全 文 ：胶束电动毛细管色谱法分离分析山
茱萸中齐墩果酸和熊果酸
王　瑞 1, 2 ,王淑美 2 ,梁生旺3* ,许国旺 4 ,翁前锋 4
(1.北京中医药大学 ,北京 100102;2.河南中医学院 ,河南郑州 450008;3.广东药学院中药学院 ,广东广州
510006;4.中国科学院大连化学物理研究所 ,辽宁大连 116011)
　　摘要　以环糊精修饰的胶束电动毛细管色谱法分离分析了中药山茱萸中的齐墩果酸和熊果酸。通过对十二
烷基硫酸钠 、异丙醇 、二甲基-β-环糊精 、β-环糊精 、磷酸二氢钠 、硼砂的浓度以及缓冲溶液 pH值的优选 , 确定最佳
操作条件为 60 mm o l /L十二烷基硫酸钠 , 2.5 mm ol /L磷酸二氢钠 , 2. 5 mmo l /L硼砂 , 8 mm o l /L二甲基-β-环糊精 , 8
mm o l /L β-环糊精和 30%(v /v)异丙醇 ,紫外检测器检测 ,并在 214 nm下提取色谱图。齐墩果酸在 30 μg /m l～ 900
μg /m l范围内有良好的线性关系 , 相关系数为 0.9996, 熊果酸在 34 μg /m l～ 1020μg /m l范围内有良好的线性关系 ,
相关系数为 0. 99951。
关键词　胶束电动毛细管色谱法;山茱萸;齐墩果酸;熊果酸
中图分类号:R284.1　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2007)08-0946-05
Separation and Determ ination ofO leanolic Acid and Ursolic Ac id
from Cornus officinalis by Capillary E lectrophoresis
WANG Ru i1, 2 , WANG Shu-m ei2 , L IANG Sheng-wang3* , XU Guo-wang4 , WENG Q ian-feng4
(1. Beijing University o f ChineseM edic ine, Beijing 100102, China;2. H enan Co llege of T raditiona l Chine seM ed icine, Zheng zhou
450008, Ch ina;3. Guangdong Pha rm aceutica lUniversity, Guang zhou 510006, China;4. Da lian Institute of Chem ica l Phy sics, Chi-
nese Academ y o f Sc iences, Da lian 116011, Ch ina)
Abstrac t　A cyc ledextrin-m odified m ice lla r e lec trokinetic chrom atography techn ique fo r sepa ra ting and de te rm ina tion o leanolic
acid and urso lic ac id in the fruit ofCornus officinalis was deve loped. The two bio-ac tive com ponen ts was com plete ly separated using a
buffer containing 60 mmo l /L SDS, 2. 5 mmo l /L NaH2PO4 , 2.5 mm o l /L Na2B4O 7 , 8 mm o l /L DM β-CD, 8 mm o l /L β-CD and 30%
(v /v) 2-propano l. The co rre la tion coffic ients of the linea r ca libra tion graphs for o leano lic acid and ursolic acid are 0.9996 and
0. 9995, respec tive ly. The e ffects o f SDS, 2-propano l, dim e thy l-β-cyclodex trin, β -cyclodex trin, NaH2PO4 , Na2B4O7 and pH on sepa-
ra tion w ere inve stiga ted.
K ey words　M ice llar e lec trokine tic chroma tog raphy;Cornus officinalis;O leano lic acid;Urso lic acid
*通讯作者:梁生旺 , E-m ail:Sw liang 371@ 163. com。
　　山茱萸为山茱萸科落叶小乔木植物山茱萸
(Cornus officina lis Sieb. e tZuce.)的干燥成熟果肉 ,
其味酸 、涩 ,性温 ,归肝 、肾经 。功能补益肝肾 、涩精
缩尿 、敛汗固脱 ,是中医常用的滋补良药。齐墩果酸
和熊果酸是山茱萸中的两种重要的药理活性成
分 〔1〕 ,属于五环三萜类化合物 ,为同分异构体。许
多学者建立了基于不同系统的分析齐墩果酸和熊果
酸的方法 ,如高效液相色谱法 〔2、3〕 、气相色谱法 〔4〕
等 ,有关毛细管电泳分离分析齐墩果酸和熊果酸的
报道较少〔5〕。
毛细管胶束电动色谱 (MEKC)是以胶束为假固
定相的一种电动色谱 ,是电泳技术和色谱技术的巧
妙结合 〔6〕。MEKC是在电泳缓冲溶液中加入表面活
性剂 ,当溶液中表面活性剂浓度超过临界胶束浓度
(CMC)时 ,表面活性剂分子之间的疏水基团聚集在
一起形成胶束 (假固定相 ),溶质基于在水相和胶束
相之间的分配系数不同而得到分离 〔7、8〕。目前该方
法已被广泛应用于中药分析中。本论文建立一种环
糊精修饰的胶束电动毛细管色谱 (CD-MEKC)方法
对山茱萸中齐墩果酸和熊果酸的含量进行测定 ,研
究了不同分析条件对分离检测的影响 ,最终确定了
合适的分离分析条件。方法的重现性好 、灵敏度高 ,
能够实现对山茱萸中齐墩果酸和熊果酸的分析测
定。
1　仪器与试剂
采用 BeckmanMDQ电泳仪 (Beckman公司 ,美
国),仪器控制和数据采集通过 Beckman 32 Ka ra t工
作站进行 。 40 cm 50 μm i.d.的熔融石英毛细管
946 中药材 Journa l o f Chine seM ed icina lM a teria ls　　第 30卷第 8期 2007年 8月
DOI牶牨牥牣牨牫牳牰牫牤j牣issn牨牥牥牨牠牬牬牭牬牣牪牥牥牱牣牥牳牣牥牪牰
(河北永年光导纤维厂 ),有效柱长 30 cm。 KQ118
超声清洗器 (昆山市超声仪器公司)。
十二烷基硫酸钠 (SDS)(Farco公司 ,香港 )、β-
环糊精 (β-CD)[中国医药 (集团 )上海化学试剂公
司 ] 、二甲基-β-环糊精 (DM-β-CD)(Beckm an公司 ,
美国)、磷酸二氢钠 (沈阳市联邦试剂厂 )、硼砂 (上
海云岭化工厂)均为分析纯 ,异丙醇 (天津市四友生
物医学技术有限公司)为色谱纯 。以上试剂用于配
制缓冲溶液 ,在分离前用 0.22 μm微孔滤膜 (上海
亚东核级树脂有限公司)过滤。所有纯水 (18MΨ
cm)均用 M illi-Q超纯水装置 (M illipo re公司 ,美国 )
制备。
齐墩果酸和熊果酸对照品购自中国药品生物制
品检定所 ,配制对照品所用无水乙醇 (沈阳市联邦
试剂厂 )为分析纯 。
2 　实验方法
配制一定浓度的缓冲溶液作为电泳缓冲液 (也
作背景电解质 ),实验前超声 15 m in。新毛细管依
次用 0.1 mol /L N aOH、H2O、缓冲溶液分别各冲洗
10 m in。每天开始实验时用 0.1 mo l /L N aOH、H2O
和缓冲溶液依次各冲洗 10 m in ,两次分离之间毛细
管用缓冲液冲洗 3 m in。采用气动进样方式。 0.5
p. s. i进样 5s,分离电压 +30KV ,柱温 30℃。毛细
管入口端为高压的正极 ,毛细管出口端为高压的负
极 。采用在柱紫外检测。检测波长 214 nm。毛细
管入口端和毛细管出口端的缓冲瓶内溶液在进样前
应保持一致 。
2.1 　齐墩果酸和熊果酸对照品溶液的配制　称取
一定量的齐墩果酸和熊果酸对照品 ,精密称定 ,分别
溶解于无水乙醇中 ,配制成齐墩果酸 3.0 mg /m l,熊
果酸 3.4 mg /m l的储备液 ,于 4℃冰箱中保存备用 。
2.2 　样品的制备　取适量山茱萸粉末 (过 20目
筛 )于烘箱中 60℃干燥 4 h,称取 1 g,精密称定 ,置
索氏提取器中 ,加乙醚 70 m l,加热回流提取 4 h,提
取液置蒸发皿中蒸干 ,残渣用石油醚(30 ～ 60℃)浸
泡 2次 ,每次 2m in,倾去石油醚 ,残渣加无水乙醇水
浴上温热溶解 ,转移至 5 m l容量瓶中 ,并稀释至刻
度 ,摇匀 ,用 0.22μm油膜滤过 ,备用 。
3 　结果与讨论
3.1 　最佳分离条件的确定　齐墩果酸和熊果酸为
同分异构体 ,结构非常相似 ,为了能使两组分成功分
离 , 我们优化了 SDS、异丙醇 、 DM-β-CD、 β-CD、
N aH 2PO4 、N a2 B4O 7的浓度和缓冲溶液的 pH值 ,在
最佳优化的条件下 ,两组分能够完全分离 。
3.1.1　SDS浓度的影响:SDS是 MEKC中最常用
的阴离子表面活性剂 ,在高于临界胶束浓度时以胶
团的形式分散在溶液中 ,在 MEKC中作为分离 “载
体”,对 MEKC的分离过程起着重要作用。因此 ,缓
冲溶液中 SDS浓度的调节和控制是优化分离的重
要对策。实验中考察了 SDS浓度在 20-80 mmo l /L
范围内对齐墩果酸和熊果酸分离度和迁移时间的影
响 ,如图 1和图 2所示。
图 1　SDS浓度对齐墩果酸和熊果酸分离度的影响
图 2　SDS浓度对齐墩果酸和熊果酸迁移时间的影响
1.齐墩果酸　2.熊果酸
　　由图 1可以看出 ,齐墩果酸和熊果酸分离度随
着 SDS浓度的增加而增大 ,这是因为胶束体系的增
溶作用与胶束浓度呈正比 ,增溶程度与被增溶物的
特性有关 。随着 SDS浓度的增加 ,通过疏水 、静电
和氢键的相互作用 ,对熊果酸的增溶作用增大。然
而 ,随着 SDS浓度的增加 ,迁移时间也增加 ,如图 2
所示 ,这是由于溶液粘度增大 ,溶液中阴离子浓度增
加 ,电渗流减小的缘故。综合分离度和迁移时间 ,
SDS的最佳浓度确定为 60 mmo l /L较为适宜。
3.1.2 　有机添加剂的影响:由于齐墩果酸和熊果
酸的疏水性 ,如果不在缓冲溶液中加入有机改性剂 ,
在分离过程中两成分有可能沉淀析出 ,甚至会堵塞
毛细管 ,无法进行分离测定。胶束体系中最常用的
添加剂是甲醇 、乙醇 、乙腈和异丙醇 ,由于加入甲醇
和乙醇完全不能将齐墩果酸和熊果酸分离。加入乙
腈后缓冲体系不稳定 ,因此 ,本实验选择了异丙醇 ,
并考察了缓冲液中异丙醇在 20%-50%范围内对两
组分分离的影响 ,如图 3(a)、(b)、(c)、(d)所示。
947 中药材 Journa l o f Chine seM ed icina lM a teria ls　　第 30卷第 8期 2007年 8月
从图 3中可以看出 ,缓冲溶液中异丙醇体积比
浓度为 30%时齐墩果酸和熊果酸的分离度最大 ,信
噪比最高 ,而且这时的迁移时间也较短 ,因此把缓冲
溶液中异丙醇的最佳体积比浓度确定为 30%。
图 3(a)　20%(v /v)异丙醇对齐墩果
酸和熊果酸分离的影响
图 3(b)　30%(v /v)异丙醇对齐墩果
酸和熊果酸分离的影响
图 3(c)　40%(v /v)异丙醇对齐墩果
酸和熊果酸分离的影响
图 3(d)　50%(v /v)异丙醇对齐墩果
酸和熊果酸分离的影响
3.1.3　环糊精浓度的影响:环糊精加入到胶束溶
液中 ,能够改善 MEKC的选择性 ,常用于强疏水性
化合物和手性分子的分离。当只在缓冲溶液中加入
β-CD或 DM-β-CD一种环糊精时 ,不能将齐墩果酸
和熊果酸完全分离 ,因此 ,本实验将 β-CD和 DM-β-
CD以 1∶1的比例加入缓冲溶液中 ,并考察了它们的
总浓度在 4-20 mmo l /L范围内对两组分分离度的影
响 ,如图 4所示 。
图 4　β-CD和 DM-CD对齐墩果
酸和熊果酸分离度的影响
　　由图 4中可以看出 , 当缓冲溶液中 β-CD和
DM-β-CD的总浓度为 16mmol /L时 ,齐墩果酸和熊
果酸的分离最大 ,而且这时两组分的峰形对称性好 ,
信噪比最大 ,迁移时间也较短 ,因此缓冲溶液中的最
佳环糊精浓度为 8 mmo l /L β-CD和 8 mmo l /L DM-
β-CD。
3.1.4　缓冲盐浓度的影响:缓冲盐的类型 、浓度决
定着毛细管区带电泳 (CZE)的分离效率 、选择性和
分离度的好坏 ,以及分析时间的长短 ,在 CZE分离
条件的优化中具有重要意义 ,对 MEKC的影响虽然
不如 CZE那样显著 ,还是会影响电渗流 ,亦会影响
样品溶质的电泳行为。实验中选择了 5 mmo l /L
NaH2 PO 4-2.5 mmo l /L Na2B4O 7、5mmo l /L N aH 2PO4-
5 mmol /L N a2 B4O 7 、 2.5 mmo l /L NaH2 PO 4-2.5
mmo l /L Na2B4O7和 2.5mmo l /L N aH 2PO4-5 mmo l /L
Na2B4O7四个缓冲盐浓度比进行考察 ,结果如图 5
(a)、(b)、(c)、(d)。
由图 5可知 ,缓冲盐的浓度在一定范围内变化
时 ,齐墩果酸和熊果酸的分离度影响不大 ,但是当缓
冲盐的总浓度达到 10 mmol /L时 ,两组分的迁移时
间变长 ,峰形展宽 ,这是由于随着缓冲盐浓度的增
加 ,缓冲溶液的离子强度增大 , za ta电势降低 , EOF
减小所致。综合迁移时间和信噪比 , 确定 2.5
mmo l /L NaH2 PO 4-2.5 mmo l /L N a2 B4O 7为最佳缓冲
盐浓度。
3.1.5　缓冲溶液 pH的影响:缓冲溶液的 pH值影
响石英毛细管内壁 S i-OH基的电离 ,从而影响 EOF。
另外 ,样品离子的有效电荷也受缓冲溶液 pH值的
948 中药材 Journa l o f Chine seM ed icina lM a teria ls　　第 30卷第 8期 2007年 8月
图 5(a)　5 mmo l /L NaH2 PO 4-2. 5 mmol /L Na2B4O 7
对齐墩果酸和熊果酸分离的影响
图 5(b)　5 mmol /L N aH2PO4-5 mmol /L Na2B4O 7
对齐墩果酸和熊果酸分离的影响
图 5(c)　2. 5mmo l /L N aH2PO4-2. 5mmol /L Na2B4O 7
对齐墩果酸和熊果酸分离的影响
图 5(d)　2. 5 mmol /L N aH2PO4-5 mmol /L Na2B4O 7
对齐墩果酸和熊果酸分离的影响
影响。因此 ,缓冲溶液 pH值是优化分离的重要因
素 。实验中考察了缓冲溶液 pH值在 8.0-10.0范围
内对齐墩果酸和熊果酸分离度及迁移时间的影响
(其中 pH 9.35是未加酸碱调节时缓冲溶液的 pH
值 ),如图 6和图 7所示 。
图 6　缓冲溶液 pH值对齐墩果酸
和熊果酸分离度的影响
图 7　缓冲溶液 pH值对齐墩果酸
和熊果酸迁移时间的影响
1.齐墩果酸　2.熊果酸
　　从图 6和图 7可以看出 ,缓冲溶液的 pH为 8.0
时 ,齐墩果酸和熊果酸分离度最好 ,但迁移时间最
长 , pH9.35(即不调 pH值 )和 pH 10.0时对两组分
的分离度和迁移时间相近 ,且都将两组分完全分离 ,
因此把缓冲溶液的最佳 pH值确定在 9.35,免去了
调节 pH的麻烦。
通过以上实验确定最佳的分离条件为:60
mmo l /L SDS, 8 mmo l /L β-CD、8 mmol /L DM-β-CD、
2.5 mmo l /L NaH2 PO 4、2.5 mmo l /L Na2B4O7和 30%
(v /v)异丙醇溶液 。
3.2　精密度试验　在优化的实验条件下 ,将齐墩
果酸和熊果酸的混合对照品无水乙醇溶液重复进样
6次 ,峰面积和迁移时间的相对标准偏差 (RSD)齐
墩果酸分别为 4.9%和 1.2%,熊果酸分别为 2.4%
和 1.5%。精密度较好 ,能满足定量分析的要求 。
3.3　线性化范围试验　在最佳优化的分离条件
下 ,得到齐墩果酸的峰面积 (y, Pa)和浓度 (x, μg /
m l)之间 的标准工作 曲线为:y =61.087x -
1001.330,在 30 μg /m l ～ 900 μg /m l具有良好的线
性关系 ,相关系数 r=0.9996。熊果酸的峰面积 (y,
Pa)和浓度 (x, μg /m l)之间的标准工作曲线为:y =
61.436x - 106.057,在 34 μg /m l ～ 1020 μg /m l具有
949 中药材 Journa l o f Chine seM ed icina lM a teria ls　　第 30卷第 8期 2007年 8月
良好的线性关系 ,相关系数 r=0.9995。
3.4 　山茱萸药材中齐墩果酸和熊果酸的含量测定
　在优化的条件下 ,对山茱萸药材中齐墩果酸和熊
果酸含量进行测定 ,外标法定量 ,测定结果为山茱萸
药材中齐墩果酸含量 0.785 mg /g, 熊果酸含量
1.998mg /g。齐墩果酸 、熊果酸混合对照品和山茱
萸药材的电泳谱图如图 8(a)、(b)所示。两组分的
加样回收率齐墩果酸为 99.30% ～ 101.85%,熊果
酸为 98.30% ～ 98.59%。
图 8(a)　齐墩果酸和熊果酸混合对照品电泳图谱
1.齐墩果酸　2. 熊果酸
图 8(b)　山茱萸药材电泳图谱
1.齐墩果酸　2. 熊果酸
4 　结论
4.1 　本实验首次将二甲基-β-环糊精和异丙醇应
用于中药中活性成分的分离和分析。当以 50
mmo l /L SDS、 2.5 mmo l /L MN a2 B4O7 、 5 mmo l /L
N aH 2PO4 、40%(v /v)异丙醇溶液作为缓冲溶液 ,齐
墩果酸和熊果酸混合样品作为一个峰 ,但峰稍有分
叉 。增加 SDS的浓度到 100mmo l /L时 , 45.2m in处
出现齐墩果酸的峰 , 46.8m in处出现熊果酸的峰 ,两
峰完全分离 ,但迁移时间太长 。在上述体系中单独
加入不同浓度的 β-环糊精 、二甲基-β-环糊精和 γ-
环糊精均不能使两组分完全分离 ,因此拟采用混合
环糊精。经优选后 ,最佳的分离体系为 60 mmo l /L
SDS、 8 mmo l /L β-CD、 8 mmol /L DM-β-CD、 2.5
mmo l /L Na2B4O 7、2.5mmol /L NaH2 PO4 、30%(v /v)
异丙醇体系。在此条件下 ,齐墩果酸和熊果酸的分
离度 (R)可达 3.7。
4.2　与目前测定山茱萸药材中齐墩果酸和熊果酸
含量的方法相比 ,本方法能够将山茱萸药材中的齐
墩果酸和熊果酸完全分离 ,具有灵敏度高 、快速 、易
于重现且所用试剂价格低廉的特点 ,因此适合于中
药山茱萸的测定。
参 考 文 献
[ 1] 潘扬 , 王天山 .植物山茱萸化学成分的研究概况 .南京
中医药大学学报 , 1998, 14(1):61.
[ 2] 谢莹 , 杭太俊 ,程赞 , 等 .高效液相色谱法测定中药中齐
墩果酸和熊果酸含量 . 中国中药杂志 , 2001, 26(9):
615-616.
[ 3] 徐德然 , 丁晴 ,王峥涛 .HPLC法测定山茱萸及知柏地黄
丸中齐墩果酸 、熊果酸的含量 .中草药 , 2002, 33(11):
996-997.
[ 4] 周静 ,刘垣升 .气相色谱法测定女贞子中齐墩果酸和熊
果酸的含量 , 中国新药与临床杂志 , 2003, 22(10):596-
598.
[ 5] L i jun, Yuan Zhuob in. Sepa ra tion of urso lic acid and olean-
o lic acid from the fru it o fCornus officinalis by cap illa ry e-
lectropho re sis.P roc o f In t 10th Be ijing Conf and Exh ib on
Instrum Analy sis E lectroana ly tica l Chem istry, 2003:195-
196.
[ 6] 邓延倬 , 何金兰 .高效毛细管电泳 . 北京:科学工业出
版社 , 1996:100-101.
[ 7] You-Zung H sieh, H si-Ya H uang.De te rm ina tion of sa ikosa-
pon ins by m ice lla r e lec trokine tic capillary chrom atog raphy.
Jou rna l of Ch rom a tog raphy A, 1997, 759(1-2):193-201.
[ 8] Ingm arG lock l, M arkus Ve it, Go ttfried B laschke. De term i-
nation of G insenosides from Panax ginseng Using M ice llar
E lectrokine tic Chrom atography. P lan ta M ed, 2002, 68
(2):158-161.
(2007 - 01 -17收稿)
《中药材》杂志为国家首批公布的可登处方药广告的专业媒体 。
950 中药材 Journa l o f Chine seM ed icina lM a teria ls　　第 30卷第 8期 2007年 8月