全 文 ：【中药研究】
三叶青的高效液相色谱指纹图谱研究
程 林 胡轶娟 浦锦宝 梁卫青 郑军献 魏克民
浙江省中医药研究院 浙江 杭州 ３１０００７
摘要 目的：应用 ＲＰ－ＨＰＬＣ建立三叶青的色谱指纹图谱。方法：色谱柱：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ 柱
（Ｃ１８，２５０×４．６ｍｍ，５μｍ）；流动相Ａ：甲醇；流动相Ｂ：水；流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ；检测波长：３００ｎｍ；
柱温：２５℃；记录时间：１１２ｍｉｎ。结果：获得了该药材的 ＨＰＬＣ色谱指纹图谱，含有共有峰７个。结
论：本方法样品处理简便，重复性好，可为三叶青的质量控制提供参考。
关键词 三叶青 ＨＰＬＣ 指纹图谱
三叶青为葡萄科崖爬藤属植物三叶崖爬藤Ｔｅｔ
ｒａｓｔｉｇｍａｈｅｍｓｌｅｙａｎｕｍ Ｄｉｅｌｓ ｅｔ．Ｇｉｌｇ干燥块根。又
名蛇附子、石抱子等。分布在安徽、浙江、江西、福
建等长江以南的大部分地区，生长于山谷林中或沟边
坡地。三叶青以块根或全草入药，具有清热解毒、祛
风化痰、活血止痛等功效。化学成分研究表明三叶青
主要含有脂肪酸、黄酮、皂苷、甾醇等化学成分［１－４］。
现代药理实验表明三叶青具有抗肿瘤、免疫调节、保
肝护肝、抗病毒等作用［５－８］。但对于三叶青的指纹图
谱研究未见文献报道，所以本文的研究为其药材的质
量控制提供一定的参考。
１ 仪器、试剂与材料
Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＢＳ２１０ｓ 电 子 分 析 天 平；ＶＡＲＩＡＮ
ＰＲＯＳＴＡＲ高效液相色谱仪，ＫＱ３２００超声波清洗器
（昆山超声波仪器厂），ＳＺＦ－０６Ａ加热回流提取器 （上
海新 嘉 电 子 有 限 公 司）。谷 甾 醇 （批 号 １１０８５－
２００５０４），购自中国药品生物制品鉴定所；甲醇：色谱
纯，ＭＥＲＣＫ；甲醇：分析纯，杭州高晶精细化工有限
公司；乙醇：分析纯，杭州高晶精细化工有限公司。水
为自制纯净水。三叶青，来源于下表所见的不同产地，
经鉴定均为为葡萄科植物三叶崖爬藤 （Ｔｅｔｒａｓｔｉｇｍａ
ｈｅｍｓｌｅｙａｎｕｍＤｉｅｌｓ ｅｔ Ｇｉｌｇ）的干燥块根。１０批药材均
采自浙江省，来源见表１，作为供试品１～１０号。
２ 实验方法
２．１ 对照品溶液的制备：取β－谷甾醇标准品，精密称
定，加甲醇超声溶解制成０．０１ｍｇ／ｍｌ的对照品溶液。
２．２ 样品溶液制备：取药材粉末约１ｇ，精密称定，
置圆底烧瓶，加入９０％乙醇５０ｍｌ，加热回流１小时，
取出，放冷，滤过，滤液水浴挥干，残渣加甲醇溶解
并定容至５ｍｌ，摇匀，即得。
表１ 三叶青样品来源
编号 产地
１ 常山
２ 建德
３ 兰溪
４ 磐安１
５ 磐安３
６ 磐安４
７ 天惠
８ 百山祖
９ 磐安特产城
１０ 磐安特产城
２．３ 色谱条件：色谱柱：ＹＭＣ－ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ Ｃ１８柱
（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）。流动相：Ａ为甲醇，Ｂ为
水，线性梯度洗脱程序见下表。流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ，检
测波长３００ｎｍ，进样量１０μｌ；柱温２５℃；分析时间
１１２ｍｉｎ。梯度洗脱程序见表２。
表２ 梯度洗脱程序表
时间 （ｍｉｎ） ０ １０ ２０ ７０ １１０
甲醇 （％） ５ ５ １５ ２５ ８５
水 （％） ９５ ９５ ８５ ７５ １５
２．４ 精密度考察：精密吸取供试品溶液１０μｌ，连续
进样６次，直观观察指纹图谱的全貌无明显差别，用
相似度计算，在同一台仪器测得的色谱指纹图谱的相
似度均大于０．９５０，表明该仪器的精密度良好。
２．５ 稳定性考察：取同一份供试品溶液，分别在０、
３、６、９、１２、１８、２４、４８、７２小时等９个时间点进
行检测，直观观察指纹图谱的全貌无明显变化，用相
似度计算，指纹图谱的相似度均大于０．９５０，供试品
溶液的成分在７２小时内是稳定的。
２．６ 重复性：取同一批号三叶青粉末６份，按照供
·６９２· 浙江中医杂志２０１３年４月第４８卷第４期
试品溶液的制备方法制备，依法检测，６份供试品溶
液测得的色谱指纹图谱的全貌直观观察无明显变化，
用相似度计算，指纹图谱的相似度均大于０．９５０，该
方法的重复性较好。
３ 结果
３．１ 指纹图谱测定：１０批三叶青药材按上述实验方
法制成供试品溶液，在上述色谱条件下，分别进样并
记录１１２ｍｉｎ色谱图。
３．２ 共有峰的标定：１１２ｍｉｎ内共有７个主要特征峰。
由于７号峰 （β－谷甾醇）占总面积较多，且比较稳定，
选择其作为参照峰 （Ｓ），计算其它各特征峰的相对保
留时间和相对峰面积。结果见表３和表４。
表３ １０批三叶青药材的相对保留时间指纹图谱数据
峰号
样品 １ ２ ３ ４ ５ ６ ７
１ ０．１２９４ ０．２５９９ ０．４７５７ ０．６１３８ ０．６８０３ ０．８１００ １．００００
２ ０．１２２７ ０．２５８２ ０．４７８０ ０．５７２８ ０．６８０５ ０．７６２５ １．００００
３ ０．１１６９ ０．２３８０ ０．４８３３ ０．５７０５ ０．６７８５ ０．７５９９ １．００００
４ ０．１２１８ ０．２５６２ ０．４７６４ ０．５８５０ ０．６８５０ ０．７６４８ １．００００
６ ０．１１９７ ０．２６７３ ０．４８８７ ０．６１８７ ０．６８４５ ０．８０９１ １．００００
７ ０．１２４３ ０．２４１１ ０．４８６５ ０．６１０５ ０．６７６５ ０．８０５８ １．００００
８ ０．１２０７ ０．２６７８ ０．４７６７ ０．６３５４ ０．６７７７ ０．８０４５ １．００００
１０ ０．１２１８ ０．２５６３ ０．５０１７ ０．５９５３ ０．６４３９ ０．７６９１ １．００００
１１ ０．１１５７ ０．２４５４ ０．４７５３ ０．５８４４ ０．６４１７ ０．７５９５ １．００００
１２ ０．１２３８ ０．３０７８ ０．４７５５ ０．５７６９ ０．６８６１ ０．８１１４ １．００００
平均值 ０．１２３８ ０．３０７８ ０．４７５５ ０．５７６９ ０．６８６１ ０．８１１４ １．００００
ＲＳＤ ０．０３１９ ０．０７５７ ０．０１７８ ０．０３７１ ０．０２４５ ０．０３０５ ０．００００
表４ １０批三叶青药材的相对峰面积指纹图谱数据
峰号
样品 １ ２ ３ ４ ５ ６ ７
１ ０．５０４１ ０．３２７９ １．８６５２ １．７１１５ １．５４９８ １．１３１２ １．００００
２ ０．４００６ ０．１８６６ １．７５００ １．９１８６ ２．３５１０ １．５１７１ １．００００
３ ０．４３３５ ０．４５３５ １．８７９３ ２．１７１４ １．２２８８ １．４５９１ １．００００
４ ０．３６４７ ０．５５３２ ２．２１４１ ２．５３６８ ２．０３６６ １．１８３２ １．００００
６ ０．３６１９ ０．６５８８ １．９５８７ ２．８８５７ １．２６２２ １．８４７１ １．００００
７ ０．４１２５ ０．４７３３ ２．３６６８ ２．２４７９ １．２７３５ ０．９５５９ １．００００
８ ０．３２６５ ０．５０８７ １．５８６１ １．９７８０ ２．６１８１ １．１６６２ １．００００
１０ ０．８３１０ ０．６７７１ １．７５３０ ２．２７０６ １．５０９２ ０．９２１９ １．００００
１１ ０．３１２２ ０．３７６１ １．３８６１ １．７０４５ ２．５０８０ ０．９４７９ １．００００
１２ ０．３９０５ ０．４１０３ ２．０７９７ １．９６８４ １．４０７０ １．７２３０ １．００００
平均值 ０．４３３８ ０．４６２６ １．８８３９ ２．１３９３ １．７７４４ １．３４８３ １．００００
ＲＳＤ ０．３４５７ ０．３２１９ ０．１５４１ ０．１７２２ ０．３０９７ ０．２７３４ ０．００００
３．３ 相似度评价：测定１０批三叶青药材的供试品
（见图１），得到不同批次样品的色谱图，采用中国药
典委员会 “中药色谱指纹图谱相似度评价系统２００４Ａ
版”进行相似度评价，确定三叶青药材的指纹图谱，
三叶青药材供试品的相似度在０．８２３～０．９２８之间
（见表５），表明此１０批三叶青药材水解后的指纹图谱
相似度良好，由此确定了三叶青药材水解后样品有７
个共有峰，指纹图谱共有模式见图２，其参数见表６。
·７９２·浙江中医杂志２０１３年４月第４８卷第４期
图１ １０批三叶青药材的高效液相指纹图谱
图２ 三叶青药材高效液相指纹图谱的共有模式
４ 讨论
４．１ 提取溶解的选择：分别对采用９０％甲醇、７０％
甲醇、５０％甲醇、９０％乙醇、７０％乙醇、乙酸乙酯、
正丁醇作为提取溶剂进行了比较。结果表明，９０％乙
表５ １０批三叶青药材的指纹图谱相似度评价结果
批号 １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０
相似度 ０．９０４ ０．９１６ ０．９２８ ０．８６４ ０．８２３ ０．８５５ ０．９１５ ０．８６３ ０．８２７ ０．８９７
表６ 三叶青药材标准图谱各共有峰参数
峰序 保留时间 峰面积
１ ７．６５７１ ３３２７１８
２ １６．３５９３ ３５４８０８
３ ３０．３１９５ １４４４９２５
４ ３７．５０５３ １６４０８１３
５ ４２．３８１１ １３６０９４０
６ ４９．４２６６ １０３４１２７
７ ６２．９３７５ ７６６９８６
醇提取的供试品溶液的色谱峰数目最多，信息最全，
故确定提取溶剂为９０％乙醇。
４．２ 检测波长的选择：采用二极管阵列检测器，对
供试品检测波长进行了考察，结果表明在３００ｎｍ处各
色谱峰均有较好的紫外吸收，色谱信息最为丰富，因
此选择该波长作为检测波长。
４．３ 流动相的确定：采用梯度洗脱对三叶青提取物
进行分离，最后确定以表２中的流动相进行洗脱，在
该条件下，色谱峰的分离效果好，峰形也较好，故确
定采用该流动相进行色谱分离，结果见图１。
４．４ 柱温对分离效果的影响：分别考察了柱温２５℃、
３０℃、３５℃、４０℃对分离效果的影响。结果表明，柱
温对分离效果的影响较小。故确定柱温为２５℃。
４．５ 流速对分离效果的影响：分别考察了流速
１．１ｍｌ／ｍｉｎ、１．０ｍｌ／ｍｉｎ、０．８ｍｌ／ｍｉｎ对分离效果的影
响，结果表明，流速对分离效果的影响较小。故确定
柱温为１．０ｍｌ／ｍｉｎ。
４．６ 相似度评价：结果显示１０批三叶青药材供试品
的相似度在０．８２３～０．９２８之间，分析其差异原因主
要是本试验所用的药材为不同产地的三叶青，有些为
野生品，有些为栽培品，由于气候、土壤等因素，在
化学成分等方面存在一定的差异。
本实验建立了浙江产三叶青的 ＨＰＬＣ指纹谱的测
定方法，实验方法易行，重复性好，得到三叶青的
ＨＰＬＣ指纹图谱及相关数据，为三叶青药材的质量控
制提供参考。
５ 参考文献
［１］郑军献，胡轶娟，梁卫青，等．紫外可见分光光度法测定
三叶青中总黄酮含量 ［Ｊ］．中国中医药科技，２００９ （２）：１２６．
［２］霍昕，杨适嘉，刘文炜，等．三叶青块根乙醚提取物成分
研究 ［Ｊ］．药物分析杂志，２００８，２８ （１０）：１６５１－１６５３．
［３］李瑛琦，陆文超，于治国．三叶青的化学成分研究 ［Ｊ］．中
草药，２００３，３４ （１１）：９８２－９８３．
［４］刘东，杨峻山．中国特有植物三叶青化学成分的研究 ［Ｊ］．
中国中药杂志，１９９９，２４ （１０）：６１１－６１３．
［５］徐彩菊，白宁宁，孟佳，等．三叶青提取物体内抑瘤作用
及其机理研究 ［Ｊ］．中国卫生检验杂志，２００９，１９ （２）：２７８－
２８０．
［６］杨雄志，巫军．三叶青提取物抗乙肝病毒活性的研究 ［Ｊ］．
南京中医药大学学报，２００９，２５ （４）：２９４－２９６．
［７］程伟，陆曙梅．三青提取物对肺癌Ａ５４９细胞的体外抑制作
用 ［Ｊ］．中国实验方剂学杂志，２００７，１３ （１０）：５３－５６．
［８］徐彩菊，丁钢强，孟佳，等．中药三叶青提取物抗肿瘤机
制初探 ［Ｊ］．中国卫生检验杂志，２００６，１６ （１）：１４－１６．
收稿日期 ２０１２－１１－０１
·８９２· 浙江中医杂志２０１３年４月第４８卷第４期