全 文 ：浙 江 农 林 大 学 学 报， 2016， 33（1）： 65-70
Journal of Zhejiang A＆ F University
doi:10.11833/j.issn.2095-0756.2016.01.009
楸树花粉壁蛋白质提取及特异性
王改萍， 徐 涛， 樊莉丽， 彭方仁， 吕 昕， 陈琳月
（南京林业大学 林学院， 江苏 南京 210037）
摘要： 为了进一步研究楸树 Catalpa bungei 自交不亲和特性， 以楸树不同产地植株云台山楸树（CB-1）， 老山楸树
（CB-2）和滇楸 Catalpa fargesi f. duclouxii （CF）的花粉为对象， 利用普通研磨法及超声波破碎法， 研究了适合于花粉
壁蛋白质提取的方法。 同时采用考马斯亮蓝染色法及聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）比较了不同树种花粉蛋白质
质量分数及其主要蛋白质组分。 结果表明： 超声波破碎法适于花粉壁蛋白质的提取， 最佳超声参数为功率 400 W，
超声时间 3 s·次－1， 间歇时间 6 s·次－1， 3 个回合， 工作 120 次， 相隔 5 min·回合－1。 蛋白质提取液三羟甲基氨基甲
烷（Tris-HCl）的 pH 7.8最佳。 不同树种的花粉壁蛋白质质量分数表现为滇楸最高， 云台山楸树和老山楸树较低。 蛋
白质组分研究表明： 各树种花粉共有蛋白质有 26 个， 特异蛋白质为连楸 53.8 kD， 35.0 kD， 23.4 kD， 26.5 kD； 老
楸 53.8 kD， 38.5 kD， 23.4 kD； 滇楸 38.5 kD， 26.5 kD。 图 6表 1参 18
关键词： 植物学； 楸树； 超声波破碎法； 蛋白质； 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
中图分类号： S718.4 文献标志码： A 文章编号： 2095-0756（2016）01-0065-06
Pollen-wall protein extraction and characteristics of Catalpa bungei
WANG Gaiping, XU Tao, FAN Lili, PENG Fangren, L譈 Xin, CHEN Linyue
（College of Forestry, Nanjing Forstry University, Nanjing 210037, Jiangsu, China）
Abstract: The research was conducted to further reveal the self-incompatibility that exists extensively Catalpa
bungei and to evaluate the best way to extract pollen-wall protein of Catalpa, including the Catalpa bungei
plants CB-1 from Yuntaishan National Forest Park of Lianyungang and CB-2 from Laoshan Forest of Nanjing
and Catalpa fargesii f. duclouxii （CF） using incorporation and ultrasonication. Also, the content and component
of pollen-wall protein from different varieties was compared by the Coomassie Blue Staining Method and SDS
（sodium dodecyl sulfate）-polyacrylamide gel electrophoresis （PAGE）. Results showed that the relative opti-
mization method to extract pollen-wall protein of C. bungei was ultrasonication with the optimal parameters be-
ing: ultrasonication at 400 W power for 3 s every 6 s for 3 rounds taking 120 duplications at an interval of 5
min. The optimal pH value to extract pollen-wall protein was pH 7.8（F＞F0.05）. For pollen-wall protein content,
CF was higher （F＞F0.01） than both CB-1 and CB-2. From the pollen of these three catalpas, 26 proteins were
found. Molecular weight of the specific proteins for CB-1 were 53.8 kDa, 35.0 kDa, 23.4 kDa, and 26.5 kDa;
for CB-2 they were 53.8 kDa, 38.5 kDa, and 23.4 kDa; and for CF they were 8.5 kDa and 26.5 kDa. ［Ch, 6
fig. 1 tab. 18 ref.］
Key words: botany; Catalpa bungei; ultrasonication; protein; SDS-PAGE
植物自交不亲和性（self-incompatibility， SI）是指植物的雌蕊柱头或花柱可以辩别自体和异体花粉，
并抑制自体花粉萌发或生长的生理现象， 是一种重要的防止植物近亲繁殖、 增加变异的遗传机制［1］。 花
收稿日期： 2015-03-02； 修回日期； 2015-06-02
基金项目： “十二五” 国家科技支撑计划子项目（2012BAD21B03）； 江苏高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）
作者简介： 王改萍， 从事森林培育及植物生理生化研究。 E-mail： wanggaiping@njfu.edu.cn。 通信作者： 彭方
仁， 教授， 博士， 博士生导师， 从事用材林及经济林的栽培与利用等研究。 E-mail： frpeng@njfu.e-
du.cn
浙 江 农 林 大 学 学 报 2016 年 2 月 20 日
粉与柱头之间的识别和互作是重要的生殖过程， 而花粉壁中许多蛋白在此过程中扮演着重要角色。 成熟
花粉可分为外壁和内壁两部分， 两者都含有活性的蛋白质， 外壁蛋白已被确定存在于成熟花粉的外壁腔
隙内， 并参与了花粉与柱头的黏附、 识别及花粉水合、 萌发等过程［2－5］。 楸树 Catalpa bungei 是紫葳科
Bignoniaceae 梓树属 Catalpa的落叶乔木， 是中国特有的珍贵优质用材树种和著名园林观赏树种， 自古就
有 “木王” 之称［6－7］。 楸树具有自交不亲和特性， 已初步确定了其自交不亲和特点、 发生位置以及发生
类型［8］。 目前， 对楸树花粉的研究仅限于其生活力测定及授粉特性等方面 ［9－11］。 如何有效提取花粉壁内
特异蛋白成为研究花粉不亲和机制的基础。 本研究以楸树花粉为研究对象， 利用超声波破碎细胞法 ［12］及
普通冰浴研磨法比较了不同蛋白提取方法对花粉壁蛋白的影响， 同时以滇楸 Catalpa fargesii f. duclouxii
花粉为对照材料， 比较了不同树种之间蛋白质含量及蛋白质组分的变化特点， 为楸树花粉特异蛋白的研
究及进一步揭示楸树自交不亲和机理提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料为成年健壮的楸树， 分别位于连云港云台山国家森林公园内（简称云台山楸树， CB-1）和南
京老山林场内（简称老山楸树， CB-2）， 均不能自花结实。 对照为滇楸， 来自于南京林业大学校内（CF），
能自花结实。 各树种均为优良单株。
在楸树盛花期（4 月中旬－5 月上旬）采集楸树及滇楸各 20 个大花序， 带回实验室后用小镊子取下花
药， 置于称量纸上， 室温（24±2） ℃下约 2 d， 待花药自然开裂后收集花粉， －76 ℃超低温冰箱中保存备用。
1.2 试验方法
1.2.1 花粉蛋白质提取方法 ①普通冰浴研磨法。 以云台山楸树（CB-1）花粉为材料。 取花粉 0.2 g·次－1，
按照体积比 1∶5 比例加入 0.1 mol·L－1三羟甲基氨基甲烷（Tris-HCl）蛋白提取缓冲液， 缓冲液 pH 值共设 3
个水平， 分别为 pH 6.8， pH 7.8， pH 8.8。 在冰浴条件下充分研磨后， 取少量研磨液镜检， 其余部分在
4 ℃条件下静提 5 h， 之后离心（4 ℃， 12 000 r·min－1） 30 min， 上清液为粗提蛋白液。 待上清液吸出后，
余下沉淀再按照前述比例加 Tris-HCl 蛋白提取缓冲液， 进行 2 次提取。 静置及离心同前述条件， 离心
后， 留上清液， 去沉淀。 之后将上清液分别进行冷冻干燥， 超低温储存备用。 重复 3 次·处理－1。 ②超声
波破碎法。 在冰浴条件下， 利用超声波细胞破碎机（南京先欧仪器制造有限公司， XO-1000D）进行破壁处
理。 超声参数设定共 4个组合（表 1）， 重复 3次·组－1。 超声结束后取少量进行镜检。 蛋白提取方法同①。
表 1 超声波破碎花粉粒试验参数
Table 1 Parametrization of ultrasonic waves on extracting proteins from the pollen of catalpas
组合 功率/W 超声时间/（s·次－1） 超声间隙/（s·次－1） 工作次数
1 400 3 4 40次·回合－1， 3回合
2 400 3 6 40次·回合－1， 2回合
3 600 3 4 40次/·回合－1， 3回合
4 600 3 6 40次·回合－1， 2回合
1.2.2 蛋白质质量分数测定 采用考马斯亮蓝染色法［13］。
1.2.3 蛋白质组分测定 电泳研究使用 BIO-RAD 垂直板电泳槽 。 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-
PAGE）， 分离胶质量浓度为 0.130 kg·L－1（13.0%）， 浓缩胶质量浓度为 0.044 kg·L－1（4.4%）。 配胶质量浓
度及电泳设计程序参照相关材料， 略有变动［13］。 电泳结束后， 凝胶用 Bio-Rad Gel Doc XR 成像系统进
行扫描， 用 Quantity one 软件进行分析。 低分子量蛋白质 Marker（Protein Molecular Weight Marker）购自
Fermentas生物工程有限公司， 包括 7 种蛋白质。 试验所用药品均为 Amreso公司进口分装。
2 结果与分析
2.1 不同花粉蛋白提取方法比较
2.1.1 普通冰浴研磨法提取花粉蛋白 普通冰浴研磨法提取花粉蛋白时， 不同研磨时间对楸树花粉壁的
破碎性存在差异（图 1）。 在研磨 5 min后的镜检中发现， 此时花粉大都保持完整（图 1A）。 而研磨 10 min
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第 33 卷第 1 期
图 1 常规研磨方法提取花粉蛋白比较
Figure 1 Compare with efficiency on extracting protein by routine
method of rinding
后， 花粉壁大多消失， 但也出现花粉粒破碎（图
1B）， 导致了花粉壁蛋白粗提液中混杂有花粉粒蛋
白。 普通冰浴研磨法中需要多次镜检， 以观察破
碎效果， 耗时较多。 而且研磨时使用力量不同，
最终效果也存在差异， 导致研磨时间不确定， 精
度也不够， 试验重复性差。
2.1.2 超声波破碎法提取花粉蛋白 利用超声波
破碎法提取花粉蛋白的研究表明， 不同的超声参
数设计对花粉的破碎存在差异（图 2）。 采用第 1
组合超声参数设计破碎花粉， 发现楸树花粉粒保
持完整， 花粉壁少量变薄， 在显微镜下仍能观察
到花粉壁， 破损率为0（图 2A）。 采用第 2组合参数后， 发现其花粉壁基本消失， 花粉粒基本完好， 破损
率为 5%左右（图 2B）。 而利用第 3 组合参数破碎结束后， 花粉壁基本上消失， 但有少量花粉粒出现破
损， 破损率约 15%（图 2C）。 采用第 4 组合参数破碎结束后， 其破碎的花粉粒明显多于第 3 组合， 基本
上观察不到完整的花粉粒， 花粉破损率约 90%。 此时花粉粒中大量蛋白被提取出来， 对花粉壁蛋白的研
究造成不利影响（图 2D）。 比较 4 种超声波参数组合对花粉的破损影响， 认为第 2 组合更适于楸树花粉
壁中蛋白的提取， 能更有效地提取花粉壁蛋白。
图 2 不同组合超声波破碎法提取花粉蛋白比较
Figure 2 Compare with efficiency of extracting protein by ultrasonic waves
2.2 不同 pH值及不同超声功率对花粉蛋白质质量分数的影响
2.2.1 不同 pH 对花粉蛋白质质量分数的影响 采用最佳超声破碎参数设计， 利用不同 pH 值的蛋白提
取液（三羟甲基氨基甲烷 Tris-HCl）对老山楸树花粉蛋白质质量分数进行研究（图 3）。 结果表明： 提取液
的 pH 值不同， 其蛋白提取率存在差异。 第 1 次浸提后， 表现为 pH 7.8 的 Tris-HCl 蛋白提取率最高
（73.5 mg·g－1）， 而 pH 6.8提取率最低（52.9 mg·g－1）， pH 7.8和 pH 8.8的浸提液相差不大。 方差分析结果
也表明： 第 1 次浸提后不同处理间达到极显著差异（F＞F0.01）， 但 pH 7.8 和 pH 8.8 之间无论是 0.05 水平
及 0.01水平均不存在差异， 说明这 2种 pH值适合于楸树花粉蛋白质的提取。 而对第 2 次浸提后蛋白质
质量分数的分析表明， pH 6.8 与 pH 7.8 处理间差异不显著， 但两者与 pH 8.8 之间在 0.05 水平存在差
异。 而第 2 次浸提后蛋白质质量分数显著低于第 1 次， 不同 pH 值条件下蛋白质质量分数在 10 mg·g－1
左右， 即第 2次浸提后获得的蛋白质质量分数占总蛋白量比例低， 认为楸树蛋白一次提取率较高， 可以
不进行多次浸提。
2.2.2 不同超声功率对花粉蛋白质含量的影响 不同超声功率对楸树花粉蛋白质质量分数的研究也表
明， 在其他超声参数一致的条件下， 超声功率对其蛋白质质量分数有明显影（图 4）。 由图 4 可知： 随着
超声功率增大， 花粉蛋白质质量分数明显增加。 第 1 次蛋白提取后， 超声功率在 600 W 时蛋白质质量
分数（为 96.1 mg·g－1）明显高于功率 400 W 时。 方差分析结果也表明： 第 1 次浸提后不同处理之间达到
极显著差异（F＞F0.01）， 比较第 2次浸提后花粉蛋白提取率， 发现 2 处理间蛋白提取率均较低， 处理间没
有显著差异。 对 2 次花粉蛋白浸提叠加值也表现为超声功率为 600 W 时， 蛋白质提取率最高， 但显微
镜观察结果表明此处理花粉粒破碎较多， 对楸树壁花粉蛋白的精确性有影响， 因此， 本次试验仍选定超
王改萍等： 楸树花粉壁蛋白提取及特异性 67
浙 江 农 林 大 学 学 报 2016 年 2 月 20 日
声功率为 400 W， 保证其花粉特异蛋白的提取及后续的研究。
2.2.3 不同树种花粉蛋白质量分数及聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析 对 3 个样品花粉蛋白质质
量分数的研究表明， 滇楸蛋白质质量分数最高， 为 114.9 mg·g－1， 其次是云台山楸树， 老山楸树质量分
数最低（图 5）。 进一步比较发现， 滇楸花粉的蛋白质质量分数是老山楸树的 1.58 倍， 而云台山楸树和老
图 3 不同 pH 值对花粉蛋白
质的影响
Figure 3 Effect of pH on extracting
proteins from the pollen
图 4 不同功率对花粉蛋白质的影
响
Figure 4 Effect of ultrasonic power on
extracting proteins from the pollen
图 5 不同样品花粉蛋白质比
较
Figure 5 Compare of protein contents of
pollen in the different trees
CB-1 CB-2
山楸树之间差异较小。 方差分析的结果也表明： 不同样品之间存在
极显著差异（F＞F0.01）， 且滇楸与楸树间差异明显。 利用 SDS-PAGE
电泳分析了花粉的蛋白质组分（图 6）， 结果表明： 花粉蛋白质分子
量主要集中在 100 kD 内， 较均匀地分布于不同分子量区域， 分离
出的蛋白带约 30 多条， 反映了构成花粉可溶性蛋白的亚基种类较
多。 对不同样品的蛋白质组分进行比较， 发现三者差异蛋白包括出
现在云台山楸树和老山楸树中的 53.8 kD， 23.4 kD 蛋白； 出现在老
山楸树和滇楸中的 38.5 kD 蛋白； 出现在云台山楸树和滇楸中的
26.5 kD蛋白， 云台山楸树中特有的 35.0 kD蛋白。
3 讨论
植物授粉受精过程的顺利进行对植物生殖生长起着至关重要的
作用， 而作为雄配子体——成熟花粉粒的表面物质， 尤其是花粉表
面蛋白质则是授粉过程能否顺利完成的关键［2－3］。 了解花粉表面蛋白质组是为了深入研究花粉与柱头黏
附识别的分子机制的基础。
花粉壁中蛋白的提取方法普遍采用常规液氮研磨法， 但此次试验表明， 液态研磨法虽然操作简单，
易于进行， 但受研磨时间及人为用力大小不同， 导致花粉壁蛋白与花粉粒中蛋白混杂， 影响楸树中与自
交不亲和有关的不亲和蛋白（S 蛋白）的研究。 而超声波破碎法在天然产物提取中已经显示出越来越多的
优势［14－16］。 本研究中， 通过控制一定的超声频率和强度， 能够实现提取楸树花粉壁蛋白的目标。 同时，
对蛋白提取液 pH 值的选择中， 发现随 Tris-HCl 浸提液中 pH 值的增大， 各树种花粉内蛋白质质量分数
增加， 而且一次性蛋白提取率均较高， 不需要多次浸提分离获得蛋白。
在对植物自交不亲和的研究中， 人们逐步认识到在成熟花粉的外壁和内壁都含有活性的蛋白质， 这
种蛋白质是作为雌雄配子体识别的物质基础 ［4－5］。 MAYFIELD 等 ［17］发现 10 个拟南芥 Arabidopsis thaliana
花粉表面蛋白质。 刘宝敬等 ［18］对甘蓝 Brassica oleracea 自交不亲和系及亲和系花粉和柱头蛋白质进行等
电聚焦电泳研究中， 发现了 6条蛋白质谱带仅存在于自交不亲和系中， 而亲和系中未发现此谱带。 本研
图 6 花粉蛋白质 SDS-PAGE电泳
Figure 6 SDS-PAGE of pollen’s protein
CB-1 CB-2
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究中， 比较楸树和滇楸蛋白质质量分数时发现， 滇楸（CF）的蛋白质最高， 其次是云台山楸树（CB-1），
老山楸树（CB-2）蛋白质最低， 但云台山楸树与老山楸树两者之间没有显著差异。 利用 SDS-PAGE 电泳技
术对花粉壁蛋白的初步分离， 共分出可辨蛋白带约 30多条， 主要集中在 100 kD 内， 而 3 样品中存在差
异的蛋白质， 包括出现在云台山楸树和老山楸树中的 53.8 kD， 23.4 kD 蛋白； 出现在老山楸树和滇楸中
的 38.5 kD； 出现在云台山楸树和滇楸中的 26.5 kD， 仅出现在云台山楸树中的 35.0 kD 蛋白。 但本研究
仅针对楸树花粉 S 蛋白进行摸索性研究， 电泳分离中获得的各树种特异蛋白是否与楸树自交不亲和有
关， 还要通过蛋白的纯化及分离鉴定等作进一步的研究。
花粉的特异性研究将是自交不亲和性研究中的重要内容， 对其特异性蛋白机制的研究可为人工打破
植物的生殖障碍， 利用远源基因资源和开发新作物育种途径奠定基础。
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