全 文 ：第 30 卷　第 4期
2008 年 7 月
北　京　林　业　大　学　学　报
JOURNAL OF BEIJING FORESTRY UNIVERSITY
Vol.30 , No.4
Jul., 2008
收稿日期:2007--08--20
http: www.bjfujournal.cn , http: journal.bjfu.edu.cn
基金项目:国家自然科学基金项目(30271083)、黑龙江省国际合作项目(WC05C01)。
第一作者:计红芳 ,博士。主要研究方向:食品生物技术。电话:0373-3040107　Email:jhf300@126.com　地址:453003河南省新乡市河南
科技学院食品学院。
责任作者:宋瑞清 ,教授 ,博士生导师。主要研究方向:菌物开发及利用。电话:0451-82190232　Email:songrq@public.hr.hl.cn　地址:
150040哈尔滨市东北林业大学林学院。
绒白乳菇发酵液提取物对杨树叶枯病菌抑菌机理的初步研究
计红芳1　张令文1　宋瑞清2
(1 河南科技学院食品学院　2 东北林业大学林学院)
摘要:为了探明绒白乳菇发酵液提取物对杨树叶枯病菌生长的抑制机理 , 该文研究了该提取物对叶枯病菌菌体生
长过程 、孢子萌发过程及对其体内蛋白质含量与合成的影响。 通过显微观察发现 , 该提取物能使叶枯病菌菌丝部
分膨大 、畸形 、原生质浓缩 ,产生溶壁现象 , 也能使其孢子不萌发或萌发异常 , 而且处理时间越长 , 抑制作用越明显;
与对照相比 ,经提取物处理 48 h 的叶枯病菌菌体的蛋白质含量是对照的 6.7%, 显著降低;经提取物处理过的叶枯
病菌菌体蛋白电泳谱带的颜色 、数目 、位置 ,与对照相比 , 均发生了变化。表明绒白乳菇发酵液提取物能够抑制叶
枯病菌菌体蛋白的生物合成 ,使菌体蛋白不仅含量下降显著 ,而且在表达上也发生了明显变化。
关键词:绒白乳菇;提取物;叶枯病菌;抑制机理
中图分类号:S718.81　　文献标识码:A　　文章编号:1000--1522(2008)04--0146--04
JI Hong-fang1;ZHANG Ling-wen1 ;SONG Rui-qing2.Inhibiting mechanism of the extraction of Lactarius
vellereus fermenting liquid on Alternaria alternata in poplar.Journal of Beijing Forestry University
(2008)30(4)146-149 [ Ch , 14 ref.]
1 School of Food Science , Henan Institute of Science and Technology , Xinxiang , 453003 , P.R.China;
2 College of Forestry , Northeast Forestry University , Harbin , 150040 , P.R.China.
In order to explore the inhibiting mechanism of the extraction of Lactarius vellereus fermenting liquid on
the growth of Alternaria alternata , the effects of the extraction on the mycelia growth , spore germination ,
protein content and synthesis of A.alternata are studied.The results of microscopic examination show that the
extraction could make A.alternata hyphas swollen and abnormal , the protoplasm concentrated and the cell
wall degraded.The spore could not germinate or could germinate abnormally.The inhibitory effects were
increased with prolonged treatment time.The protein content of A.alternata mycelia , which was treated by
the extraction , was 6.7% of the control and was decreased remarkably.Compared with the control , the
protein electrophoresis bands of A.alternata mycelia treated by the extraction were changed in the color ,
number and location.The results indicate that the extraction could inhibit the biosynthesis of mycelia protein ,
so that the content of protein was decreased remarkably and the protein express was also changed obviously.
Key words　Lactarius vellereus;extraction;Alternaria alternata;inhibiting mechanism
　　杨树叶枯病是东北地区近年来较为流行的主要
林木病害之一 ,由链格孢菌(Alternaria alternata)引
起。由于防治过程中大量使用化学药剂 ,已经造成
了严重的环境污染与经济损失 ,所以寻求高效 、安
全 、无污染的绿色生物农药显得尤为迫切。据报道 ,
乳菇属中某些真菌含有多种活性物质 , 在抑菌 、抗
虫 、抗病毒 、抗肿瘤等方面显示出了巨大的开发潜
力[ 1-6] 。迄 今 为 止 , 尚 未见 有 利用 绒白 乳菇
(Lactarius vellereus)中的活性物质进行林业病害防治
的报道。笔者的前期研究表明 ,绒白乳菇发酵液提
取物对杨树叶枯病菌生长具有较强的抑制活性 ,并
且该提取物对叶枯病菌菌体的膜系统有破坏作用 ,
使其电导率及呼吸强度最终呈现下降的变化趋势。
为了进一步弄清该提取物对叶枯病菌生长的抑制机
理 ,本文在此基础上 ,研究了发酵液提取物对叶枯病
菌生长过程及其体内蛋白质含量与合成的影响 ,为
DOI :10.13332/j.1000-1522.2008.04.012
该提取物在林业病害生物防治中的应用奠定科学的
理论基础 。
1　材料与方法
1.1　菌株与培养基
绒白乳菇与杨树叶枯病菌菌株均由东北林业大
学提供。
PDA培养基:马铃薯 200 g ,葡萄糖 20 g ,MgSO4
1.5 g ,NaH2PO4 3 g ,琼脂 20 g ,蒸馏水 1 000 mL , pH
6.0。PD培养基:在 PDA培养基的成分中去除琼脂。
1.2　绒白乳菇发酵液提取物制备
将绒白乳菇菌株接种到 PD 培养基中 , 25℃摇
床(转速为 120 r min)培养 15 d后 ,将菌体滤出后余
为发酵液。按 V(发酵液)∶V(正丁醇)=1∶3萃取 1
次后 ,正丁醇层用 R--201 型旋转蒸发器旋干 ,旋干
后的物质以 10%吐温-80水溶液定容至原发酵液体
积的 1 10 ,为发酵液提取物 。
1.3　光学显微镜观察方法
用直径0.5 cm无菌打孔器 ,切取 PDA培养基上
培养 7 d的叶枯病菌菌片 ,接种到装有 10 mL PD培
养基的培养皿中 ,在 25℃的培养箱中培养 3 d ,长成
直径约为 3 cm的菌片 。将直径约为 3 cm 的菌片 ,
用无菌水洗净 、无菌滤纸吸干水后 ,置于 6 mL 的发
酵液提取物中 ,分别浸泡处理 8 、24 、48 h;将直径约
为3 cm的菌片 ,用无菌水洗净 、无菌滤纸吸干水后 ,
置于 6 mL 的 10%吐温--80水溶液中 ,分别浸泡处理
8 、24 、48 h ,作为对照。将上述提取物的 3个处理及
对照的 3个处理的叶枯病菌菌片取边缘 ,无菌水洗
净后置于载玻片上 ,盖上盖玻片 ,于显微镜下观察并
摄影 。
将提取物与叶枯病菌孢子悬液(3×106 个 mL)
等量混合 ,以凹玻片悬滴法置于纱布保湿的培养皿
中 ,25℃下培养 ,分别于 8 、24 、48 h显微观察(重复 3
次 ,每次 5 个视野),并摄影。将 10%吐温--80水溶
液与叶枯病菌孢子悬液(3×106 个 mL)等量混合 ,
作为对照 ,实验方法同上 ,分别于 8 、24 、48 h显微观
察 ,记录孢子萌发情况 ,并摄影 。孢子萌发抑制率=
(对照萌发率-处理萌发率) 对照萌发率×100%。
1.4　叶枯病菌蛋白含量测定与蛋白电泳条件
蛋白样品制备:将在 PD培养基中培养 3 d的直
径约为 3 cm的叶枯病菌菌片 ,按上述方法 ,用提取
物分别浸泡处理 2 、8 、48 h ,无菌水洗涤冷冻干燥后 ,
取2 g ,加入适量 0.1 mol L pH 7.0的磷酸缓冲液冰
冻研磨 ,8 000 r min离心15min后 ,取上清 ,定容至2
mL ,4℃保存 ,备用。以 10%吐温--80水溶液分别浸
泡处理 2 、8 、48 h的叶枯病菌菌片 ,作为对照 ,实验
方法同上 。
蛋白含量测定采用考马斯亮蓝G-250法[ 7] ,每处
理重复 5次。蛋白电泳采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板
电泳。分离胶浓度为 7%,浓缩胶浓度为 2.5%,点样
量10μL ,电极缓冲液为Tris-Gly(系统 pH 8.3),起始
电压 80 V ,约 1 h后将电压升至 110 V ,恒流约4 h ,待
溴酚蓝指示剂迁移至下端约 2 cm处停止电泳 ,以凝
胶成像分析系统(安玛西亚 ,瑞士)成像 。
1.5　数据处理
采用软件 SPSS11.5进行统计分析 ,结果以平均
数 ±标准误表示 , 差异显著性分析采用 LSD 检
验法 。
2　结果与分析
2.1　发酵液提取物对叶枯病菌生长过程的影响
在光学显微镜下观察发现 , 经提取物处理 8 、
24 、48 h的叶枯病菌菌丝与对照相比 ,形态上发生了
很大的变化。未经处理的菌丝饱满 ,细胞壁光滑 ,原
生质均匀 ,隔膜明显(见图1a ～ c);经提取物处理8 h
的菌丝部分表现为膨大 ,粗细不均匀 ,分隔间距缩
短 ,原生质开始收缩(见图 1d);经提取物处理 24 h
的菌丝局部膨大 ,原生质收缩严重呈颗粒状 ,分隔不
明显 ,部分菌丝的细胞壁不规则凹陷 ,模糊不清(见
图 1e);经提取物处理 48 h的菌丝 ,局部发生溶壁现
象 ,内含物外渗 ,菌丝变得非常透明 ,出现空泡 ,且细
胞壁表面已十分粗糙 ,菌体破坏严重(见图 1f)。
在光学显微镜下观察发现 ,对照孢子萌动正常 ,
8 h时已长出芽管 ,24 h时萌发率为84.61%,至 48 h
时 ,孢子萌发率为 93.85%,萌发后长出的菌丝长且
粗(见图 1g ～ i);提取物处理 8 h 的孢子尚未萌动
(见图 1j),处理 24 h 的孢子大部分也未萌动 ,对孢
子萌发的抑制率为 91.13%, 已萌发的芽管出现扭
曲状 ,孢子萌发畸形(见图 1k),至 48 h时 ,大部分的
孢子仍然未能萌发 , 对孢子萌发的抑制率为
92.71%,与处理24 h的抑制率 91.13%相比 ,差异显
著 ,且已萌发的孢子芽管扭曲 ,萌发异常(见图 1L)。
结果表明 ,发酵液提取物对孢子萌发具有很强的抑
制作用(见表 1)。
2.2　发酵液提取物对叶枯病菌体内蛋白含量及合
成的影响
以考马斯亮蓝 G-250 法测定 ,得到蛋白质浓度
x(mg mL)与吸光度 y 之间线性方程为:y =
0.007 2 x-0.075 5(相关系数 r =0.995 1),由此计
算出提取物处理组 2 、8 、48 h 蛋白质含量分别为
1.19%、0.74%、0.13%,与对照组相比 , 2 h 时含量
稍微下降 ,差异不显著;随着处理时间的延长 ,蛋白
147第 4期 计红芳等:绒白乳菇发酵液提取物对杨树叶枯病菌抑菌机理的初步研究
a.8 h对照的叶枯病菌菌丝;b.24 h对照的叶枯病菌菌丝;c.48 h对照的叶枯病菌菌丝;d.处理 8 h 的叶枯病菌菌丝;e.处理 24 h
的叶枯病菌菌丝;f.处理 48 h的叶枯病菌菌丝;g.8 h对照的叶枯病菌孢子;h.24 h对照的叶枯病菌孢子;i.48 h对照的叶枯病菌
孢子;j.处理 8 h的叶枯病菌孢子;k.处理 24 h的叶枯病菌孢子;L.处理 48 h的叶枯病菌孢子
图 1　提取物对叶枯病菌菌体生长及孢子萌发过程的影响(比例尺=10μm)
FIGURE 1　Effect of the extraction on the mycelia growth and spore germination of A.alternata(bar=10μm)
表 1　提取物对叶枯病菌孢子萌发的影响
TABLE 1　 Effect of the extraction on the spore germination of A.alternata
时间 h 重复
对照组 提取物处理组
孢子
总数 萌发数 萌发率 %
平均
萌发率 %
孢子
总数 萌发数 萌发率 %
平均
萌发率 % 抑制率 %
平均
抑制率 %
8 1 153 110 71.90 71.65±0.74c 139 0 0 0±0b＊ 100 100±0a
2 136 99 72.79 156 0 0 100
3 148 104 70.27 130 0 0 100
24 1 134 109 81.34 84.61±1.64b 130 9 6.92 7.51±0.30a ＊ 91.49 91.13±0.19c
2 128 110 85.94 143 11 7.69 91.05
3 119 103 86.55 139 11 7.91 90.86
48 1 126 119 94.44 93.85±0.35a 124 8 6.45 6.84±0.25a ＊ 93.17 92.71±0.29b
2 118 110 93.22 137 10 7.30 92.17
3 131 123 93.89 118 8 6.78 92.78
注:＊提取物处理组与对照组差异显著(P<0.05);同列间相比 , 有相同字母者差异不显著(P<0.05), 无相同字母者差异显著(P<
0.05)。表 2同此。
质含量逐渐下降 ,48 h 时仅为对照含量的 6.7%,差
异显著(见表2)。从图 2可见 ,对照组3个处理时间
的蛋白条带数目相同 , 共 11 条(R f =0.03 、R f =
0.05 、R f =0.14 、R f =0.17 、R f =0.25 、R f =0.29 、R f =
表 2　提取物对蛋白质含量的影响
TABLE 2　Effect of the extraction on protein content of A.alternata
处理时间 h 对照组 % 提取物处理组 %
2 1.21±0.055c 1.19±0.064a
8 1.47±0.026b 0.74±0.049b＊
48 1.94±0.084a 0.13±0.038c＊
0.41 、R f =0.47 、R f =0.61 、R f =0.67 、R f =0.75),随
处理时间的延长 ,颜色渐深 ,表明随菌体生长 ,蛋白
质含量增加。提取物处理 2 h时的电泳图谱与相应
对照图谱无显著差别;提取物处理 8 h 时的电泳图
谱与相应对照相比 ,颜色变浅 ,第 3条带消失 ,出现
一条 R f 值为 0.51的新带 ,但颜色较浅 、较细;提取
物处理 48 h时的电泳图谱 ,第 1 、2 、4 、6 、7 、11条带仍
然存在 ,但颜色较浅 ,其余条带均消失。结果表明 ,
该提取物能够抑制菌体蛋白的生物合成。
148 北　京　林　业　大　学　学　报 第 30卷　
1.48 h对照;2.48 h处理;3.8 h对照;4.8 h处理;
5.2 h对照;6.2 h处理
图 2　提取物处理叶枯病菌的蛋白电泳图
FIGURE 2　Protein electrophoresis of A.alternata
affected by the extraction
3　结论与讨论
董国日等[ 8] 对鹅膏菌肽类毒素的分离纯化 、毒
性及中毒机理等方面的研究 ,已达到国内领先水平;
Luo 等[ 9] 从红褐乳菇中分离出具有抗真菌活性的倍
半萜烯类物质 ,它对芸薹链格孢菌菌体生长的抑制
率为 68.3%;Liu等[ 10] 对高等真菌的化学成分进行
了较为深入的研究 ,已从石灰锥盖伞的发酵液中分
离出倍半萜烯类物质 ,Shao 等[ 11] 从绒边乳菇中分离
出 pubescenone ,Wang 等[ 12] 从赫红拟口蘑分离出
steryl esters类物质等 。虽然国内学者在毒蘑菇领域
的研究已相当广泛而深入 ,但至今未见有利用毒蘑
菇中的活性物质进行杨树病害防治的相关报道 ,而
利用微生物的活性物质防治植物真菌病害的研究报
道比较多。例如 ,韩立荣等[ 13] 利用 5 株放线菌对 9
种靶标病原真菌的持续抑菌作用进行了研究 ,发现
这5株放线菌对供试的靶标病原真菌呈现出不同程
度的持续抑菌作用 ,经放线菌处理后 ,靶标真菌基内
菌丝不同程度的产生了畸变 、原生质浓缩的现象 ,随
着处理时间的延长畸变程度升高 。王关林等[ 14] 研
究表明 ,芽孢杆菌拮抗蛋白对西瓜枯萎病具有较强
的拮抗作用 ,其抑菌机制主要使病原菌菌丝畸形 ,细
胞质浓缩 ,孢子不萌发或萌发异常 。
本文也得到了与以上研究类似的结论。绒白乳
菇发酵液提取物对杨树叶枯病菌菌体生长及孢子萌
发均具有较强的抑制作用 ,它能使叶枯病菌菌丝局
部膨大 ,原生质浓缩 ,产生溶壁现象 ,内含物发生渗
漏 ,出现空泡 ,也能使其孢子不萌发或萌发异常;该
提取物能够抑制叶枯病菌菌体蛋白的生物合成 ,使
其蛋白质含量显著下降 ,蛋白电泳谱带的颜色 、位置
及数目与对照相比 ,均发生了明显变化 ,这可能是绒
白乳菇发酵液提取物抑制杨树叶枯病菌生长的机理
之一 ,是否存在其他机理还有待于进一步研究揭示 。
参 考 文 献
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(责任编辑　董晓燕)
149第 4期 计红芳等:绒白乳菇发酵液提取物对杨树叶枯病菌抑菌机理的初步研究