 extract of Radix Tetrastigma
Hemsleyani all increased markedly (P<0.05), and it was significantly raised with the increase of concentration of extract of Radix
Tetrastigma Hemsleyani (P<0.05). Conclusion The extract of Radix Tetrastigma Hemsleyani could promote the apoptosis of
A549 cells, which may be related to the increase of caspase-3 expression.
Key words: Extract of Radix Tetrastigma Hemsleyani; Lung cancer cell; Caspase-3
前言
　　三叶青为葡萄科崖爬藤属植物，学名为三叶崖
爬藤，在湖南湘西地区分布较广泛，具有清热解毒、
祛风化痰、活血止痛的功效，在民间用于治疗高热
惊厥、肺炎、肝炎等症［1］，具有很好的疗效。三叶青
的主要成分属于黄酮类化合物，而黄酮类化合物具
有抗肿瘤的生物活性。因此，本研究采用不同浓度
的三叶青提取物作用于肺癌A549细胞，通过检测
细胞的凋亡率及 caspase-3的表达，探讨三叶青对
肺癌细胞株A549凋亡的作用及机制，以期为三叶
青的开发和利用提供一定的实验依据。
1　材料与方法
1.1　实验材料　肺癌A549细胞株由湖南艾杰生
物技术有限公司提供；Caspase-3抗体（Auragene
B0835）由湖南艾杰生物技术有限公司提供；称取
三叶青粉末 2 kg，采用 5％氢氧化钠-稀乙醇浸泡
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5 h，连续浸提 3次。浸提液加入稀盐酸酸化，得沉
淀物为三叶青提取物 15.2 g，用于本次实验。取少
许提取物经初步化学分析证实含有黄酮类物质。
1.2　实验分组　将处于对数生长期的A549细胞接
种至 6孔细胞培养板，接种密度为 1×105个 /mL，
每孔加 2 mL 细胞悬液，置 37℃、5％ CO2、饱和湿
度的细胞培养箱培养 24 h，待细胞完全贴壁后加药
处理。实验分为四组：Ⅰ组（对照组）：仅加入正常培
养液；Ⅱ组：用含 10-1 g·L-1三叶青提取物的培养液
处理；Ⅲ组：用含 10-2 g·L-1三叶青提取物的培养液
处理；Ⅳ组：用含 10-3 g·L-1三叶青提取物的培养液
处理。每组设 3平行孔，继续在 37℃、5％ CO2、饱
和湿度的细胞培养箱培养 72 h后收集细胞。
1.3　流式细胞术检测细胞的凋亡率　将收集到的
细胞移入离心管内，加入 1 mL冰浴预冷的 70％乙
醇，轻轻吹打混匀，4℃固定细胞 12～24 h，此过程
应轻轻弹击离心管底部以适当分散细胞，避免细胞
成团。然后利用碘化丙啶染色液进行染色，完成染
色后 2 h内用流式细胞仪进行检测。
1.4　Western blot检测细胞内 caspase-3蛋白表达
水平　将收集到的细胞移入干净的EP管中，取蛋
白裂解液（7 M Urea, 2 M Thiourea, 60 mM DTT, 4％
CHAPS, 2％ pharmalyte 3-10, 1.4 mg·mL-1 PMSF）
加入管中，加入量比例为样品∶裂解液 =1∶2～4
(g·mL-1)。将裂解后样品置于 4℃，每隔 5 min 剧烈
震荡 1 min，重复 6次。再将样品 4℃ 12 000 rpm
离心 30 min。吸取上清细胞全蛋白溶液，采用
Bradford 法进行蛋白定量，将所有蛋白样品调至等
浓度，充分混合后加 loading buffer 后直接上样。将
蛋白样品在 15％的SDS-PAGE凝胶中电泳约 3 h，
然后转印至硝酸 PVDF 上。用 5％脱脂奶粉封闭
2 h 后，按Marker 标记的分子量剪裁转印膜，加入
caspase-3抗体（1∶1000），过夜。TTBS洗 4次后加入
辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶1 000）作用 10 min，
ECL法显色、X光胶片显影定影后分析处理。
1.5　统计学方法　所得数据以均数±标准差（x±s）
表示，采用SPSS 19.0统计软件进行分析，多组间均
数比较采用方差分析（F检验），两组之间的比较采
用SNK-q检验，以 P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　不同浓度的三叶青提取物溶液对 A549细胞
凋亡的影响　流式细胞术检测结果显示，10-1 g·L-1
三叶青提取物处理A549细胞后，其 S期细胞比例
较对照组明显降低（资料经正态检验和方差齐性检
验，符合方差分析要求，P<0.05）；而 10-2 g·L-1、10-3
g·L-1组S期细胞比例与对照组比较，差异无统计学
意义（P>0.05）（图 1）。10-1 g·L-1、10-2 g·L-1组细胞
的凋亡率均明显高于对照组（P<0.05），而 10-3 g·L-1
组细胞的凋亡率与对照组相比，差异无统计学意义
（P>0.05）。（图 2）
与对照组比较，*P<0.05
图1　不同浓度三叶青提取物处理的A549细胞S期细胞
比例的比较
Fig. 1　Comparison of the S-phase cell fraction of A549
cells treated by different concentrations of radix tetrastigme ex-
tract
与对照组比较，*P< 0.05　
图2　不同浓度三叶青提取物处理的A549细胞凋亡率的
比较
Fig. 2　Comparison of the apoptotic rate of A549 cells treat-
ed by different concentrations of radix tetrastigme extract
2.2　不同浓度的三叶青提取物溶液对 A549细胞
内 Caspase-3蛋白表达的影响　Western blot 检测
结果显示，经不同浓度的三叶青提取物处理后，
A549细胞内的Caspase-3蛋白表达水平与对照组
比较均显著升高，差异均具有统计学意义（P<0.05）
（图 3），且随着三叶青提取物作用浓度的增高，
Caspase-3蛋白表达水平逐渐上升，差异有统计学
意义（P<0.05）。
肿瘤药学2012年 10月第2卷第5期　Anti-tumor Pharmacy, October 2012, Vol. 2, No. 5 - 349 -

注：与对照组比较，*P<0.05
图3　不同浓度的三叶青提取物处理的A549细胞内Cas-
pase-3蛋白表达水平的比较
Fig. 3　Comparison of the expression of Caspase-3 in A549
cells treated by different concentrations of radix tetrastigme ex-
tract
3　讨论
　　近年来，我国肺癌的发病率呈逐年上升趋势，
死亡率也居高不下。目前肺癌的治疗方法包括外
科手术、化疗、放射治疗和中医药治疗、分子靶向治
疗等［2］，中医药治疗肺癌越来越被人们所重视，已
成为近年来的研究热点［3］。三叶青、黄芪等在民间
用于肿瘤的治疗已有较长的历史，但是机制未明。
刘爱平等［4］发现，黄芪具有抑制肺癌A549细胞增
殖的作用。本实验将不同浓度的三叶青提取物作
用于肺癌A549细胞，检测细胞凋亡率，结果显示：
10-1 g·L-1三叶青提取物处理后，A549细胞的 S期
细胞比例降低，而 10-2 g·L-1、10-3 g·L-1处理后的细
胞无明显变化，其原因有待于进一步探讨研究，可
能与药物浓度偏低有关。加 10-1 g·L-1、10-2 g·L-1三
叶青提取物处理后的A549细胞，凋亡比例明显增
加，但 10-3 g·L-1处理后其凋亡比例无明显变化，其
中经 10-1 g·L-1处理后的细胞凋亡率最高，提示三叶
青提取物能有效地抑制A549细胞生长，促进其凋
亡，此结果与汪珍等［5］以及丁钢强等［6］的研究结果
相一致，进一步证实了三叶青能够促进肿瘤细胞的
凋亡。
　　细胞增殖与凋亡平衡的失调与多种癌症的发
生、发展有着密切联系，多种基因在凋亡的调控中
起关键作用［7-10］。凋亡机制的核心成分是一类蛋白
水解酶，统称为 caspase 家族，caspase 家族是一种
半胱胺酸蛋白酶家族，caspase家族的蛋白酶解级联
反应控制着细胞凋亡的发生与发展，被认为是细胞
凋亡的中心环节和执行者［11］。其中 caspase-3被认
为与真核细胞的凋亡密切相关，受到国内外学者的
广泛研究和关注［12-13］，激活的Caspase-3能使许多
与细胞结构、细胞周期及 DNA修复等有关的蛋白
或激酶失活，从而促进细胞凋亡［14］。贾明旺等［15］
在研究 Caspase-3与肺炎链球菌引起的肺泡上皮
细胞凋亡的关系时发现，Caspase-3在肺炎链球菌
诱导的肺泡上皮细胞凋亡过程中起重要作用。本
实验中研究观察了不同浓度三叶青提取物处理后
的A549细胞中Caspase-3蛋白的表达情况，结果
显示不同浓度三叶青提取物作用后，A549细胞内
Caspase-3蛋白的表达水平呈剂量依赖性升高，提
示三叶青提取物可诱导A549细胞凋亡，可能与其
调节Caspase-3蛋白的表达有关。
　　综上所述，三叶青提取物可促进肺癌细胞株
A549的凋亡，可能与其上调细胞内caspase-3蛋白
的表达有关。深入阐明三叶青提取物对肺癌细胞
增殖和凋亡的作用及机制，将为三叶青的开发及临
床应用提供理论依据，对肺癌的临床治疗也具有重
要的指导意义。
参考文献
［1］ 中国医学科学院药物研究所. 中药志: 第2册［M］. 北京:
人民卫生出版社, 1984, 219.
［2］ 周宏灏, 刘浩. 抗肿瘤药物的基因导向性个体化治疗［J］.
肿瘤药学, 2011, 1(1): 6-11.
［3］ 薛松, 钟美佐, 刘巍, 等. 黄芪扶正汤杭小鼠Lewis、肺癌
机制的实验研究［J］. 肿瘤药学, 2011, 1(1): 37-39.
［4］ 刘爱平, 曾峰. 黄芪多糖对人肺癌A549细胞增殖的
作用及其机制的实验研究［J］. 肿瘤药学, 2011, 1(6):
499-501.
［5］ 汪珍, 冯健, 王晓华, 等. 三叶青提取物对人结肠癌细
胞系RKO细胞凋亡的影响［J］. 浙江中医药大学学报,
2008, 32(3): 321-322, 324.
［6］ 丁钢强, 郑军献, 魏克民, 等. 三叶青提取物对肝癌细胞
HepG2及原代大鼠肝细胞的体外毒作用研究［J］. 浙江
预防医学, 2005, 17(9): 1-2, 5.
［7］ Wang C, Youle RJ. The role of mitochondria in apoptosis
［J］. Annual Review of Genetics, 2009, 43: 95-118.
肿瘤药学2012年 10月第2卷第5期　Anti-tumor Pharmacy, October 2012, Vol. 2, No. 5- 350 -
［8］ Kanduc D, Mittelman A, Serpico R, et al. Cell death:
Apoptosis versus necrosis (Review) ［J］. Int J Oncol, 2002,
21(1): 165-170.
［9］ Elmore S. Apoptosis: a review of programmed cell death ［J］.
Toxicol Pathol, 2007, 35(4): 495-516.
［10］ Portt L, Norman G, Clapp C, et al. Anti-apoptosis and
cellsurvival: a review ［J］. Biochem Biophys Acta, 2011,
1813(1): 238-259
［11］ 陈海英, 韩志武, 郭沈波, 等. 辐射诱导的凋亡及其信
号转导通路研究进展［J］. 齐鲁医学杂志, 2006, 21(4):
365-368.
［12］ 苑林宏, 张晓华, 张岭, 等. Bcl-2、Bak及caspase-9, 3在
维生素E琥珀酸酯诱导人胃癌细胞凋亡中的作用［J］. 首
都医科大学学报, 2009, 30(6): 812-816.
［13］ 陈坚, 梅琪, 徐迎春, 等. 复方苦参注射液对恶性肿瘤患
者伽玛刀放射治疗后T淋巴细胞亚群的影响［J］. 中西
医结合学报, 2006, 4(1): 78-79.
［14］ Zhu XF, Liu ZC, Xie BF, et al. Involvement of caspase-3
activation in squamocin-induced apoptosis in leukemia cell
line HL-60 ［J］. Life Sci, 2002, 70(11): 1259-1269.
［15］ 贾明旺, 黄文杰. Caspase-3与肺炎链球菌引起的肺泡
上皮细胞凋亡的关系［J］. 实用医学杂志, 2010, 26(8):
1291-1293.
　　　　收稿日期 ：2012-08-11　校稿 ：王娟　李征
fects of melatonin and vitamin E against renal ischemia-re-
perfusion injury in rats ［J］. Ren Fail, 2007, 29(5): 535-542.
［10］ Boogaard PJ, Lempers EL, Mulders GJ, et al. 4-methyl-
thiobenzoic acid reduces cisplatin nephrotoxicity in rats
without compromising anti-tumor activity ［J］. Biochem
Pharmacol, 1991, 41(12): 1997-2003.
［11］ Ravi R, Somini SM, Rybak LP. Mechanism of cisplatin
ototoxicity: antioxidant system ［J］. Pharmacol Toxicol,
1995, 76(6): 386-394.
［12］ Cetin R, Devrim E, Kiliçoğlu B, et al. Cisplatin impairs
antioxidant system and causes oxidation in rat kidney tis-
sues: possible protective roles of natural antioxidant foods ［J］.
J Appl Toxicol, 2006, 26(1): 42-46.
［13］ Ognjanović BI, Djordjević NZ, Matić MM, et al. Lipid
Peroxidative Damage on Cisplatin Exposure and Alterations
in Antioxidant Defense System in Rat Kidneys: A Pos-
sible Protective Effect of Selenium ［J］. Int J Mol Sci, 2012,
13(2): 1790-1803.
［14］ Abraham P. Vitamin C may be beneficial in the preven-
tion of paracetamol-induced renal damage ［J］. Clin Exp
Nephrol, 2005, 9(1): 24-30.
［15］ Naziroglu M, Karaoğlu A, Aksoy AO. Selenium and high
dose vitamin E administration protects cisplatin-induced
oxidative damage to renal, liver and lens tissues in rats ［J］.
Toxicology, 2004, 195(2-3): 221-230.
［16］ Fibach E, Rachmilewitz EA. The role of antioxidants and
iron chelators in the treatment of oxidative stress in thalas-
semia ［J］. Ann N Y Acad Sci, 2010, 1202: 10-16.
［17］ Ravo V, Calvanese MG, Di Franco R, et al. Prevention of
cutaneous damages induced by radiotherapy in breast can-
cer: an institutional experience ［J］. Tumori, 2011, 97(6):
732-736.
　　　　收稿日期 ：2012-08-03　校稿 ：王娟　李征
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