全 文 ： 论著
山苍子油体外抗申克孢子丝菌的实验研究
万力　单秀娟
(河北医科大学附属第四医院皮肤科 ,石家庄 050011)
【摘要】　目的　探讨山苍子油对申克孢子丝菌的体外抗菌活性及其作用机理。方法　纸片扩散法定性检测山苍子油对申
克孢子丝菌的体外抗菌活性 , CLS I-M 27-A微量液基稀释法定量检测其对 14株临床分离申克孢子丝菌 (包括固定型和淋巴
管型各 7株)的最小抑菌浓度(M IC),以氟康唑作为质控药物。电镜观察山苍子油作用前后申克孢子丝菌超微结构的改变。
结果　纸片扩散法 1周后可见清晰的抑菌环 ,山苍子油对皮肤固定型株和皮肤淋巴管型株的 M IC范围均为 156. 25 ～ 1250
μg /m l, 差异无显著性(P >0. 05)。电镜观察显示山苍子油作用 24h后申克孢子丝菌的菌丝干枯 、断裂 ,孢子壁疏松 、碎裂;
胞膜及胞壁结构模糊 ,胞浆皱缩 , 细胞器及细胞核结构模糊。结论　山苍子油对临床分离的皮肤型孢子丝菌有较强的抗菌
活性 , 且其对固定型株和淋巴管型株的抗菌活性无显著性差异。电镜结果提示山苍子油可能通过破坏菌胞膜 , 影响其通透
性 , 进而扰乱细胞正常代谢而起到抗菌作用。
【关键词】　山苍子油;申克孢子丝菌;药敏试验;电镜
【中图分类号】　R 379. 5　　【文献标识码】　A　　【文章编号】　1673-3827(2007)04-0207-03
Study on L itsea Cubeba oil againstSporothrix schenckii
WAN Li, SHAN X iu-juan
(Depa rtm ent ofD erm atology, theFourth Affilia ted Hospita l of H ebei M edica l University, Shijiazhuang 050011, Ch ina)
【Abstract】　Objec tive　 To inve stig ate the anti-Sporothrix schenck ii activ ity o f L itsea Cubeba o il and to explo re the an ti-fung i
m echanism of L itsea Cubeba o il w ith e lectronic m icro scope. Methods　The anti-Sporothrix schenck ii activ ity of L itsea Cubeba oil
w as initially evalua ted by disc diffusion me thod. Them inimum inh ib itory concentration(M IC) of L itsea Cubeba o ilwa s determ ined in
fou rteen c lin ica lly iso la ted Sporothrix schenck ii strains by m ic rodilution m ethod, using fluconazo le as qua lity contro .l U ltrastructura l
changes o fSporothrix schenck ii befo re and a fter test w ere observed w ith e lec tronic m ic roscope. Resu lts　The c lea r inh ibito ry zone
could be seen afte r one w eek in disc d iffusion m ethod. The fixed stra ins and lym ph-vascu lar strains w e re all susceptible to L itsea
Cubeba oil, and theirM IC ranged from 156. 25 μg /m l to 1250ug /m .l W ith no ev ident d iffe rences(P >0. 05) e lec tronicm icro sco-
py show ed w ithered hyphae, defo rm ed surface, rough and slack conidia w al.l Cy toplasm tex ture w as obscure and m itochondrion was
swe lling after L itsea Cubeba oil hav ing effec ted fo r 24 hours. Conc lu sion　 Sporothrix schenckii is susceptible to L itsea Cubeba o i.l
It wo rks through defo rm ing in teg ra tion o f cellw a ll and d isturb ing cells me tabo lism.
【Keyw ords】　L itsea Cubeba oil;Sporothrix schenck ii;drug sensitiv ity test;e lec tron m icro scope
[ Chin JMyco l, 2007, 2(4):207-209]
　　山苍子油是从中药山苍子的果实中提取的挥
发油 ,其主要成分为柠檬醛 。研究发现山苍子油对
念珠菌 、皮肤癣菌 、曲霉等多种真菌具有很好的抑
菌和杀菌作用 ,是已知抗菌谱广且抗菌作用强的植
物天然产物之一[ 1 ～ 3] 。但关于山苍子油抗申克孢
子丝菌活性的实验研究尚未见报道。我们采用纸
片扩散法和微量液基稀释法分别定性和定量检测
基金项目:河北省科技厅立项研究课题(052761159)
作者简介:万力 ,女(汉族),主任医师 ,硕士研究生导师. E-m ail:Li-
W an@m edm ai.l com. cn
了山苍子油对申克孢子丝菌的体外抗菌活性 ,同时
通过电镜观察初步了解其抗菌作用机制 。
1　材料与方法
1. 1　材料
菌株　实验所用菌株均来自我院门诊患者 ,包
括临床分离的皮肤固定型株和皮肤淋巴管型株各
7株 ,均经组织病理和形态学鉴定 。
药品　山苍子油由浙江嘉兴香料有限公司提
供 (含醛量 >75. 5 %,比重 0. 881),氟康唑粉为上
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海三维制药有限公司制造 ,碘化钾由北京市燕京制
药厂生产。
培养基　沙堡培养基 (SDA)、RPM I1640液体
培养基均按 CLS I方案 [ 4]配置 。
1. 2　方法
菌悬液制备　将受试的申克孢子丝菌复温后 ,
接种于 SDA培养基上 , 27℃培养 2周 。选择生长
良好的菌落置于含无菌蒸馏水的研磨器中 ,均匀研
磨 ,以肉眼观察无明显颗粒 ,外观呈毛玻璃状为度。
将研磨好的菌液用 2层无菌纱布过滤去除杂质和
过多菌丝 ,重复 2次 ,滤液置无菌离心管中 , 4 000
转 /m in,离心 5m in,弃上清液 ,重复 3次 。用血细
胞计数板调整菌悬液浓度至 1×106 cfu /m l(以一个
孢子或菌丝分隔处计为 1个 cfu)。
纸片扩散法 　将 SDA培养基平皿 (直径 9.
0cm)置 37℃温箱干燥 20 ～ 25 m in,用取菌环蘸取
菌悬液均匀涂布于平皿培养基表面 ,然后将平皿置
37℃温箱静置 10m in。将灭菌空白滤纸圆片(直径
0. 8 cm)分别浸泡于 5%山苍子油 、10%山苍子油
及 10%K I溶液中 ,取出后分别紧贴于含菌琼脂表
面 ,置 27℃温箱培养 1 ～ 2周后测量结果 。
微量液基稀释法　参照 CLSI-M27-A方案[ 4] ,
采用微量液基稀释法测定 M IC。山苍子油的浓度
范围为 78. 125 ～ 40 000 μg /m l,氟康唑的浓度范围
为 0. 25 ～ 128μg /m l。于药敏板每排 1 ～ 10孔分别
加倍比浓度药液各 100 μl,第 11、12孔分别为生长
对照和空白对照 。
M IC终点判定　山苍子油的 M IC值暂规定采
用肉眼观察 100%受抑作为终点判断标准 ,与生长
对照孔比较生长完全抑制 ,空白对照清亮所对应的
最低药物浓度为山苍子油的 M IC值 。上述实验均
平行操作 2 ～ 3次 ,当 M IC值能准确重复或只差一
个浓度时才被接受 ,并以较高浓度作为 M IC值 。
转种实验　从判定为 M IC值的含有山苍子油
的孔中各取 50 μl混合液转种到 SDA培养基上 ,
27℃培养 2周 ,如果无真菌生长为杀菌作用 ,若重
新有真菌生长则为抑菌作用。
电镜标本制作　应用 M IC浓度的山苍子油作
用于申克孢子丝菌 , 24h后取出 ,正常申克孢子丝
菌作对照。标本用戊二醛固定 ,分别行扫描电镜和
透射电镜观察。
数据处理　所有数据均应用 SPSS12. 0软件包
进行统计学分析处理 。
2　结　　果
2. 1　纸片扩散法结果
见表 1,图 1、2。
2. 2　微量液基稀释法结果
山苍子油对申克孢子丝菌的 M IC值范围为
156. 25 ～ 1 250μg /m l,其对皮肤固定型株和皮肤淋
巴管型株的 M IC值差异无显著性(P >0. 05,见表
2)。
表 1　山苍子油纸片扩散法结果
Tab. 1　Th e resu lt of disc d iffu sionm ethod
组　别 纸片浓度(%) 抑菌圈直径(mm)
1周后　　　　 2周后
山苍子油 10 16　　　　　　 17
5 9　　　　　　 11
碘化钾 10 0　　　　　　 0
表 2　山苍子油对固定株和淋巴管株的 M IC均值比较
Tab. 2　C om pare of the M IC of Lisea Cub eba oil in d ifferent groups
菌　种 菌株数 M IC值 t值 P值
固定株 7 557. 893±359. 343 -0. 559 0. 586
淋巴管株 7 446. 214±387. 349
2. 3　转种试验结果
将 M IC值范围的生长孔内的菌液转种 , 27℃
培养 2周 ,未见真菌生长。
2. 4　电镜结果
扫描电镜:正常菌丝饱满 ,粗细均匀 ,孢子完整
饱满(见图 3)。经山苍子油作用 24 h后的菌丝干
枯 、表面粗糙 、皱缩 、断裂 ,孢子壁疏松 、碎裂 (见图
4)。
透射电镜:正常菌细胞呈规则圆形 、椭圆形 ,细
胞结构清晰 、层次清楚;细胞壁 、细胞膜完整 ,且厚
薄均匀;胞浆丰富均匀;细胞器及细胞核结构完整
(见图 5)。经山苍子油作用 24 h后的细胞变形 ,
呈不规则形;细胞膜 、细胞壁结构模糊 ,且厚薄不
均;胞浆皱缩 ,出现多数斑片状电子薄区;细胞器及
细胞核结构模糊 (见图 6)。
3　讨　　论
孢子丝菌病是由申克孢子丝菌引起的一种亚
急性或慢性真菌感染 ,其病程一般较长 ,治疗方面
药物比较局限 ,仍以碘化钾为首选药物 ,但其不良
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反应为大多数患者不能接受 。故寻找高效 、低毒的
图 1　山苍子油纸片扩散法 1周时结果 (A. 10%山苍子油 , B. 5%
山苍子油 , C. 10%K I)　图 2　山苍子油纸片扩散法 2周时结果
(A. 10%山苍子油 , B. 5%山苍子油 , C. 10%KI)　图 3　正常菌丝 、
孢子完整饱满(扫描电镜 , ×6. 0k)　图 4　药物作用后菌丝断裂
(扫描电镜 , ×6. 0k)　图 5　正常菌细胞结构完整 、清晰 (透射电
镜 , ×20. 0k)　图 6　药物作用后胞浆皱缩 、结构模糊(透射电镜 ,
×20. 0 k)
F ig. 1　Resu lt of d isc d iffu sionm ethod (one w eek later)　F ig. 2 Resu lt
of disc d iffu sionmethod( two w eeks later)　A. 10% Lisea cub eba oil, B.
5% Lisea cubeba oil, C. potassium iodide　F ig. 3　The norm al hyphae
w ere integrity and satiat ion (SEM , ×6. 0k)　F ig. 4 The hyphae affected
by Lisea cubeba oilw ere sh runken and b roken (SEM , ×6. 0k)　Fig. 5
The normal fungi cells were integrity, cytop lasm w as satiation (TEM , ×
20. 0k)　F ig. 6　The fungicellw allw as rough ly ef fected by Lisea cube-
ba oil, and cytop lasm was sh runken (TEM , ×20. 0k)
抗申克孢子丝菌药物成为广大医药工作者亟待解
决的问题。山苍子油是中药山苍子的提取油 ,我国
一直作为香料供应市场 ,其药用价值也逐渐受到人
们的关注 , 研究表明山苍子油具有广谱抗菌作用 。
申克孢子丝菌最适合生长的温度为 26℃左
右 , 37℃下生长较缓慢 ,山苍子油的有效抗菌成分
柠檬醛具有很强的挥发性 ,随着实验时间延长其抗
菌效果会明显减弱 ,为尽量准确反映山苍子油抗菌
效果 ,本实验菌株培养及药敏实验均在 27℃环境
下进行 。
本实验首先通过纸片扩散法药敏实验直观测
定了山苍子油对申克孢子丝菌的体外抗菌活性 ,且
观察 2周后抑菌环直径较 1周前未见缩小 ,相反有
轻微增加 ,这说明山苍子油体外具有较持久的抗申
克孢子丝菌活性 ,且抗菌作用可能呈杀菌性。
同时采用微量液基稀释法定量检测了山苍子
油抗申克孢子丝菌的活性 ,其对皮肤固定型株和皮
肤淋巴管型株的 M IC值经 t检验 ,差异无显著性 ,
说明山苍子油体外对皮肤固定型菌株和皮肤淋巴
管型菌株具有相似的抗菌活性 。此外 ,为检测山苍
子油的抗菌作用是抑菌或杀菌 ,我们进行了转种试
验 ,结果表明其抗菌作用呈杀菌性 ,以上均说明了
山苍子油是一种高效的抗菌药物。
在以往的研究中 ,许多学者相继采用了同位素
追踪 、电镜 、显微多道分光光度法及单细胞凝胶电
泳散射技术 ,从完整细胞 、亚细胞和分子水平对山
苍子油抗真菌的作用机理进行了研究。研究表明
山苍子油可在细胞内产生多方面生物学效应 ,但抗
菌机理未能完全清楚 。本实验通过电镜观察到 ,经
山苍子油作用 24h后申克孢子丝菌菌丝皱缩 、断
裂 ,孢子壁疏松 、碎裂 。细胞膜及细胞壁结构模糊 ,
胞浆皱缩 ,细胞器及细胞核结构模糊 。以上提示山
苍子油可能通过破坏细胞壁及细胞膜 ,从而破坏胞
膜选择通透性 ,使细胞内渗透压降低 ,细胞内容物
大量外渗 ,扰乱其正常代谢 ,促进了细胞的死亡。
但也不能排除山苍子油直接破坏细胞核 DNA ,进
而影响细胞器 (如线粒体 )的结构及功能 ,扰乱细
胞的正常代谢 ,导致细胞死亡。
本实验通过纸片扩散法 、微量液基稀释法等体
外抑菌实验初步证实山苍子油体外具有较好的抗
申克孢子丝菌活性 ,为山苍子油的临床应用提供了
实验依据。此外 ,我们通过电镜观察初步了解了其
抗菌作用机理 ,其具体的作用机制还有待于进一步
的研究 。
参 考 文 献
[ 1] 　罗曼 ,蒋立科 ,王志强 ,等. 山苍子油及主要成分抗菌机制研
究进展. 微生物学通报 , 2003, 30(3):74-77
[ 2] 　吕昭萍 ,黄云莉 ,王正文 ,等.山苍子油的抗菌作用研究. 皮肤
病与性病 , 1997, 19(4):3-4
[ 3] 　方芳 ,吕昭萍 ,王正文 ,等. 山苍子油抗念珠菌的敏感性及作
用机理的电镜研究.中华皮肤科杂志 , 2002, 35(5):349-351
[ 4] 　NationalC omm tittee for C lin ical Laboratory Standards. Reference
m ethod for b roth d ilu tion an tifungal suscep tib ility tes ting ofyeasts;
App roved standardM-27A. Pennsylvan ia:NCCLS, 1997. 1-21
[收稿日期 ] 　 2007-06-12
[本文编辑 ] 　卫凤莲
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