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山苍子精油对白纹伊蚊的生物活性及其成分分析



全 文 :28(4)521-527 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2012 年 11 月

收稿日期:2011-12-04
基金项目:湖南省自然科学基金重点项目(12JJ2017);湖南省教育厅高等学校科学研究重点项目(10A132);中南林业科技大学人才引进基
金(104-0202)
作者简介:陈飞飞(1983−),男,硕士研究生,Email: cfifi@163.com;∗通讯作者,博士,教授,Email: pengyh999@163.com。


山苍子精油对白纹伊蚊的生物活性及其成分分析
陈飞飞1, 2,彭映辉1*,晏许超3,林 海3,曾冬琴1, 2,张 云1
(1. 中南林业科技大学生命科学与技术学院,长沙 410004;2. 海南省林业科学研究所,海口 571100;3. 国家家用杀虫用品质量监督检验中心,
益阳 413000)
摘要:研究了山苍子Litsea cubeba果实精油对白纹伊蚊Aedes albopictus成蚊的驱避活性和对其幼虫的毒杀活
性;采用GC-MS定性分析了精油的化学成分,并定量分析了其中 9 种活性成分。结果如下:在 1.5 mg·cm−2的
涂抹剂量下,山苍子精油对白纹伊蚊的 100% 保护时间为 3.70 h,对白纹伊蚊 4 龄期幼虫的 24 h 毒杀
LC50值为 82.48 µg·mL−1。定性分析共鉴定出 17 种化合物,其中E-柠檬醛的相对含量最高,其峰面积百分比
为 44.65%,其它相对含量较高的成分分别是Z-柠檬醛(34.60%)、柠檬烯(11.70%)、甲基庚烯酮(2.28%)、
芳樟醇(1.28%)等。定量分析 9 种活性成分在精油中的总含量为 238.70 mg·mL−1,其中E-柠檬醛 106.20
mg·mL−1、Z-柠檬醛 68.79 mg·mL−1、桉叶油素 40.90 mg·mL−1的含量较高。研究结果表明,山苍子精油对白纹
伊蚊具有良好的成蚊驱避和幼虫毒杀活性,这些生物活性与精油的化学成分密切相关。
关 键 词:山苍子精油;白纹伊蚊;生物活性;化学成分
中图分类号:Q946;Q969.44 文献标识码:A 文章编号:1005-9261(2012)04-0521-07
Chemical Components and Bioactivity of Essential Oil Derived from
Litsea cubeba against Aedes albopictus
CHEN Feifei1,2, PENG Yinghui1*, YAN Xuchao3, LIN Hai3, ZENG Dongqin1,2, Zhang Yun1
(1. College of Life Science and Technology, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004; 2. Hainan
Forestry Institute, Haikou 571100; 3. National Household Insecticide Products Quality Supervision and Inspection
Center, Yiyang 413000, China)
Abstract: The repellent and larvicidal activities of the essential oil extracted from Litsea cubeba fruit against Aedes
albopictus were investigated. The main volatile chemical components of L. cubeba oil were qualitatively studied
and 9 volatile components were quantitatively analyzed by GC-MS. At the concentration of 1.5 mg·cm−2, 100%
protection period provided by essential oil of L. cubeba against Aedes albopictus was 3.70 h in the laboratory. LC50
of the essential oil for the fourth instars of A. albopictus was 82.49 µg·mL−1 at 24 h. Seventeen chemical components
were identified in the essential oil, E-citral being the largest fraction (44.65%), followed by Z-citral (34.60%),
limonene (11.70%), 6-Methyl-5-hepten-2-one (2.28%) and Linalool (1.28%). Nine volatile components with a total
contents of 238.70 mg·mL−1 were quantitatively analyzed. The main active ingredients in the oil are E-citral (106.20
mg·mL−1), Z-citral (68.79 mg·mL−1) and 1,8-cineole (40.90 mg·mL−1). These results demonstrate that the essential
oils extracted from L. cubeba fruit have a high larvicidal activity and remarkable repellent activity against
mosquitoes, which are closely connected with the chemical components of the essential oil.
Key words: Litsea cubeba essential oil; Aedes albopictus; bioactivity; chemical composition

DOI:10.16409/j.cnki.2095-039x.2012.04.013
522 中 国 生 物 防 治 学 报 第 28 卷
目前,化学灭蚊剂面临抗药性和生态环境方面的双重压力,而植物源蚊虫驱杀剂具有对环境友好、无
毒或低毒、易降解等优点。已知多种植物精油具有驱避或杀灭蚊虫的作用[1,2],但是由于大多数的植物精油
资源有限,一直未能得到实际应用。山鸡椒(又名山苍树)Litsea cubeba (Lour.) Pers. 为樟科Lauraceae木
姜子属Litsea落叶灌木,其果实称山苍子。我国山苍子资源极其丰富,是世界上最大的山苍子油生产和输
出国,年产量达 4000 t,出口量达 3500 t。山苍子精油广泛应用于调味品、化妆品、医药等领域,有研究
表明山苍子精油具有抑菌杀虫作用[3,4],但目前尚无有关山苍子精油对蚊虫驱杀活性的系统研究报道。本文
系统研究山苍子精油对白纹伊蚊成蚊的驱避活性和对其蚊幼虫的毒杀活性,并探讨其活性成分,为充分利
用山苍子资源开发植物源蚊虫驱杀剂提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 植物精油提取
采用水蒸汽蒸馏法从山苍子新鲜果实中提取精油。取 300 g 山苍子新鲜果实放入 1000 mL 圆底烧瓶
中,加入 500 mL 蒸馏水,蒸馏 4 h,精油保存于棕色瓶中,用无水硫酸钠干燥,4 °C冷藏备用。山苍子
精油为浅黄色至黄色澄清液体,具柠檬醛香气,强烈持久。测得山苍子果实精油密度为 0.89 g·mL−1,获得
率为 3.2%(油/鲜重)。
1.2 蚊虫饲养
根据曾冬琴等[5]的方法饲养白纹伊蚊Aedes albopictus (Skuse)。
1.3 驱避活性测试方法
在实验室条件下(房间大小为 5 m × 5 m × 3 m,蚊笼规格 30 cm × 30 cm × 25 cm,投放成蚊 200 头,
室内温度为(26±2)℃,湿度为 70%±5%,根据中华人民共和国国家标准“农药登记用卫生杀虫剂室内
药效试验及评价-驱避剂(GB/T 13917.9-2009)”测试精油的 100%保护时间及驱避率[6]。皮肤涂抹精油
的剂量为 1.5 mg·cm−2,以 15%的避蚊胺(diethyltoluamide, DEET)作为阳性对照,空白对照不涂抹药剂。
每隔 30 min 观察一次,记录蚊子第 1 次停落的时间,以上次测试时间为 100%保护时间,持续至保护百分
率降至 50%,试验设 5 次重复,分别从每天的 6:00、10:00、14:00、18:00、22:00 开始进行。
100%有效保护时间指从涂抹精油开始,至观察到第 1 头蚊虫停落或攻击为止的那段时间,试验数据
取每个重复中 4 个测试者的平均值。驱避率计算公式如下[7]:
驱避率(%)=(C-T)/C×100%,其中 C 为空白对照组暴露皮肤上停落或叮咬的蚊虫数;T 为处
理组暴露皮肤上停落或叮咬的蚊虫数。
1.4 对白纹伊蚊幼虫毒杀活性的测试方法
参照WHO[8]的标准,在实验室内测试山苍子精油对白纹伊蚊 1~5 龄期幼虫和蛹的毒杀活性,测试温
度(26 ± 2)℃。称取 100 mg 山苍子精油充分溶解于 2 mL 99.5%的酒精中,用去氯水定容至 100 mL 的
容量瓶中,配成 1000 µg·mL−1的毒杀母液。根据预试验结果确定检测山苍子精油对白纹伊蚊幼虫和蛹的毒
杀LC50和LC95值所需的浓度梯度(见表 1)。用去氯水将毒杀母液稀释成所需浓度梯度,取各个浓度的山
苍子精油溶液 25 mL 置于 50 mL 三角瓶中,分别放入龄期一致大小相似的试虫 20 头,试验期间不喂食,
24 h后记录死亡幼虫的数目。试验设 5 个重复,取每个处理组中所对应浓度的酒精溶液做对照试
表 1 山苍子精油对白纹伊蚊幼虫和蛹的毒杀LC50/LC95值所需的浓度梯度
Table 1 Concentrations of Litsea cubeba essential oil for test LC50/LC95 values to different instar of Aedes albopictus
幼虫龄期 Instar 精油浓度(µg·mL−1)Oil constration
1 10 15 20 25 30
2 20 25 30 35 40
3 30 40 50 60 70
4 40 60 80 100 120
蛹 Pupae 70 90 110 130 150
第 4 期 陈飞飞等:山苍子精油对白纹伊蚊的生物活性及其成分分析 523
验。24 h 校正死亡率计算公式:
校正死亡率(%)=(处理死亡率-对照死亡率)/对照死亡率×100%
1.5 山苍子精油化学成分分析方法
1.5.1 定性分析 山苍子精油挥发性组分采用GC-MS法(气相色谱-质谱联用仪:Gas Chromatography-Mass
Spectrometry)分析,测试仪器为Agilent 6890 GC和 5973 MS系统,弹性石英毛细柱(HP-5 MS,30 m ×250
μm×0.25 μm)。将山苍子精油用乙酸乙酯(色谱纯)稀释 2000 倍,混匀准备进样。升温程序:柱温在 40
℃保持 1 min,然后以 20 ℃·min−1的速度升温至 100 ℃,保持 2 min;再以 20 ℃·min−1的速度升温至 220
℃,保持 2 min,最后以 20 ℃·min−1的速度升至 280 ℃,保持 5 分钟。色谱参数:载气为高纯氦,总流
速 40 mL·min−1,柱内流速 1.1 mL·min−1,进样口温度 250 ℃,进样量 1 μL。GC和MS接口温度 270 ℃。
质谱条件:电子轰击能量 70 eV,离子源温度 230 ℃,扫描质量范围(m/z)15~500 amu。采用Wiley275
标准谱库进行检索。
1.5.2 定量分析 使用外标法对山苍子精油中的所含的以下成分进行定量分析,以下标样及实验药品均
为 Sigma 公司产品。α-蒎烯 α-pinene(纯度≥98%),β-蒎烯 β-pinene(纯度≥99%),柠檬烯
1-Limonene(纯度≥97%),桉叶油素 1,8-cineole(纯度≥99%),芳樟醇 Linalool(纯度≥99%),
莰烯 Camphene(纯度≥95%),月桂烯 Myrcene(纯度≥95%),Z-柠檬醛 Z-Citral(纯度≥98%),
E-柠檬醛 E-Citral(纯度≥98%),乙酸乙酯(色谱纯≥99.9%)。根据预实验结果各标样所需的浓度范
围,采用乙酸乙酯作为溶剂,将标样配成溶液,配成的溶液校正浓度如表 2 所示。依照选择离子质量数进
行检测,得到其峰面积与浓度之间的线性关系方程。
表 2 标样浓度梯度及其选择离子质量数
Table 2 Concentration gradient and extracted ion chromatograph ion of standard samples
浓度梯度Concentration gradient (µg·mL−1) 样品名称
Standard sample
离子质量数
EIC Ion 1 2 3 4 5 6
α-蒎烯 α-pinene 93 0.0097 1.96 19.72 98.91 197.82 397.78
β-蒎烯 β-pinene 93 0.0097 1.96 19.72 98.92 197.84 397.84
柠檬烯 Limonene 68 0.0097 1.96 19.72 98.92 197.84 397.84
桉叶油素 1,8-cineole 43 0.0097 1.96 19.72 98.92 197.84 397.84
芳樟醇 Linalool 71 0.0097 1.96 19.72 98.92 197.84 397.84
莰烯 Camphene 93/121 0.0098 0.99 4.93 19.72 49.46 99.46
月桂烯 Myrcene 93/121 0.0097 0.98 4.91 19.65 49.30 99.13
Z-柠檬醛 Z-citral 41/69/109 0.0097 0.98 49.46 98.95 395.67 696.22
E-柠檬醛 E-citral 41/69/109 0.0195 1.96 98.88 197.82 791.02 1391.88
1.6 数据统计分析
采用Excel软件分析山苍子精油对白纹伊蚊驱避效果,统计 6 h 内山苍子精油和 15%的DEET对白纹
伊蚊的百分保护率;用配对样本 T 检验来分析精油的有效保护时间;采用 SPSS16.0 软件对毒杀数据进
行分析,通过概率分析得出毒力回归方程、LC50/LC95值以及Pearson模型拟合优度等检验。
2 结果与分析
2.1 山苍子精油对白纹伊蚊成蚊的驱避效果
1.5 mg·cm−2剂量的山苍子精油对白纹伊蚊的 100%保护时间为(3.70±0.12)h,与阳性对照比较,山
苍子精油对白纹伊蚊驱避效果略低于 15%的DEET(表 3)。从图 1 可以看出,山苍子精油对白纹伊蚊有
趋避作用,6 h 后仍然有超过 60%的趋避率。
2.2 山苍子精油对白纹伊蚊幼虫和蛹的毒杀活性
山苍子果实精油对白纹伊蚊幼虫和蛹表现出很强的毒杀活性,24 h 后观察死亡幼虫和蛹,虫体稍弯,

524 中 国 生 物 防 治 学 报 第 28 卷
头尾呈灰黑色,中段泛黄;死亡蚊蛹身体松弛,颜色无明显变化,而毒杀处理后存活的蚊蛹虫体深黑,体
型比对照组明显偏小(表 4)。
表 3 山苍子精油对白纹伊蚊成蚊驱避效果
Table 3 Repellent activity of Litsea cubeba oil against Aedes albopictus at the dose of 1.5 mg·cm−2
95%置信限区间 95% confidence interval 药剂
Herbicides
100%保护时间 (h)
100% protection times 置信区间下限 LCI 置信区间上限 UCI
T 值 T value
山苍子精油 Litsea cubeba oil 3.70 ± 0.12 3.70 4.70 36.37 a
15%DEET 4.04 ± 0.13 3.76 4.33 31.10 b
注:表中数据为平均值±标准差;同列中不同小写字母表示 0.05 水平差异显著。
Note: Data are presented as mean±SD; Data in the same column are significant difference at 0.05 level.

图 1 6 h 内山苍子精油和 15%的 DEET 对白纹伊蚊的百分保护率
Fig. 1 Percentage protections of Litsea cubeba oil and 15% DEET against Aedes albopictus in 6 h
表 4 山苍子精油对白纹伊蚊 4 龄期幼虫和蛹 24 h 的毒杀活性
Table 4 Larvicidal activities of Litsea cubeba oil against larvae and pupae of Aedes albopictus
95%置信限区间 95% confidence interval 幼虫龄期
Larval instar
毒力回归方程
Regression equation of
toxicity
LC50
(µg·mL−1 )
LC95
(µg·mL−1 ) 置信区间下限
LCI ( LC50)
置信区间下限
LCI ( LC95)
置信区间上限
UCI ( LC50)
置信区间上限
UCI ( LC95)
χ2
1 Y=-2.651+0.113X 23.50 38.08 21.06 33.07 26.59 48.72 0.993*
2 Y=-4.557+0.142X 32.19 43.81 30.09 34.52 40.17 50.73 0.965**
3 Y=-2.332+0.045X 52.11 88.86 45.83 76.21 59.04 119.78 1.011**
4 Y=-2.243+0.027X 82.48 142.96 71.87 123.72 93.58 183.82 0.356**
蛹 Pupae Y=-2.996+0.024X 122.92 190.41 111.78 137.89 165.90 247.96 0.093**
注:*和**分别代表 0.05 和 0.01 水平差异显著性。Note: * and ** represent significantly different at 0.05 and 0.01 level.
2.3 山苍子精油的化学成分
2.3.1 定性分析 精油化学成分及各成分的相对含量见表 5。共检测出 17 种化合物,其中相对含量最高的
化合物是 E-柠檬醛,其峰面积百分比为 44.65%,其他依次为 Z-柠檬醛、柠檬烯、甲基庚烯酮、芳樟醇等。
2.3.2 定量分析 精油中 9 种活性成分的选择离子检测结果见表 6,检测到的选择离子峰面积与标样浓
度呈很好的线性关系,确定性系数在 0.9992 至 0.9999 之间。得到的回归方程可用于精油内组分进行定
量分析。分析计算结果如下:山苍子精油中 9 种活性成分含量分别为E-柠檬醛 106.20 mg·mL−1,Z-柠
檬醛 68.79 mg·mL−1,桉叶油素 40.90 mg·mL−1,苧烯 6.15 mg·mL−1,芳樟醇 5.91 mg·mL−1,α-蒎烯 5.28
mg·mL−1,月桂烯 3.06 mg·mL−1,莰烯 1.34 mg·mL−1,β-蒎烯 1.09 mg·mL−1(表 7)。这 9 种成分在山苍
子精油中的总含量为 238.7 mg·mL−1,山苍子精油的密度为 890.0 mg·mL−1,因此这 9 种成分所占山苍子
精油的质量百分比 26.8%。
第 4 期 陈飞飞等:山苍子精油对白纹伊蚊的生物活性及其成分分析 525
表 5 山苍子精油化学成分 GC-MS 分析
Table 5 Chemical composition of the essential oil extracted from the fruits of Litsea cubeba analysed by GC-MS
化合物 Components 保留时间 Retain time (min) 分子式 Molecular formula 相对含量 Percent in total (%) 匹配度 Qual
α-蒎烯 α-pinene 5.356 C10H16 0.85% 96
莰烯 Camphene 5.570 C10H16 0.18% 98
桧烯 Sabinene 5.807 C10H16 0.06% 93
甲基庚烯酮 6-Methyl-5-hepten-2-one 5.878 C8H14O 2.28% 96
β-蒎烯 β-pinene 5.912 C10H16 0.62% 96
月桂烯 Myrcene 5.945 C10H16 0.57% 96
柠檬烯 Limonene 6.566 C10H16 11.70% 98
1,8-桉叶油素 1,8-Cineole 6.643 C10H18O 0.62% 98
芳樟醇 Linalool 7.584 C10H18O 1.28% 97
香茅醛 Citronellal 8.514 C10H18O 0.23% 95
丙酸芳樟酯 Linalyl propionate 9.444 C13H22O2 0.45% 91
橙花醇 Nerol 9.945 C10H18O 0.56% 86
Z-柠檬醛 Z-citral 10.280 C10H14 34.60% 96
香叶醇 Geraniol 10.451 C10H18O 0.66% 94
E-柠檬醛 E-citral 10.896 C10H14 44.65% 95
香叶酸 Geranic acid 12.498 C10H16O2 0.32% 87
丁香烯环氧物 Caryophyllene oxide 18.176 C15H24O 0.36% 91
表 6 9 种活性成分标样 GC-MS 的选择离子检测结果
Table 6 Results of selected ion monitoring of 9 standard samples analysed by GC-MS
保留时间 RT (min) 标样 Standard sample 选择离子质量数 EIC Ion 回归方程 Regression equation 确定性系数 R2
5.37 α-蒎烯 α-pinene 93 Y = 3.7971E-06X+1.312 0.99988
5.94 β-蒎烯 β-pinene 93 Y = 2.458E-06X-1.548 0.9992
6.61 柠檬烯 Limonene 68 Y = 3.009E-06X-1.099 0.9999
6.68 桉叶油素 1,8-cineole 43 Y = 7.976E-06X+1.243 0.9999
7.62 芳樟醇 Linalool 71 Y = 5.085E-06X-3.473 0.9992
5.58 莰烯 Camphene 93/121 Y = 2.596E-06X+0.673 0.9994
5.96 月桂烯 Myrcene 93/121 Y = 3.503E-06X+0.479 0.9998
10.31 Z-柠檬醛 Z-citral 41/69/109 Y = 1.198E-05X+6.407 0.9995
10.95 E-柠檬醛 E-citral 41/69/109 Y = 1.032E-05X+10.530 0.9997
注:X 为峰面积,Y 为化合物的含量。Note: X: Peak area,Y: Concentration.
表 7 选择离子检测法分析山苍子精油中 9 种活性成分的含量
Table 7 Concentrations of 9 bioactivity components in Litsea cubeba oil analyzed with selected ion monitoring by GC-MS
保留时间 RT (min) 标样 Standard sample 分子式 Molecular formula 峰面积 Peak area 含量 Concentration (mg·mL−1)
5.356 α-蒎烯 α-pinene C10H16 1044322 5.28
5.912 β-蒎烯 β-pinene C10H16 1071472 1.09
6.566 柠檬烯 Limonene C10H16 13927158 6.15
6.643 桉叶油素 1,8-cineole C10H18O 615427 40.90
7.584 芳樟醇 Linalool C10H18O 1844890 5.91
5.570 莰烯 Camphene C10H16 255365 1.34
5.945 月桂烯 Myrcene C10H16 736170 3.06
10.280 Z-柠檬醛 Z-citral C10H14 52072982 68.79
10.896 E-柠檬醛 E-citral C10H14 92702185 106.20

526 中 国 生 物 防 治 学 报 第 28 卷
3 讨论
国内外很多研究机构都把研究植物源蚊虫驱杀剂作为重要课题,已研究发现部分植物精油对蚊虫具有
明显的驱避作用,如Trongtokit等[9]发现草地花椒Zanthoxylum limonella的精油以 0.1 mL·30cm−2 剂量涂抹皮
肤,其驱避埃及伊蚊的 100%保护时间为 2 h;Kamsuk等[10]报道了胡椒状花椒Zanthoxylum piperitum精油对
蚊虫的驱避活性,以 0.1 mL·30cm−2 的剂量涂抹皮肤,其对埃及伊蚊的驱避 100%保护时间是 1.5 h。猫薄
荷Nepeta catana精油是一种具有较强驱蚊效果的植物精油,在 23 µg·cm−2 和 468 µg·cm−2 涂抹剂量下对白
纹伊蚊的 100%保护时间分别是 1 h 和 4 h[11]。相比之下,山苍子精油在 1.5 mg·cm−2 的剂量下驱避白纹
伊蚊的 100%保护时间为 3.70 h,其驱蚊效果比前两种精油要强,略低于猫薄荷精油,在试验期间及试验
后的 2 个月内测试者皮肤并未感觉任何不适(未发表资料)。因此,山苍子精油极具开发成蚊虫驱避剂
的潜力。
蚊幼虫随龄期增高对山苍子精油的耐受性增强,表现为龄期越高半数致死浓度LC50也相应提高,蛹的
LC50值最高。因此,控制水体蚊害选择在幼虫生活力弱、抵抗力差的低龄期将更加经济有效。山苍子精油
安全无毒,而且对蚊幼虫的毒杀活性较强,是开发植物源灭蚊剂的好材料。
山苍子精油中含有多种成分被报道对蚊虫具有驱避或毒杀作用。如其中的桉叶油素、柠檬醛、芳樟醇、
β-蒎烯、柠檬烯、莰烯和α-蒎烯被报道对蚊虫都有一定的驱避效果[12,13],β-蒎烯和月桂烯对白纹伊蚊具有
毒杀活性[14]。这 9 种活性成分在山苍子精油中的含量为 238.7mg·mL-1,所占山苍子精油的质量百分比高
达 26.8%,因此山苍子精油具有良好的蚊虫驱杀活性。
近年来,我国有不少关于植物精油驱杀蚊虫活性的报道,如唇形科植物石香薷Mosla chinensis [15]、广
藿香Pogostemon cablin [16]、迷迭香Rosmarinus officinalis [17]对白纹伊蚊成蚊具有较好的驱避活性;石香薷、
广藿香以 及芸香科 Rutaceae 植物一摸香 Zanthoxylum beecheyanum [18] 、 椿叶花 椒 Zanthoxylum
ailanthoides[19],伞形科Umbelliferae植物野胡萝卜Daucus carota [20]等精油,菊科Asteraceae植物万寿菊
Tagetes erecta[21]和马兜铃科Aristolochiaceae植物辽细辛Asarum heterotropoidesc var. mandshuricum[22]提取
物对白纹伊蚊或淡色库蚊幼虫均表现出一定的毒杀活性,然而将这些植物材料开发成植物源蚊虫驱杀剂面
临的最大障碍是资源不足,不能满足工厂化生产的需要。山苍子精油不但对蚊虫驱杀效果好且具有得天独
厚的资源优势,将其开发成植物源蚊虫驱杀剂,对缓解目前化学灭蚊剂所面临的抗药性和生态环境方面的
双重压力具有重要意义,既能带来较大的经济效益,又可产生显著的社会效益。
参 考 文 献
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