全 文 ：基因组学与应用生物学，2013年，第 32卷，第 3期，第 367-371页
Genomics and Applied Biology, 2013, Vol.32, No.3, 367-371
研究报告
Research Report
基于 EST-SSR不同地理的琼枝群体遗传差异研究
胡吟胜 杨文杰 黄勃 * 于淑楠
海南大学海洋学院,海口, 570228
*通讯作者, huangbohb1@163.com
摘 要 为研究不同海域的琼枝群体的遗传差异，试验对海南麒麟菜保护区内 4个地点的琼枝群体进行了
遗传差异分析。结果表明：所用的 5对 EST-SSR引物能扩增获得多态性条带，检测出的观察等位基因数平均
为 3.4个，有效等位基因数平均为 2.006个；琼枝群体的平均基因杂合度(Ave_Het)为 0.489 1，总体期望杂合
度(Exp_Het*)为 0.532 0，观察杂合度(Obs_Het)平均值为 0.623 3；Shannons信息指数在 0.663 8~0.989 6 之
间；遗传分化显示有 20.39%的遗传变异存在于群体之间，79.61%的遗传变异存在于群体之内。上述结果表明
麒麟菜保护区内的琼枝群体存在差异。
关键词 EST-SSR,琼枝,遗传多样性
Research on the Genetic Character in Different Geographical B. gelatinum
Using EST-SSRMarker
Hu Yinsheng Yang Wenjie Huang Bo * Yu Shunan
The Ocean College of Hainan University, Haikou, 570228
* Corresponding author, huangbohb1@163.com
DOI: 10.3969/gab.032.000367
Abstract For the study of genetic differences of Betaphycus gelatinae in different areas, we have comparatively
analyzed the genetic diversity of B. gelatinae in Eucheuma reserve. The results showed that there were 5 SSR
primers amplified with target bands. The numbers of observed and effective alleles were 3.4 and 2.00 6. Average
gene heterozygosity was 0.489 1. The mean expected heterozygosity equaled 0.532 0. The observed heterozygosity
was 0.623 3. Shannon information index is between 0.663 8~0.989 6. Genetic differentiation in 4 populations was
20.39%. About 79.61% of genetic variation was attributed within populations. The above results show that there are
differences between B. gelatinae population.
Keywords EST-SSR, Betaphycus gelatinae, Genetic diversity
基金项目：本研究由海洋公益行业科研专项(201105008-7)、中医药行业科研专项(201207002-03)、国家 863(2012AA10A412-8)
海南大学植物学国家重点学科(071001)、国家自然科技基金项目(41176084)和国家科技支撑计划项目(2009BADB2B0404-02)共
同资助
琼枝(Betaphycus gelatinae)属于红藻门，杉藻目，
红翎菜科，琼枝藻属(Doty and Norris, 1985)。琼枝具不
规则的羽枝，分枝可对生，互生，向四面伸展(匡梅等,
1999)。藻体表面多现紫红色或黄绿色，腹面大部分为
紫红色。琼枝具有食用及药用价值，是生产卡拉胶的
重要热带养殖经济红藻。在国外主要分布在菲律宾东
部、日本琉球冲绳、印尼、澳大利亚，在我国海南岛沿
岸都有分布。
EST-SSR是基于SSR发展起来的一种新型分子
标记技术，反应了基因表达的转录部分。在藻类领域
中，EST-SSR 技术已经被应用于浒苔属海藻(张磊,
2012)、坛紫菜(杨惠等, 2009)、大叶藻(孙典荣等, 2013)和
条斑紫菜(刘必谦等, 2009)的遗传差异研究。琼枝的
相关研究主要集中在养殖(方哲和鲍时翔, 2008)及生
理方面(郑淑贞, 1991)的研究，对琼枝的分子方面的
研究报道比较少。文章利用 EST-SSR技术对海南岛
麒麟菜保护区 4个不同地理上的琼枝群体遗传结构
进行研究，以期对保护区琼枝现状的评价、管理和保
护利用提供有意义的遗传背景数据。
1结果与分析
1.1 4株琼枝基因组 DNA扩增结果
试验用 5个引物将琼枝基因组 DNA进行 PCR
扩增后，将 PCR产物用 3%的琼脂糖凝胶电泳并于
凝胶成像系统下拍照，结果如图 1所示。
1.2聚类图分析
电泳图中，出现电泳条带的记为 1，否则记为 0，
将电泳结果转换成 0、1矩阵后，用 ntsys2.0软件分析
相似性系数并做树状聚类图，结果见图 2。
从聚类图可以看出，在阀值为 0.61 处，所有琼
枝以海域为单位聚为 4 类；在阀值分别在 0.64、
0.78、0.80 和 0.81 处，潮滩鼻、铜鼓岭、三更峙和欧
村的琼枝群体出现分类单元；随着阀值的增大，
4 个海域的琼枝麒麟菜的分类单元越多，但潮滩鼻
海域的琼枝群体分类单元明显其它海域的琼枝群
体要出现得更早，遗传相似性系数比另外 3个琼枝
群体要低。
图 2 36株琼枝聚类分析图
注: 琼枝编号: 1~9: 潮滩鼻; 10~18: 铜鼓岭 ; 19~27: 三更峙 ;
28~36:欧村
Figure 2 The cluster analysis of B. gelatinae
Note: The number of B. gelatinae: 1~9: Chaotanbi; 10~18: Tong-
guling; 19~27: Sangengshi; 28~36: Ocun
图 1琼枝群体 PCR产物电泳图
注: M: DL2000; P1, P2, P3, P4, P5:引物;琼枝编号: 1~9:潮滩
鼻; 10~18:铜鼓岭; 19~27:三更峙; 28~36:欧村
Figure 1 Agarose gel image of PCR product of B.gelatinae
Note: M: DL2000; P1, P2, P3, P4, P5: Primer; The number of B.
gelatinae: 1~9: Chaotanbi; 10~18: Tongguling; 19~27: Sangeng-
shi; 28~36: Ocun
1.3群体间的分化
总群体的近交系数(Fst)、群体内近交系数(Fis)、遗
基于 EST-SSR不同地理的琼枝群体遗传差异研究
Research on the Genetic Character in Different Geographical B. gelatinum Using EST-SSR Marker 368
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
传分化系数(Fst)是反应各亚群间遗传分化的重要指
标，Fst值越大，各亚群间遗传分化越大(Cockerham
and Weir, 1993)。由表 1可以看出，遗传分化系数 Fst
在 0.030 7到 1.000 0之间，平均值为 0.203 9，即平均
有 20.39%的遗传变异存在于群体之间，有 79.61%的
遗传变异存在于群体之内。P4、P5座位的基因流较
大，Nm值在 1以上，平均 Nm值为 0.976 3，小于 1，说
明群体间存在一定的基因流动。
从表 2 可以看到琼枝群体的平均基因杂合度
(Ave_Het)为 0.489 1。总体期望杂合度(Exp_Het*)为
0.532 0，不同琼枝群体的变化范围为 0.423 4到 0.660 0
之间，其中欧村的期望杂合度最低，三更峙的期望杂
合度最高。观察杂合度(Obs_Het)平均值为 0.623 3，4个
琼枝群体的范围在 0.396 4到 0.744 4之间，铜鼓岭群
体和潮滩鼻群体的观察杂合度接近，在 4个群体中比
较大，欧村的观察杂合度最低。
有效等位基因数、Shannons信息指数能反应遗传
多样性。从表 3可看到 4个琼枝群体检测出的有效等位
基因数为 1.9499到 2.5660之间，平均为 2.2280个；观
察等位基因数在 2.4个到 3个之间，平均为 2.6875个；
潮滩鼻琼枝群体 Shannons信息指数最大，为 0.989 6，
表 3平均等位基因与有效等位基因数
Table 3 Average number of alleles and effective number of alleles
群体
Population
欧村
OC
潮滩鼻
CTB
铜鼓岭
TGL
三更峙
SGS
平均数
Mean
观察等位
基因数
Na
2.600 0
3.000 0
2.750 0
2.400 0
2.687 5
有效等位
基因数
Ne
1.949 9
2.566 0
2.282 4
2.113 5
2.228 0
Shannons
信息指数
I
0.663 8
0.989 6
0.861 4
0.695 7
0.802 6
最小的为欧村琼枝群体，为 0.663 8。说明潮滩鼻的遗传
多样性最大，欧村的遗传多样性最小。
2讨论
本实验对 4个海域的琼枝群体进行了遗传结构分
析，结果显示，4个琼枝群体的观察杂合度、期望杂合
度、遗传分化系数、观察等位基因数目、有效等位基因
数目、Shannons信息指数都有不同程度的差异，保护
区内琼枝群体遗传多样性呈现一定的差异。杨文杰
(2012)对野生与养殖琼枝的 EST-SSR分析显示，同一
海域的琼枝群体基本无差异，与本文研究结果不同，分
析原因是杨文杰在每个海域所取的样本量只有 2~4
株，而且有部分是进行无性繁殖的养殖琼枝，造成群体
内无差异结果的可能性较大。
Alpert等(1993)在研究 Frogaria chiloensis种群间
的遗传分化时发现，遗传距离与种群间的空间距离高
度相关，本文对不同地理的琼枝群体分析表明，同一海
表 2琼枝群体的遗传差异 EST-SSR分析
Table 2 Genetic differentiation between B. gelatinae resources by EST-SSR analysis
种源
Provenance
潮滩鼻
CTB
铜鼓岭
TGL
三更峙
SGS
欧村
OC
平均数
Mean
观察纯合度
Obs_Hom
0.380 6
0.255 6
0.266 7
0.603 6
0.376 6
观察杂合度
Obs_Het
0.619 4
0.744 4
0.733 3
0.396 4
0.623 3
总体期望纯合度
Exp_Hom
0.340 0
0.416 8
0.538 6
0.576 6
0.468 0
总体期望杂合度
Exp_Het
0.660 0
0.583 2
0.461 4
0.423 4
0.532 0
基因多样度
Nei
0.601 6
0.544 6
0.435 8
0.386 3
0.492 1
平均基因杂合度
Ave_Het
0.543 4
0.543 4
0.434 8
0.434 8
0.489 1
表 1 F统计量和基因流
Table 1 Summary of F-statistics and gene flow for all loci
座位
Locus
P1
P2
P3
P4
P5
平均数
Mean
群内近交系数
Fis
****
-0.342 1
0.126 5
-0.426 1
-0.460 0
-0.281 6
总群体近交系数
Fit
1.000 0
0.219 4
0.339 1
-0.3 823
-0.3 590
-0.0 203
遗传分化系数
Fst
1.000 0
0.418 3
0.243 3
0.030 7
0.069 2
0.203 9
基因流
Nm
0.000 0
0.347 6
0.777 5
7.885 7
3.364 2
0.976 2
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域的琼枝样品聚类到一起，且遗传差异由南向北逐渐
增大的趋势，地理位置距离越大的点，在遗传差异性上
也越大，与Alpert的研究相似。琼枝遗传差异可能与所
处的海洋环境有关，张钰(2012)对保护区内生态环境调
查显示，在保护区内，由南向北，人类活动逐渐减少，对
琼枝的生境破坏程度减少。由于环境的破坏，导致琼枝
种质资源下降，遗传差异减小。因而，保护区内琼枝的
遗传差异呈现由南向北逐渐增加的趋势。
群体间的分化水平高低与基因流密切相关，
Wright (1931)认为基因流指数 Nm＞1，基因流能防止
不同地区亚群体间发生遗传分化，当 Nm＜1，各亚群
基因流受阻，群体可能出现遗传分化，本研究中，Nm
平均值为 0.976 2，说明保护区内琼枝群体出现遗传分
化现象；遗传分化系数 Fst能反应群体间遗传分化程
度，当 0＜Fst＜0.05时，不存在分化；0.05＜Fst＜0.15时，
中度分化；0.15＜Fst＜0.25时，高度分化(Wright, 1978)，
实验结果显示 Fst平均值为 0.203 9，即有 20.39%的变
异来至于群体间，各群体的遗传分化程度较高，与本
研究基因流显示群体出现遗传分化的结果一致。Fis、
Fit的值为正值时，群体近交程度严重，Fis、Fit的值为
负值时，群体观察杂合度大于期望杂合度，则群体趋
向远交，杂合比例增大(Weir and Cockerham, 1984)，
本文研究的 Fst、Fit的平均值都为负值，群体平均观
察杂合度大于平均期望杂合度，说明琼枝群内杂合体
较多，基因交流频繁，麒麟菜保护区内琼枝有性繁殖
比无性繁殖普遍。
3材料与方法
3.1实验材料
实验材料取自海南省麒麟菜保护区，由北向南分
别是文昌潮滩鼻、文昌铜鼓岭、琼海三更寺及琼海欧
村四个海域。每个海域采样后，用清水漂洗样品，去除
附着的海水及杂质。然后在每个海域的样品中各随机
选出 9株藻体，共选取了 36株藻株进行 EST-SSR研
究。所选的材料经液氮冷冻后，在-70℃条件下保存，
以备 DNA提取。
3.2方法
3.2.1基因组的提取
采用上海泛柯生物科技有限公司生产的 DNA基
因组提取试剂盒(HP Plant DNA Kit D2485-01)按照说
明书稍作修改后，进行琼枝基因组DNA的提取。步骤
如下：取 100 mg研磨成粉末的样品于 1.5 mL的离心
管中，加入 500μLBuffer CPL，65℃水浴 15 min后，加
500 μL氯仿 /异戊醇(24:1)快速混匀 30 s，10 000 g离
心 1 min后吸取 300 μL上清液到套有收集管的硅胶
柱中，再加入 150 μL Buffer CXD和 300 μL无水乙
醇，混匀后 10 000 g离心 1 min，将硅胶柱换装到另一
个收集管中，加入 650 μL SPW进行洗涤，10 000 g离
心 1 min后将硅胶柱转移到一个新的 1.5 mL离心管
中，加入 50~100 μL的 Elution Buffer，65℃水浴 3 min，
10 000 g离心 1 min，离心管中所得的液体即为基因组
DNA提取液。
3.2.2 PCR扩增
本文所用 5条引物序列为：
1：5-AATGTTCGACGATCTCA-3，
5-CTCTTATGCGGCCAAGTA-3；
2：5-ATGTCGCCAGGCAGTCAG-3，
5-CCAACACGCCCAT CCATC-3；
3：5-ATGTCGCCAGGCAGTCAG-3，
5-GCTTGGCTGAGCTACACG-3；
4：5-TCGGAGTTGGGTTGTGAT-3，
5-GAAAGGCAGCCAGAGCAT-3；
5：5-CTTTGCTTGCTGGGCTGAC-3，
5-GGGAACAATGGACGAGGC-3。
PCR 条件参考赵素芬等 (2008)研究与琼枝同
科的卡帕藻属的条件并做简单修改，反应总体系为
20 μL，其中 10μL 2×PCRMix、1 μL模板、Primer-F
和 Primer-R引物各 1μL，剩下加入超纯水补足体积至
20μL。PCR扩增条件为：94℃预变性 5min，之后进行
30个循环，每个循环 94℃变性 45 s，46~55℃退火 45 s，
72℃延伸 1 min，最后 72℃延伸 10 min，4℃保存。取
5 μL PCR产物与 1 μL上样缓冲液混匀后，在 100 V
电压下 3%琼脂糖凝胶电泳电泳 50 min后，在凝胶
成像系统下拍照保存。
3.2.3数据处理
用 POPGENE软件(Yeh et al., 1999)计算观察杂合
度、期望杂合度、遗传分化系数、观察等位基因数目、有
效等位基因数目和 Shannons信息指数等参数，并用
ntsys2.0软件作聚类分析。
作者贡献
胡吟胜是试验主要完成人，参与前期引物的筛
选、DNA的提取、PCR及数据分析，论文的撰写；杨
文杰参与引物的设计及前期试验指导；于淑楠协助
试验的顺利完成；黄勃为指导老师，参与实验过程中
基于 EST-SSR不同地理的琼枝群体遗传差异研究
Research on the Genetic Character in Different Geographical B. gelatinum Using EST-SSR Marker 370
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
的全程指导。
致谢
感谢海洋公益行业科研专项(201105008-7)、中医
药行业科研专项(201207002-03)、国家 863(2012AA1-
0A412-8)、海南大学植物学国家重点学科(071001)、
国家自然科技基金项目(41176084)和国家科技支撑
计划项目(2009BADB2B0404-02)对本研究的资助；
感谢黄勃老师对本研究的指导及关心。
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