全 文 ：工 艺 技 术
2013年第2期
Vol . 34 , No . 02 , 2013
动态超高压微射流技术在三叶青叶黄酮
的提取中的应用
孙 永，李红艳，刘小如，邓泽元*
（南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌 330047）
摘 要：研究动态超高压微射流技术对三叶青叶黄酮得率的影响。以单因素实验为基础，选取乙醇浓度、提取温度、提
取时间、动态超高压微射流均质压力为主要因素进行研究，通过Box-Behnken中心组合设计和响应面分析法优化三叶
青叶黄酮的提取工艺。 经响应曲面优化后三叶青叶黄酮提取的工艺条件为：乙醇浓度75%、提取温度70℃、提取时间
1.5h、动态超高压微射流均质压力120MPa。 此时，三叶青叶黄酮得率为3.49%。
关键词：动态超高压微射流，三叶青叶，黄酮
Application of the dynamic high-pressure microfluidization technology
in Radix Tetrastigmae leaves flavonoids extraction
SUN Yong，LI Hong-yan，LIU Xiao-ru，DENG Ze-yuan*
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China）
Abstract：The effect of dynamic high-pressure microfluidization treatment on the yield of Radix Tetrastigmae
leaves flavonoids were studied in this paper. Based on the experiment of single factor，Box -Behnken and
response surface methodology were used to optimize the extraction processing parameters and investigate the
effects of the following four factors on extraction rate of flavonoids：dynamic high-pressure microfluidization
pretreatment pressure，ethanol concentration，extraction temperature and extraction time. The optimal extraction
processing parameters were microfluidization pressure 120MPa，aqueous ethanol concentration 75%，extraction
temperature 70℃ and extraction time 1.5h. Under these conditions，the yield of flavonoids was 3.49%.
Key words：dynamic high-pressure microfluidization；Radix Tetrastigmae leaves；flavonoids
中图分类号：TS201.2 文献标识码：B 文 章 编 号：1002-0306（2013）02-0273-04
收稿日期：2012－09－17 * 通讯联系人
作者简介：孙永（1987-），男，硕士，研究方向：食品卫生与安全。
基金项目：江西省科技厅2012年科技支撑项目（20121BBF60041）。
三叶青（Radix Tetrastigmae）为葡萄科植物三叶
崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanum Dielset Gilg）的块
根或全草，为我国特有珍稀植物 [1]。分布于我国浙、
赣、闽、粤、川、云、黔等省区 [2]，可活血止痛、祛风化
痰、清热解毒，用于肺炎、高热惊厥、哮喘、咽痛、肝
炎、瘰疬、月经不调、风湿等症。三叶青提取物有消炎
镇痛、抗病毒等作用，广泛应用于民间治疗病症[3-5]。
据报道，三叶青的化学成分主要为黄酮类化合物、还
原糖、淀粉、氨基酸、甾类化合物等[6]。而三叶青叶片
的的化学成分的报道相对较少，其主要含有黄酮类化
合物和花青素类[7]。作为一种新兴的超微细化技术，
动态超高压微射流技术能对物料产生强烈剪切、高
速撞击、高频振荡、压力瞬间释放等一系列的综合作
用，从而导致细胞破碎，与此同时对活性成分几乎没
有影响，并且能起到很好的超细化和均一化效果[8]。
目前，动态超高压微射流技术被用于灭菌[9]、多糖提
取[10]、蛋白质改性[11-12]及淀粉改性[13-14]。运用动态超高
压微射流技术来提取黄酮的研究相对较少。本实验采
用响应面法优化动态超高压微射流技术提取三叶青
叶黄酮的工艺条件，提高三叶青叶黄酮的得率，为全
面开发和利用三叶青这一珍稀物种提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
三叶青 中国三叶青育苗基地提供，60℃干燥，
粉碎后过200目筛；芦丁标准品（纯度≥95%） 中药
固体制剂制造技术国家工程研究中心；其余试剂 均
为国产分析纯。
M-700微射流均质机 美国Microfluidics公司；
GY50-6S高压均质机 上海华东高压均质机厂；
722G可见分光光度计 上海精科仪器有限公司；
METTLER-TOLEDO AL104电子分析天平 梅特勒-
托利多仪器（上海）有限公司；DFY-500摇摆式高速
万能粉碎机 温岭市林大机械有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 芦丁标准曲线的绘制 准确称取芦丁标准品
5mg，溶解于95%乙醇中，再移入50mL容量瓶并用乙
醇定容至刻度，得到浓度为0.1mg/mL的芦丁标准液。
分别吸取标准液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL置
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DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2013.02.022
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于10mL比色管中，并用95%乙醇加至5mL，加入5%
的NaNO2溶液0.5mL，摇匀，放置6min后，加入10%
的Al（NO3）3溶液0.5mL，摇匀，放置6min后，加入4%的
NaOH溶液4mL，摇匀，放置15min，以试剂作空白参比
液，在510nm处测定其吸光度，以芦丁质量浓度（C）
为横坐标、吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线。
1.2.2 三叶青叶黄酮提取的流程 三叶青叶粉末→
60℃烘干（12h）→乙醇浸润（过夜）→高压预均质（30MPa，2次）
→动态超高压微射流均质→乙醇冷凝回流提取（70℃，2次，合
并提取液）→离心→抽滤→测定吸光度→计算黄酮得率。
1.2.3 三叶青叶黄酮得率的计算 取0.5mL提取液，
按照1.2.1的方法测定其在510nm下的吸光度，按照下
式计算黄酮的得率。
黄酮得率（%）=黄酮质量（g）
样品质量（g）×100
1.2.4 单因素实验 乙醇浓度，提取温度、时间、次
数，微射流均质压力、次数及料液比为影响三叶青叶
黄酮得率的因素。通过考察文献并结合前期研究，确
定液料比为22mL/g，提取次数为两次。本实验主要研
究乙醇浓度、提取温度和时间、微射流均质压力和次
数五个因素对三叶青叶黄酮得率的影响。
1.2.5 响应面实验设计 以单因素实验为基础，根
据Box-Behnken的中心组合原理设计四因素三水平，
选择乙醇浓度、提取温度和时间、微射流均质压力为
自变量，并以X1、X2、X3、X4来表示，以-1、0、1代表不同
变量水平进行编码[15]。实验因素水平及编码见表1。
2 结果与分析
2.1 芦丁标准曲线
芦丁标准曲线回归方程：A=6.7657C+0.0009，
R2=0.9997，线性范围：0~0.05mg/mL，在此范围内其吸
光度值与浓度呈良好的线性关系。
2.2 单因素实验
2.2.1 乙醇浓度对三叶青叶黄酮得率的影响 分别
称取5.00g三叶青叶粉末，按液料比22mL/g加入分
别为50%、60%、70%、80%、90%浓度的乙醇，浸泡过
夜，经30MPa预均质后，立刻在100MPa微射流压力
下处理2次，70℃水浴提取1.5h，提取两次。
由图1可知，三叶青叶黄酮得率随着乙醇浓度的
上升而增大，并且在乙醇70%时达到最大值；随着浓
度的继续上升，黄酮得率缓慢下降，其原因可能是当
乙醇浓度大于70%，叶绿素等脂溶性杂质溶出影响
黄酮类物质的溶解。因此，选择乙醇浓度为70%较
合适。
2.2.2 提取温度对三叶青叶黄酮得率的影响 提取温
度选择50、60、70、80、90℃，以70%乙醇提取，其余条
件同2.2.1。
由图2可知，三叶青叶黄酮得率随着提取温度的
上升而增加，且能显著影响三叶青叶黄酮得率。但当
温度超过70℃后，黄酮得率随着温度的上升而缓慢
下降，其原因可能是三叶青叶黄酮中的某些活性成
分被氧化分解。因此，选择提取温度为70℃较合适。
2.2.3 提取时间对三叶青叶黄酮得率的影响 提取
时间选择0.5、1、1.5、2、2.5h，以70%乙醇提取，其余条
件同2.2.1。
由图3可知，三叶青叶黄酮得率随着时间的延长
先增加而后趋于平缓，在1.5h内时，黄酮得率升高较
快，而超过1.5h后，黄酮得率变化不大。因此，选择提
取时间为1.5h较合适。
2.2.4 微射流均质压力对三叶青叶黄酮得率的影响
微射流均质压力选择60、80、100、120、140MPa，以
70%乙醇提取，其余条件同2.2.1，并与普通提取和
30MPa预均质后提取比较。
由图4可知，相对于普通提取和高压预均质后提
取，微射流均质后提取使得三叶青叶黄酮得率随着
因素 -1 0 1
X1乙醇浓度（%） 60 70 80
X2提取温度（℃） 60 70 80
X3提取时间（h） 1 1.5 2
X4微射流均质压力（MPa） 80 100 120
表1 实验因素与水平编码表
Table 1 Factors and levels of experiments
图1 乙醇浓度对黄酮得率的影响
Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction rate
of flavonoids
乙醇浓度（%）
50 60 70 80 90
3.3
3.2
3.1
3.0
2.9
2.8
2.7
2.6
2.5
2.4
黄
酮
得
率
（
%）
图2 提取温度对黄酮得率的影响
Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction rate
of flavonoids
提取温度（℃）
40 50 60 70 80 90
3.4
3.2
3.0
2.8
2.6
2.4
2.2
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
黄
酮
得
率
（
%）
图3 提取时间对黄酮得率的影响
Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of flavonoids
提取时间（h）
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
3.2
3.0
2.8
2.6
2.4
2.2
2.0
黄
酮
得
率
（
%）
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均质压力的上升而显著提高，其原因可能是均质压
力越大细胞破碎程度越高，从而导致黄酮类物质更
完全的溶出。黄酮得率在压力为100MPa时达到最大
值。而后随着均质压力的上升黄酮得率趋于平缓且
略微下降。因此，微射流均质压力100Mpa时，黄酮得
率最大。
2.2.5 微射流均质次数对三叶青叶黄酮得率的影响
微射流均质次数选择1、2、3、4、5次，以70%乙醇提
取，其余条件同2.2.1。
由图5可知，三叶青黄酮得率开始时随着均质次
数缓慢上升随后趋于平缓，但变化不大。因此，选择
微射流均质次数为2次较合适。
2.3 响应曲面优化实验的结果与分析
2.3.1 响应面优化实验结果 响应面优化实验设计
及结果见表2。通过SAS v9.2软件对实验数据进行回
归分析，根据Box-Behnken的中心组合设计原理，四
因素三水平实验的取值见表1，共有27个实验，实验
号1~24为析因实验，后面3个为中心实验。其中析因
点为自变量取值在X1、X2、X3、X4所构成的三维顶点，
零点为区域的中心点，零点实验重复3次，用以估计
实验误差。
2.3.2 拟合模型的建立 对实验数据经回归拟合
后，得到X1（乙醇浓度）、X2（提取温度）、X3（提取时间）
和X4（微射流均质压力）与Y（三叶青叶黄酮得率）之
间的回归方程为：
Y=3.216667+0.0125X1+0.053333X2+0.018333X3+
0.3125X4-0.0825X12-0.05X1X2-0.06X1X3+0.0375X1X4-
0.11125X22+0.025X2X3+0.005X2X4-0.11375X32-0.05X3X4-
0.005X42。
2.3.3 方差分析 对三叶青叶黄酮得率进行响应曲
面回归分析，其结果见表3。
由表3可知，各因素对三叶青叶黄酮得率的影响
为：微射流均质压力＞提取温度＞提取时间＞乙醇浓
度。本模型的p＜0.0001，说明该模型具有高度的显著
性。本实验中X4（微射流均质压力）的一次项对三叶
青叶黄酮得率呈极显著水平，X2（提取温度）的一次
项呈显著影响。X1（乙醇浓度）、X2（提取温度）、X3（提
取时间）的二次项呈显著影响。而X1、X2、X3、X4四者之
间的交互作用影响不显著。同时，该模型的R2=0.9588，
且模型误差显著、失拟误差不显著，变异系数（CV=
2.285）较小，说明此模型能够较好的拟合实际实验。
因此，可用该模型代替实验真实点对结果进行分析
和预测。
2.3.4 最佳条件的确定及验证性实验 通过SAS软
件分析得到微射流均质提取三叶青叶黄酮的最佳条
件为：乙醇浓度75%、提取温度70℃、提取时间1.5h、
微射流均质压力120MPa，在此条件下三叶青叶黄酮
得率的理论预测值为3.52%。然后，按照上述条件做3
次平行实验进行验证，得到三叶青叶总黄酮得率的
平均值为3.49%。与理论预测值3.52%相比误差仅为
0.03%，因此，采用响应曲面法得到的最佳条件具有
实用价值。
3 结论
本实验研究了动态超高压微射流对三叶青叶黄
实验号 X1 X2 X3 X4 Y 黄酮得率（%）
1 -1 -1 0 0 2.86
2 -1 1 0 0 3.03
3 1 -1 0 0 3.11
4 1 1 0 0 3.08
5 0 0 -1 -1 2.67
6 0 0 -1 1 3.48
7 0 0 1 -1 2.81
8 0 0 1 1 3.42
9 -1 0 0 -1 2.84
10 -1 0 0 1 3.42
11 1 0 0 -1 2.74
12 1 0 0 1 3.47
13 0 -1 -1 0 2.88
14 0 -1 1 0 2.90
15 0 1 -1 0 3.01
16 0 1 1 0 3.13
17 -1 0 -1 0 3.00
18 -1 0 1 0 3.12
19 1 0 -1 0 3.07
20 1 0 1 0 2.95
21 0 -1 0 -1 2.83
22 0 -1 0 1 3.33
23 0 1 0 -1 2.89
24 0 1 0 1 3.41
25 0 0 0 0 3.21
26 0 0 0 0 3.20
27 0 0 0 0 3.24
表2 响应面实验设计和实验结果
Table 2 Experimental design and result of response surface
图4 微射流均质压力对黄酮得率的影响
Fig.4 Effect of microfluidization pretreatment pressure on
extraction rate of flavonoids
压力（MPa）
0 20 40 60 80 100 120 140 160
3.4
3.2
3.0
2.8
2.6
2.4
2.2
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
黄
酮
得
率
（
%）
图5 微射流均质次数对黄酮得率的影响
Fig.5 Effect of microfluidization pretreatment number on
extraction rate of flavonoids
均质次数
1 2 3 4 5
3.2
3.0
2.8
2.6
2.4
黄
酮
得
率
（
%）
275
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酮得率的影响。通过响应曲面法确定了微射流均质
热醇提取三叶青叶黄酮的最佳条件：乙醇体积75%、
提取温度70℃、提取时间1.5h，微射流均质压力
120MPa、微射流均质次数2次、液料比22mg/mL、提取
次数2次。此时，三叶青叶黄酮得率为3.49%。
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203.
方差来源 自由度DF 平方和SS 均方MS F值 p值Pr>F 显著性
X1 1 0.001875 0.001875 0.379054 0.5496
X2 1 0.034133 0.034133 6.900463 0.0221 *
X3 1 0.004033 0.004033 0.815387 0.3843
X4 1 1.171875 1.171875 236.9086 <0.0001 **
X12 1 0.0363 0.0363 7.338481 0.0190 *
X1X2 1 0.01 0.01 2.02162 0.1805
X1X3 1 0.0144 0.0144 2.911133 0.1137
X1X4 1 0.005625 0.005625 1.137161 0.3072
X22 1 0.066008 0.066008 13.34438 0.0033 *
X2X3 1 0.0025 0.0025 0.505405 0.4907
X2X4 1 0.0001 0.0001 0.020216 0.8893
X32 1 0.069008 0.069008 13.95086 0.0028 *
X3X4 1 0.01 0.01 2.02162 0.1805
X42 1 0.000133 0.000133 0.026955 0.8723
模型 14 1.381508 0.098679 19.94918 <.0001 **
一次项 4 1.211917 0.302979 61.25088 <.0001 **
二次项 4 0.126967 0.031742 6.416959 0.0053 *
交互项 6 0.042625 0.007104 1.436193 0.2790
残差 12 0.059358 0.004947
失拟项 10 0.058492 0.005849 13.49808 0.0709
误差项 2 0.000867 0.000433
总和 26 1.440867
R2=0.9588 RMSE=0.070332 C.V.=2.285141
表3 三叶青叶黄酮得率的二次响应面模型和回归分析
Table 3 ANOVA of quadratic polynomial model for extraction rate of flavonoids
注：**表示极显著，p＜0.01；*表示显著，即p<0.05。
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