全 文 ：Vol. 31 No.3
Sep. 2013
第 31卷 第 3期
2013年 9月
经 济 林 研 究
Nonwood Forest Research
收稿日期：2013-03-02
基金项目：国家林业公益性行业科研专项（201304701-1）；自治区十二五科技重大专项（201130102-1）；新疆自治区果树学重点学科基金项目。
作者简介：黄少勇（1984—），男，广西桂平人。硕士研究生，主要从事植物分子标记方面的研究。
通讯作者：李 疆（1958—），男，湖南邵东人。教授，博士研究生导师，主要从事果树育种与种质资源方面的研究。E-mail：lijiangxj@163.com。
山 核 桃 Carya cathayensis Sarg. 为 胡 桃 科
Juglandaceae，山核桃属 Carya Nutt.，是中国特有
的一种木本油料和干果树种，其种下无品种 [1]，
山核桃属植物适应能力强、用途多，含油率高，
果品营养丰富、有很好的医疗保健作用，是重要
的木本油料树种和干果树种，也是珍贵的用材树
种，在中国广为种植 [2]。同时，山核桃树体高大，
枝叶繁茂 ,根系发达 ,固土力强 ,是经国家林业局
认定的经济和生态兼用型树种 [3]。山核桃属植物
在我国主要有 5个种，浙江山核桃 C. cathayensis
Sarg是浙江省的主要经济林树种之一 [4]。近年
来，人们生活水平不断提高，对山核桃的需求量
不断上升。我国是山核桃原产地，栽培历史悠
久，但其相关研究报道尤其在分子水平上的研究
山核桃 EST-SSR 引物的筛选及通用性分析
黄少勇 1,2，张智俊 2，罗淑萍 1，李 疆 1
（1.新疆农业大学，新疆 乌鲁木齐 830052；2.浙江农林大学 亚热带森林培育国家重点实验室培养基地，
浙江 临安 311300）
摘 要：为了研究核桃 EST序列的通用性以及山核桃的遗传多样性，从 NCBI数据库的核桃 EST序列中设计了
20对引物，并从中筛选出 6对，对 24份山核桃以及 27份核桃样品进行分析，共检测到 46个位点，其中多态性
位点 41个。利用 Popgen32软件对 6组引物进行分析。结果表明，观察等位基因数（Na）平均为 1.869 6，有效
等位基因数（Ne）平均为 1.623 4，基因多样性指数（H）平均为 0.344 7，Shannon信息指数（I）平均为 0.502 3。
采用 UPGMA法进行聚类分析，在相似系数为 0.73时所有样品可明显区分为 2个类群，说明由核桃 EST筛选出
的 EST-SSR引物具有较好的通用性，可用于山核桃遗传分析、系统分类以及品种鉴定。
关键词：山核桃；EST-SSR；遗传多样性
中图分类号：S664.1 文献标志码：A 文章编号：1003—8981(2013)03—0010—06
Screening and universal analysis of EST-SSR primers in Carya cathayensis
HUANG Shao-yong1,2, ZHANG Zhi-jun2, LUO Shu-ping1, LI Jiang1
(1. Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, Xinjiang, China; 2. State Key Laboratory Cultivation Base of
Subtropical Silviculture, Zhejiang Agriculture and Forestry University, Lin’an 311300, Zhejiang, China)
Abstract: In order to study universality of EST sequences and genetic diversity of Carya cathayensis, 20 pairs of
primers were designed from walnut EST sequences in the NCBI database, and then 6 pairs were selected out. 24 pecans
samples and 27 walnut samples were analyzed. A total of 46 sites were detected, including 41 polymorphic sites. Six
pairs of primers were analyzed by using Popgen32 software. The results show that the observed number of alleles (Na)
is an average of 1.869 6, the effective number of alleles (Ne) is an average of 1.623 4, the Nei’s gene diversity (H) is an
average of 0.344 7, and Shannon information index (I) is an average of 0.502 3. The results of clustering analysis by
using UPGMA method show that those samples can be divided into two groups when the similarity coeffi cient is 0.73.
The EST-SSR primers selected have good universality, and can be used for C. cathayensis genetic analysis, classifi cation
and cultivar identifi cation.
Key words: Carya cathayensis Sarg.; EST-SSR; genetic diversity
DOI:10.14067/j.cnki.1003-8981.2013.03.015
11第 31卷 经 济 林 研 究
报道甚少。为了更好地开发利用山核桃资源，
获得更高的经济效益，非常有必要对其进行相关
的遗传学研究。目前，针对山核桃的研究较多采
用以下几种分子标记技术：扩增片段长度多态性
（amplifi ed fragment length polymorphism，AFLP）
[5-6]， 随 机 扩 增 多 态 DNA（random amplifi ed
polymorphic DNA，RAPD）[7-8]，微卫星间隔片段
多态性（inter-simple sequence repeat，ISSR）[9]，
序列相关扩增多态性（sequence-related amplifi ed
polymorphism，SRAP）[4]。但是对山核桃进行相
关的 EST-SSR研究的报道较为鲜见，仅有宋双等
[10]基于山核桃脂肪代谢相关 cDNA文库设计了 34
对引物，并对天然群体山核桃 40个样品进行了初
步的应用性试验，但是该研究需要构建 cDNA文
库。本试验中从 NCBI上搜寻核桃的 EST序列，
根据这些序列进行引物设计，既避免了构建 cDNA
文库的麻烦，又获得较好的扩增效果。简单重复序
列（simple sequence repeat, SSR）又称为微卫星序
列，是指以少数几个核苷酸为单位多次串联重复的
DNA序列 [11]。SSR又可分为基因组 SSR和 EST-
SSR，表达序列标签微卫星（EST-SSR）是一种基
于EST的简单重复序列设计的一种新型分子标记，
尽管不同植物开发的 EST序列中 SSR分布的频率
差异较大，但其中 2%～ 5%序列中均含有 SSR，
随着生物学技术的发展和试验成本的降低，公共
数据库 EST数量的急速增加，为植物 EST-SSR的
开发提供了丰富的极有价值的可利用资源 [12]。由
于 EST来源于编码 cDNA，通常其序列保守性程
度较高，已有很多研究表明 EST标记在家族和种
属间的通用性较高 [13]。故本研究中拟通过核桃属
的EST序列设计引物，对山核桃进行多态性研究，
检验及筛选引物，以期为山核桃种质资源评价开
发更好更有效的引物，为后期的杂交育种亲本的
选配、遗传图谱构建等工作提供资料。
1 材料与方法
1.1 材 料
本研究中采用的 24份山核桃样品采自浙江省
临安市，27份核桃样品采自新疆鄯善县。
1.2 方 法
1.2.1 引物设计
目前，在 NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
genomes/PLANTS/PlantList）网站上可搜寻到 5 213
条核桃的 EST序列，将这些序列进行初步的筛选
后（去掉冗长序列），利用Websat在线软件（http://
wsmartins.net/websat/）进行引物设计，再将设计好
的引物序列交由上海生物工程科技有限公司合成，
设计的 20对引物序列的信息详见表 1。
表 1 20对EST-SSR引物序列†
Table 1 20 pairs of EST-SSR primer sequences
引物代号
Primer
code
登录号
Accession
No.
重复序列
Repeated
sequence
片段大小
Fragment
size
正向引物
Forward prim ers (5’-3’)
反向引物
Reverse primers (5’-3’)
退火温度
Annealing
temperature /℃
1 GI|52124666 (GAA)6 324 TCAGAAAACCCTAATCCGTTTC AAGAACCCGTATGTTCCTTCTC 58.6
2 GI| 52127478 (AGAA)5 387 GAGAAACTGCTAGGGAAGGACA CTTGATTGCAGAAAACCAACTG 59.8
3 GI|52127494 (TCGTCT) 4 330 AAGCAAAGCAGAGATGAAGGAT GGTTTGTGGGTGTTGTTACTGA 59.5
4 GI|52127428 (GA)10 329 TCTCTCTCTTTCTCGAACCCAC TACTTCTCTGACGCTGCCAATA 59.9
5 GI|52127395 (AGA)7 289 CGTCGAGTATGTCAGTTTCAGG AATAGGTACAGGGTCGATGGTG 59.7
6 GI|52127327 (CT)29 303 CTAAAGACCAGGAGAAGCAGGA GAA TCAATAGAATTTGCCACGC 60.0
7 GI|52127140 (TC)11 188 AGAGTTGCAGCGTTAGCGTAT ACCTTTTCGGTTTGTTCTTCAG 59.2
8 GI|52126966 (AG)10 379 TCCGATACACAATACTCGAAACC TGAGTCGGTGACAGCTAGAAAA 60.0
9 GI|52126582 (CT)9 130 TGGCCTACCATCTCTCTCTCTC A TTCCCACACCATATTTCCTTG 59.9
10 GI|52126492 (AG)9 368 GCAAGCAATCAAAGCAAAAGTC GTTCAAGTGTTCGTTCCTCCAC 60.9
11 GI|52126439 (TGAGAA)3 193 GGACTTCCACCA ATCAAGAAAG TCAGTTCCCATGTCCTCAAAAT 59.9
12 GI|52126280 (CGC)7 229 CCAAATCCTTCTCAAATTCTGG AGCTGATAACCTCCTTCCCTTC 60.0
13 G I|52126124 (CT)9 310 CGGGGATTCTTTTCTTCTTTC ATCATCTTCAAAGGGTCTGCTC 59.1
14 GI|52125948 (CAGCAA)3 187 GTGGCTTCTGGAACTCCTACAG CAGTCGTTTGCTCAATTTCTTG 59.9
15 GI|52125860 (CAG )9.67 306 GTATCCTCCAACAACAGCAACA GCTCACTTTCTTCTAGCTTCCG 59.8
16 GI|52125729 (AGAGCG)3 317 CCGGGGATCGGCCATTAC GCCATCGAAATCTGCTTGAGGT 64.8
17 GI|52125451 (AGA)8 264 CAAAGAAGACCCAAGAACATAGC AGTTCCCTTTCAGAGCACACTT 59.3
18 GI|52125328 (TTC)8 304 GGAAAGGGATTTGAGGAGAGAT GAAGAGGAGGAAGAAGAGGAGG 59.9
19 GI|52125149 (ACTCAG)3 306 AATCTGCTCCAAATGCAGTCTT GTTTCTCAATACCACGCTTTCC 60.0
20 GI|52124892 (GA)10 243 CCTGTGCCTTTGAGAGATATGA TGATAGAATGTTGGCAGTGGAG 59.3
† 15号引物组合的重复序列出现“(CAG)9.67”这种情况是由于该引物中包含另外一组引物 (CAACAG)4。
The repeats sequence “(CAG) 9.67” of the 15th primer is due to the primer contains another set of primer (CAACAG)4.
12 第 3期黄少勇，等：山核桃 EST-SSR引物的筛选及通用性分析
1.2.2 基因组 DNA提取
每份材料采 4～ 5片幼叶，用硅胶干燥保存。
基因组 DNA的提取采用改良的 CTAB法，参照
Doyle[14]的方法稍作修改。具体操作如下。
（1）取少量研磨好的样品倒入离心管中，样
量为覆盖管底即可，加入预热（65 ℃）的溶液Ⅰ
600 μL（具体配方见表 2），充分混匀，再加 B-
巯基乙醇 12 μL，4 ℃，12 000 r/min离心 5 min，
弃上清。
表 2 溶液I的配方†
Table 2 Formula of the solution I
编号
No.
药品名称
Reagent name
药品量
Reagent dosage / g
浓度
Concentration
1 葡萄糖 6.940 0.350 mol/L
2 Tris-HCl 1.200 0.100 mol/L
3 EDTA 0.186 0.005 mol/L
4 PVP 2.000 2%
† 溶液总体积为 100 mL。Total volume of solution is 100 mL.
（2）加入预热（65℃）CTAB提取液 600～
800 μL，加入 B-巯基乙醇 12 μL，上下颠倒混匀，
65 ℃水浴 35 min，每隔 10 min左右温和混匀 1次。
（3）4 ℃，12 000 r/min离心 10 min，取上清
约 600 μL装入新离心管中，再加入预冷的氯仿异
戊醇 600 μL，缓慢摇匀至乳浊状。
（4）4 ℃，12 000 r/min离心 10 min，取上清
转入新的离心管中，加入等体积的氯仿异戊醇，
并加入 5 mol/L的醋酸钠 200 μL，摇匀至乳浊状。
（5）4 ℃，12 000 r/min离心 10 min，取上清。
可根据离层情况重复上一步骤，若不重复上一步
则加入 2倍体积的预冷的冷无水乙醇，然后加入
3 mol/L的醋酸钠 200 μL。
（6）4 ℃，12 000 r/min离心 10 min，弃上清，
防止将沉淀倒出，将液体倒净，然后加入 75%的乙
醇约 500 μL，使沉淀悬浮，常温下放置 2～ 3 min。
（7）短暂离心后弃上清，晾干 2～ 3 min，
加入 50 μL ddH2O，在－ 20 ℃下保存备用。
提取出的样品 DNA经过 UV-2401PC微量紫外
/可见分光光度计测定吸光度后，根据 OD260/OD280
值判断其纯度，然后将每份样品 DNA 稀释为
50 ng/μL，再取每份样品各 10 μL用 1%琼脂糖凝
胶进行电泳检测，之后于－ 20 ℃保存备用。
1.2.3 PCR产物扩增
20对 EST-SSR引物中进行混合 DNA样品的
筛选之后，将多态性较好的引物组合进行 PCR扩
增。PCR扩增仪为 Gene Amp PCR System 9700，
电泳仪为 BIO-RAD POWER PAC3000，电泳槽为
北京市六一仪器厂 DYCZ-30C。EST-SSR反应体
系为 20 μL，包括 2×EasyTaq PCR SuperMix（北
京全式金生物技术有限公司）10 μL，上下游引物
各 1 μL，模板 DNA 1 μL。扩增条件为：94 ℃预
变性 5 min；94 ℃变性 45 s，54 ℃退火 45 s，72 ℃
延伸 45 s，运行 35个循环；之后 72 ℃充分延伸
7 min。最后 4 ℃保存。
1.2.4 电泳和银染
PCR产物用 6%聚丙烯酰胺凝胶在 160 V电
压下电泳 1 h。然后进行银染，银染液的配制及操
作方法根据 Panaud等 [15]的方法进行改良。10%
酒精与 0.5%冰乙酸混合液固定 12 min，水洗；1%
硝酸银进行染色 15 min，水洗；1%硫代硫酸钠浸
泡凝胶 30 s以上，水洗；1.5%氢氧化钠（2.5 mL/L
甲醛）显影至条带清晰。银染后拍照并用保鲜膜
保存好凝胶，将电泳图上清晰的条带记为“1”，
同一位置有带记为“0”，带型不清或数据缺失
记为“－”，获得“0/1”数据矩阵。计算每对引
物扩增位点的多态性信息量（PIC，polymorphism
information content）[16]。
1.2.5 数据统计分析
使用NTSYS-pc[17]生物学统计软件导入矩阵，
获得遗传相似系数矩阵，按 UPGMA方法进行聚
类作图。并利用 Popgen32[18]软件进行多态性数据
分析。
2 结果与分析
2.1 扩增结果分析
以 24份山核桃和 27份核桃的 DNA为模板，
用设计合成的 20对引物进行筛选，共获得了 6对
多态性较好的扩增引物，见表 3。
采用 6对引物组合进行 PCR的扩增，条带清
晰，扩增片断的长度范围为 100～ 2 000 bp（见图
1、图 2）；共检测出 46个位点，其中多态性位点
数为 41个，每对引物的多态位点百分率在 75%～
100%之间，平均多态性位点百分率为 89.45%。引
物扩增位点的多态性信息量（PIC，polymorphism
information content）在 76.01% ～ 90.01% 之间，
平均为 83.64%，证明基于核桃 ESTs数据开发的
SSR引物有很好的通用性，可用于山核桃的遗传
分析。
利用 Popgen32软件对 0/1矩阵进行运算，
获得的多态性数据显示，观测等位基因数平均为
1.869 6个，有效等位基因数为 1.623 4，Nei基因
多样性为 0.344 7，香农指数 I为 0.502 3。
13第 31卷 经 济 林 研 究
表 3 6对EST-SSR引物序列的扩增结果
Table 3 Result of 6 pairs of EST-SSR primer sequences amplification
引物代号
Primer
code
扩增总位点数
Total number
of amplifi ed
sites
多态位点数
Number of
polymorphic
sites
多态位点百分率
Percentage of
polymorphic
sites /%
多态性信息量
Polymorphism
information
content (PIC) /%
观测等位基因数
Observed number
of alleles (Na)
有效等位基因数
Effective number
of alleles(Ne)
Nei基因多样性
Nei’s gene
diversity (h)
香农指数
Shannon’s
information
index (I)
3 8 7 87.5 84.62 1.875 0 1.580 5 0.327 2 0.482 7
5 6 5 83.3 76.01 1.666 7 1.331 6 0.196 1 0.302 1
6 7 7 100 85.05 2.000 0 1.959 9 0.489 4 0.682 5
15 6 6 100 79.46 2.000 0 1.594 3 0.355 7 0.535 8
16 11 10 90.9 90.01 2.000 0 1.782 8 0.429 5 0.617 7
18 8 6 75.0 86.70 1.625 0 1.393 4 0.222 2 0.330 5
总计 Total 46 41 － － － － － －
平均Mean 7.67 6.83 89.45 83.64 1.869 6 1.623 4 0.344 7 0.502 3
图 1 24份山核桃 PCR结果
Fig. 1 PCR results of 24 samples in C. cathayensis
图 2 27份核桃 PCR结果
Fig. 2 PCR results of 27 walnut samples
14 第 3期黄少勇，等：山核桃 EST-SSR引物的筛选及通用性分析
2.2 聚类分析
使用 NTSYSpc生物统计学软件计算山核桃与
核桃个体间的遗传相似系数，按 UPGMA法进行
聚类分析，得到聚类树形图（见图 3）。结果表明，
在相似系数 0.73时，山核桃与对照普通核桃可以
很好地区分开，表明引物的有效性较好，亦能较
好地反映出种属间的差异。
图 3 51份材料的 EST-SSR数据 UPGMA聚类图
Fig. 3 UPGMA dendrogram of EST-SSR data from 51 samples
3 结论与讨论
本研究从 NCBI数据库中获得了 6对在核桃
属间具有较好通用性的引物组合。在试验中发现，
6对引物组合能将核桃与山核桃很好地区分开来，
也能较好地进行山核桃内部分类。
（1）EST-SSR标记的通用性以及多态性 作
为基因的一部分，EST-SSR侧翼序列在物种间高度
保守，因此 EST-SSR引物可在物种之间通用 [19]。
虽然 EST的保守性在一定程度上限制了 EST标记
的多态性，但是仍然有少量引物的多态性较高，
而且其属间的通用性较好，EST-SSR分子标记又
是一种较为快速有效且成本低廉的技术。近年来，
随着 EST数据库的不断丰富，EST-SSR技术得到
更多的应用。尤其在植物中，郑丽珊等 [20]对棉花
SSR分子标记在香蕉中的通用性进行了研究，157
对多态性引物共扩增到 1 188个条带，平均 7.6个；
引物的多态信息含量范围在 0.58～ 0.91之间。廖
娇等 [21]研究发现，基于猕猴桃 EST序列而筛选的
SSR引物在柑橘类植物中具有一定的通用性。姚
利华 [22]利用苹果属开发的 EST-SSR引物对梨属的
4个种或品种中扩增出目的产物的有 72对，其中
多态性引物 40对，又随机选取 8对在 24个梨属
植物的种或品种上进行了扩增，所选引物在这些
材料上均扩增出了与在苹果属上大小相似的预期
产物，一共产生了 59个等位基因 ,平均每对引物
7.375个，揭示了它们之间较近的亲缘关系。本研
究中平均扩增条带数为 7.67，与上述研究的扩增
结果相似。引物多态性信息含量为 83.64%，与郑
丽珊等人的研究结果吻合。
（2）山核桃资源的遗传多样性 本研究结果
初步表明，EST-SSR适用于山核桃的遗传多样性
分析，同时表明山核桃与普通核桃的相似性较低，
相似度仅为 0.50，证明它们之间的遗传距离较远。
但是山核桃属内相似性较高，相似度为 0.73～
0.96。将山核桃属内各样品进行聚类分析，结果表
明，样品 L1与其它样品的差异最大，此外其它样
品可以很明显地分为 I和 II 2个类群（见图 3）。
假设试验结果没有较大误差，样品 L1遗传差异大
的原因可能是样品本身序列非常特殊，应该对其
进行测序，然后与其它山核桃的序列进行对比。
从目前的研究现状来看，运用 EST-SSR标记
对山核桃进行遗传多样性和系统分类的相关报道
较少，本研究中利用生物信息学数据挖掘工具，
从 NCBI数据库中胡桃属 EST序列中开发设计引
物，经试验验证通用性良好，操作简单，成本低廉。
下一步将利用本研究所筛选出的 EST-SSR标记引
物对不同种源的山核桃群体进行分析，进一步为山
核桃进行品种鉴定以及资源保护提供可靠的依据。
（3）试验方法对结果的影响 在试验方法中，
不同的方法对试验结果影响也各不相同。如基因
15第 31卷 经 济 林 研 究
组的提取，本研究中采用了 DNA混合池的方法，
与邵俊培等 [23]的方法相似，即将所有样品的 DNA
各取少量混合进行引物组合的筛选。这样做不仅
可以节约时间，而且不必消耗大量的试验材料，
还可以获得较好的试验结果。在DNA提取方法上，
本研究采用改良的 CTAB法，获得较好的 DNA样
品。梁玉琴等 [24]研究发现，常规 CTAB法提取
DNA质量低，分别采用改良 CTAB法和植物基因
组 DNA提取试剂盒 2种方法，改良 CTAB法能够
获得高浓度的 DNA。在引物设计方法上，较多学
者采用 SSRHunter软件，如齐建勋等 [25]以及吴硕
等 [26]，而本研究中采用Websat在线软件进行引物
设计，虽然方法不同，但是获得的引物组合效果
也较好，而且该软件简单易用，设计耗费的时间
较短。
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[本文编校：闻 丽 ]