全 文 :西北农业学报 2015,24(1):156-160
Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica doi:10.7606/j.issn.1004-1389.2015.01.027
网络出版日期:2015-01-20
网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20150120.0920.004.html
蛇莓杀蚊幼活性成分初步分离与鉴定
收稿日期:2014-03-11 修回日期:2014-03-26
基金项目:国家“863”计划(2011AA10A202-1)。
第一作者:于冬冬,男,在读硕士,从事植物源农药研究。E-mail:yudongdong308@163.com
通信作者:张 兴,男,教授,博士生导师,主要从事农药学与植物保护学研究。E-mail:zhxing1952@126.com
于冬冬1,闫 合1,吴 华1,冯俊涛1,2,张 兴1,2
(1.西北农林科技大学 无公害农药研究服务中心,陕西杨凌 712100;2.陕西省生物农药工程技术研究中心,陕西杨凌 712100)
摘 要 为明确蛇莓[Duchesnea indica (Andr)Focke]中杀蚊幼活性成分,以淡色库蚊(Culex pipiens pal-
lens)和白纹伊蚊(Aedes albopictus)3龄幼虫为试虫,采用活性跟踪法,对蛇莓乙醇提取物进行活性成分分离、
鉴定和活性测定。从蛇莓乙醇提取物乙酸乙酯相中得到2个具有杀蚊幼活性的化合物,鉴定为齐墩果酸和芹
菜素。浸渍法测定表明,乙酸乙酯萃取相对淡色库蚊和白纹伊蚊3龄幼虫LC50值分别为459.12和438.09
mg/L,正丁醇相为471.41和430.81mg/L,显示较好的杀蚊幼活性,且乙酸乙酯相和正丁醇相差异性不显
著;齐墩果酸对淡色库蚊和白纹伊蚊3龄幼虫24h处理LC50值分别为25.36和22.31mg/L,芹菜素对淡色
库蚊和白纹伊蚊3龄幼虫24h处理LC50值分别为31.29和27.22mg/L。
关键词 蛇莓;杀蚊幼活性;淡色库蚊;白纹伊蚊;活性成分
中图分类号 S482.3+9 文献标志码 A 文章编号 1004-1389(2015)01-0156-05
Isolation and Identification of Larvicidal Constituents from
Duchesnea indica(Andr)Focke against Mosquito
YU Dongdong1,YAN He1,WU Hua1,FENG Juntao1,2 and ZHANG Xing1,2
(1.Research &Development Center for Biorational Pesticide,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100,China;
2.Research Center for Biopesticide Technology&Engineering,Shaanxi Province,Yangling Shaanxi 712100,China)
Abstract In order to study larvicidal activities of Duchesnea indica(Andr)Focke against mosquito,
the 3rd instar larvae of Culex pipiens pallens and Aedes albopictus were used to screen insecticidal
components from alcoholic extract of Duchesnea indica (Andr)Focke by bioassay-guided fractiona-
tion.Two compounds were isolated and identified in ethyl acetate extracts as oleanolic acid and apige-
nin.Based on ethyl acetate extracts and n-butanol against 3rd instar larvae of C.pipiens pallens and
A.albopictus(The LC50value of ethyl acetate were 459.12,438.09mg/L,n-butanol were 471.41,
430.81mg/L),ethyl acetate extracts were isolated further.The LC50value of oleanolic acid against
3rd instar larvae of C.pipiens pallens and A.albopictus were 25.36,22.31mg/L(24h),respectively.
The LC50value of apigenin against 3rd instar larvae of C.pipiens pallens and A.albopictus were
31.29,27.22mg/L(24h),respectively,which were worthy of further study.
Key words Duchesnea indica(Andr)Focke;Larvicidal activity;Culex pipiens pallens;Aedes albop-
ictus;Active component
蚊虫能传播黄热病、疟疾、登革热、流行多发 性关节炎、肾综合征出血热和多种脑炎等疾病,严
重威胁人类健康[1]。由于缺少有效的疫苗和特效
药,控制传播媒介就成了阻止这些疾病传播的有
效途径[2]。化学药剂是防治蚊虫的主要手段,但
不合理、过度的使用化学药剂不仅使蚊虫产生抗
药性[3-6],也带来环境安全等问题 [7]。从植物中
寻找可替代化学药剂的物质是一个新的途径。和
成蚊相比,在幼虫阶段控制蚊虫滋生相对容易,已
经报道有几种植物源物质对蚊幼有较好的毒杀活
性[8]。Mula等[9]对楝科植物的化学成分及其杀
蚊幼活性进行系统研究,证实印楝的叶子、种子及
其他部位中含有35种活性物质,其中印楝素为杀
蚊幼的主要活性物质。曹镐禄等[10]对赣南地区
30种植物试验发现,打破碗碗花、百部、夹竹桃、
水蓼茎叶、藜芦的丙酮粗提物效果较好,对淡色库
蚊幼虫24h处理,校正死亡率均大于80%。穿心
莲、旱莲草和倒地铃的甲醇提取物对斯氏按蚊幼
虫有较好的活性[11]。
蛇莓[Duchesnea indica (Andr)Focke]为
蔷薇科蛇莓属植物,为民间常用中草药,别名地
莓、鸡冠果、野杨梅、三叶莓、蛇泡草、小草莓等,性
味甘、酸寒,具有散瘀消肿、清热解毒、杀虫之功
效[12]。中医常用于多种癌症的治疗,药理研究显
示蛇莓具有显著的抗肿瘤和抗氧化等药理活
性[13-14],但报道涉及的蛇莓农用活性却很少,李慧
等[15]曾报道蛇莓乙醇粗提物对淡色库蚊幼虫有
较好的毒杀活性。在此基础上,继续研究蛇莓的
化学成分,并寻找具有杀蚊幼活性的成分,对新型
植物源农药的开发具有重要意义。
本研究采用生物活性跟踪分离方法,从蛇莓
全草乙醇提取物分离鉴定出活性成分,并对其杀
蚊幼活性进行测试,评价其进一步应用的潜力。
1 材料与方法
1.1 供试植物样品
蛇莓,于2012年9月27日采自甘肃天水,植
物标本(标本编号20120927)保存于西北农林科
技大学无公害农药研究服务中心植物标本室,由
西北农林科技大学生命科学学院李琰副教授
鉴定。
1.2 供试昆虫
淡色库蚊(Culex pipiens pallens)、白纹伊蚊
(Aedes albopictus):引种自陕西省疾病预防控制
中心,在西北农科技大学无公害农药研究服务中
心于室内(温度26℃±1℃;湿度70%±10%;
L/D为14h/10h)饲养,试验时选用个体均匀的
健康3龄幼虫。
1.3 仪器与试剂
石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮均为市售分
析级试剂,西陇化工股份有限公司生产;200~300
目(粒径48~75μm)硅胶,青岛海洋化工厂生产。
R206旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司),
X-5显微熔点测定仪(北京泰古仪器有限公司),
UV-8三用紫外分析仪(上海市安亭电子仪器
厂),Bruker-ADVANCEⅢ500核磁共振仪(德
国Bruker公司)。
1.4 样品提取及分离
将蛇莓样品于通风阴凉处晾干,粉碎,过60
目筛(筛孔径0.25mm),得7kg粉碎物,用50L
工业乙醇室温下浸提3次,浸提时间分别为48、
72和48h,合并滤液,真空旋转浓缩至干,得蛇莓
乙醇浸膏453g。将其先用蒸馏水悬浮,再依次用
石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取分离3次。将各萃
取有机层合并,真空旋转浓缩至干,分别得石油醚
相、乙酸乙酯相和正丁醇相浸膏70.0、242.5和
19.4g,用于生物活性跟踪试验。
通过活性跟踪,对蛇莓杀蚊幼活性较强的乙
酸乙酯相提取物(242.5g)进行硅胶柱层析,以石
油醚-丙酮体系[V(石油醚)∶V(丙酮)分别为
20∶1、10∶1、6∶1、3∶1、1∶1]为洗脱剂进行梯
度洗脱,等体积(500mL)收集馏分,薄层层析
(TLC)检测[V(石油醚)∶V(丙酮)=4∶1],将
Rf值相同的馏分合并,共得10个馏分。以淡色
库蚊和白纹伊蚊3龄幼虫为试虫,测定硅胶柱层
析后各馏分的杀蚊幼活性。结果表明,A5馏分
活性较好,继续对其进行分离。以选定的石油
醚-乙酸乙酯体系对其进一步进行硅胶柱层析分
离,结合凝胶柱层析,分别得到化合物 H1、H2,其
质量分别为32.6和28.5mg。
1.5 活性化合物结构鉴定
对分离得到的化合物通过熔点及TLC检测,
电子轰击质谱(EI-MS)、氢谱(1 H NMR)、碳谱
(13C NMR)等谱图数据分析并结合文献,确定其
分子结构。
1.6 生物活性测定方法
采用 WHO推荐的浸渍法[16]测定蛇莓提取
物以及单体化合物对淡色库蚊幼虫的毒杀活性。
将供试样品用无水乙醇溶解配制成适当质量浓
度,用去离子水稀释成一定质量浓度的药液。分
·751·1期 于冬冬等:蛇莓杀蚊幼活性成分初步分离与鉴定
别在100mL烧杯中加入25mL去离子水,然后
挑入15只大小一致、健康的白纹伊蚊和淡色库蚊
3龄幼虫,最后取药液25mL加入到小烧杯中。
置于湿度(70±10)%、温度(26±1)℃、光照14∶
10(L∶D)条件下培养,分别于24h检查死亡情
况(振动烧杯,并用大头针轻触试虫,若试虫不动
即判定死亡),计算死亡率和校正死亡率。每样品
重复3次,每次以相应体积分数的无水乙醇作溶
剂对照,并以清水作空白对照。
死亡率=死亡虫数/总虫数×100%
校正死亡率=(处理死亡率-对照死亡率)/
(1-对照死亡率)×100%
1.7 数据处理方法
数据处理软件为SPSS 13.0,计算毒力回归
方程y=ax+b(y代表校正死亡率的机率值,x代
表药剂质量浓度的常用对数)和致死中质量浓度
(LC50)、χ
2 值及其95%置信限。
2 结果与分析
2.1 不同萃取相对淡色库蚊和白纹伊蚊3龄幼
虫的毒杀活性
以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取,得3
个萃取相。并测定不同萃取相对淡色库蚊和白纹
伊蚊3龄幼虫的毒力(表1)。结果表明,乙酸乙
酯相和正丁醇相对试虫表现出较强的毒杀作用,
且差异性不显著,而石油醚相活性较低。
2.2 化合物结构鉴定
H1:白色针晶(甲醇),mp 305~312 ℃,
Liebermann-Burchard反应阳性。EI-MS m/z:
456[M]+,248,203,189,133,结合NMR信息确
定分 子 式 为 C30 H48 O3。1 H-NMR (500MHz,
CD3OD)δ:5.49(1H,t,J=3.4Hz,H-12),3.28
(1H,m,H-3),1.23(3H,s),0.95(3H,s),0.90
(3H,s),0.74(3H,s),0.73(3H,s)。13 C-NMR
(125MHz,CD3OD)δ:39.01(C-1),28.17(C-2),
78.19(C-3),39.47(C-4),55.93(C-5),18.9(C-
6),33.28(C-7),39.86(C-8),23(C-9),37.48(C-
10),23.80(C-11),122.65(C-12),144.91(C-13),
42.27(C-14),28.42(C-15),23.88(C-16),46.76
(C-17),42.1(C-18),46.60(C-19),31.06(C-20),
34.34(C-21),33.28(C-22),28.88(C-23),16.64
(C-24),15.65(C-25),17.52(C-26),26.28(C-
27),180.23(C-28),33.28(C-29),23.80(C-30)。
以上数据与文献报道基本一致[17],故鉴定化
合物 H1为齐墩果酸,结构式见图1。
H2:浅褐色粉末(吡啶),mp 339~341℃,盐
酸镁粉反应呈阳性。EI-MS m/z:270 [M]+,
242,153,121,结合 NMR 信息确定分子式为
C15H10O5。1 H-NMR(500MHz,pyridine-d5)δ:
7.92(2H,d,J=8.5Hz,H-2′,6′),6.88(2H,d,
J=8.5Hz,H-3′,5′),6.88(1H,s,H-3),6.81
(1H,s,H-8),6.72(1H,s,H-6);13 C-NMR(125
MHz,pyridine-d5)δ:94.6(C-8),99.8 (C-6),
103.6(C-3),104.9(C-10),116.6(C-3′,5′),
122.1 (C-1′),128.7(C-2′,6′),158.3 (C-5),
162.5(C-9),162.9(C-4′),164.3(C-7),165.6
(C-2),182.5(C-4)。其氢谱和碳谱数据与文献
报道基本一致[18],故鉴定化合物H2为芹菜素,结
构式见图1。
2.3 齐墩果酸和芹菜素对淡色库蚊和白纹伊蚊
3龄幼虫的毒杀活性
在预试验基础上,测定齐墩果酸和芹菜素对
2种试虫的毒力,结果见表2。
由表2可知:齐墩果酸和芹菜素对淡色库蚊
和白纹伊蚊幼虫均有一定毒杀作用,齐墩果酸对
淡色库蚊和白纹伊蚊幼虫24h处理LC50值分别
为25.36和22.31mg/L,芹菜素对淡色库蚊和白
纹伊蚊幼虫24h处理 LC50值分别为31.29和
27.22mg/L。
表1 蛇莓不同萃取相对淡色库蚊和白纹伊蚊3龄幼虫的毒力(24h)
Table 1 Toxcity of different fraction to 3rd instar larvae of C.pipiens pallens and A.albopictus
萃取相
Extract
试虫
Tested insect
毒力回归方程
Toxicity regression
equation
χ2
LC50/
(mg/L)
95%置信限/(mg/L)
95%CL
石油醚相 淡色库蚊C.pipiens pallens y=-1.442 5+1.866 2x 0.27 2 832.84 639.66~12 545.72
Petroleum ether extracts 白纹伊蚊A.albopictus y=-0.051 2+1.385 7x 0.12 4 419.00 582.64~33 515.87
乙酸乙酯相 淡色库蚊C.pipiens pallens y=-1.528 6+2.452 6x 2.15 459.12 311.19~677.37
Ethyl acetate extracts 白纹伊蚊A.albopictus y=-1.917 3+2.618 6x 2.56 438.09 303.35~632.67
正丁醇相 淡色库蚊C.pipiens pallens y=-1.505 1+2.433 3x 1.90 471.41 319.05~696.53
n-Butanol extracts 白纹伊蚊A.albopictus y=-1.457 8+2.451 4x 1.95 430.81 292.73~634.03
·851· 西 北 农 业 学 报 24卷
图1 齐墩果酸和芹菜素结构式
Fig.1 Chemical structure of oleanolic acid and apigenin
表2 两种化合物对淡色库蚊和白纹伊蚊3龄幼虫的毒力(24h)
Table 2 Larvicidal toxicity of two compounds against the 3rd instar larvae
of C.pipiens pallens and A.albopictus
化合物
Compound
试虫
Tested insect
毒力回归方程
Toxicity regression
equation
χ2
LC50/
(mg/L)
95%置信限/(mg/L)
95%CL
齐墩果酸 淡色库蚊C.pipiens pal-lens y=-0.842 4+4.160 9x 0.18 25.36 22.78~28.22
Oleanolic acid 白纹伊蚊A.albopictus y=-0.236 5+3.883 5x 0.02 22.31 19.78~25.15
芹菜素 淡色库蚊C.pipiens pal-lens y=0.140 7+3.249 6x 1.93 31.29 27.26~35.91
Apigenin 白纹伊蚊A.albopictus y=0.507 9+3.130 6x 3.53 27.22 23.82~31.10
3 讨 论
3.1 齐墩果酸和芹菜素对淡色库蚊和白纹伊蚊
3龄幼虫有较好的毒杀活性,值得进一步研究
近年来,从植物中分离生物活性化合物来替
代化学合成杀蚊幼剂已成为研究热点。曾有报道
从印楝中分离出的两种三萜类化合物对白纹伊蚊
幼虫的LC50分别为21.83和100mg/L[19],印楝
素作为常用杀虫剂,其对白纹伊蚊幼虫的LC50为
57.1mg/L[20],从土牛膝乙酸乙酯提取物中分离
的皂苷对埃及伊蚊和淡色库蚊的杀蚊幼活性
LC50分别为18.20和27.24mg/L[21],从日本柳
杉甲醇提取物中分离的荜澄茄醇对埃及伊蚊和淡
色库蚊四龄幼虫 LC50 分别为 60.1 和 50.0
mg/L[22]。本研究结果表明,齐墩果酸对淡色库
蚊和白纹伊蚊幼虫24h处理 LC50值分别为
25.36、22.31mg/L,芹菜素对淡色库蚊和白纹伊
蚊3龄幼虫24h处理 LC50值分别为31.29、
27.22mg/L,与以上所报道活性相当。
3.2 蛇莓中所含的其他杀蚊幼活性成分有待进
一步分离测试
本研究仅分离高活性馏份段的杀蚊幼活性化
合物,其他馏份段也具有一定的杀蚊幼活性,因
此,有必要对这些馏份段继续进行分离。本研究
结果还显示,蛇莓正丁醇相也具有良好的杀蚊幼
作用,但尚未对其进一步分离,是否还含有其他活
性成分尚待进一步研究。
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·061· 西 北 农 业 学 报 24卷