全 文 ：表 2　XKC00甲基化分析结果
Tab 2　Methylation analy sis of XKC00
Methylated sugars Rt
M olar
Ratio
Ms(m/ z) Linkages
2 , 3 , 5-M e3-Ara 9.38 2.21 43 , 71 , 101 , 129 , 145 , 161 , 19 1 ,
206 , 247 T-A ra
2 , 3 , 4-M e3-Xyl 9.92 0.50 43 , 58 , 71 , 87 , 101 , 117 , 144 , 16 1 ,
205 , 219 , 273 T-Xyl
2 , 3 , 4-M e3-Rha 10.46 0.74 43 , 71 , 89 , 101 , 115 , 131 , 15 5 ,
175 , 199 , 233 T-Rha
2 , 3-M e2-Xyl 13.32 1.93 43 , 59 , 71 , 87 , 101 , 117 , 129 , 14 2 ,
161 , 189 , 247 1 , 4-linked Xyl
2 , 3 , 4 , 6-M e4-Man 14.37 0.83 43 , 71 , 87 , 101 , 129 , 145 , 16 1 ,
191 , 205 , 219 , 234 , 263 T-Man
2 , 3 , 4 , 6-M e4-G lc 14.51 0.71 43 , 59 , 87 , 101 , 129 , 145 , 16 1 ,
185 , 205 , 219 , 263 T-Glc
2 , 3 , 4 , 6-M e4-G al 15.20 8.55 43 , 71 , 87 , 101 , 129 , 145 , 16 1 ,
191 , 205 , 263 , 291 T-Gal
2 , 4-Me2-Rha 15.30 0.40 43 , 71 , 101 , 117 , 131 , 161 , 19 1 ,
217 , 249 , 291 1 , 3-linked Rha
3-M e-Xyl 15.39 2.84 43 , 71 , 87 , 129 , 159 , 173 , 18 9 ,
217 , 232 , 249 , 291 1 , 2 , 4-linked Xyl
2 , 3 , 6-M e3-Man 17.50 14.10 43 , 71 , 101 , 117 , 173 , 203 , 23 3 ,
275 , 291 , 319 1 , 4-linkedM an
2 , 3 , 6-M e3-G lc 17.68 5.78 43 , 71 , 99 , 117 , 173 , 217 , 23 3 ,
249 , 291 , 319 1 , 4-linkedG lc
3 , 4 , 6-M e3-G lc 17.98 10.40 43 , 71 , 87 , 129 , 145 , 161 , 18 9 ,
205 , 233 , 249 , 291 1 , 2-linkedG lc
2 , 3 , 4-M e3-G al 19.29 7.46 43 , 71 , 101 , 117 , 161 , 189 , 21 7 ,
233 , 291 , 319 1 , 6-linkedG al
2 , 3-M e2-Man 20.87 12.91 43 , 117 , 161 , 201 , 261 , 319 , 347 1 , 4 , 6-linkedM an
3 , 6-M e2-Man 23.28 1.35 43 , 87 , 129 , 159 , 189 , 261 , 347 1 , 2 , 4-linkedM an
2 , 3-M e2-G lc 30.97 1.63 43 , 117 , 161 , 191 , 215 , 275 , 31 7 ,
375 , 406 1 , 4 , 6-linkedG lc
3.5.2　过碘酸盐氧化　气相分析结果表明为丙三
醇 、赤藓醇 、Rha。大量赤藓醇的出现说明 XKC00
中存在较多 1 ,4-连接的己糖 ,而丙三醇则说明存在
末端 1 , 2-或 1 ,6-连接的己糖或位于末端的戊糖 。
3.6　XKC0013CNMR谱分析　由于 XKC00含有 6
种糖残基 ,所以其13CNMR较为复杂 ,在异头碳(C1)
区有 7 个信号 , 其中较弱的 δ108.94 , 104.17 ,
104.04应分别来源于 α构型的 A raf 和 β 构型的
Xy lp ;δ105.4 ,103.35分别来源于 β构型的 Manp和
Glcp ;δ101.00 ,99.35可能为α构型的 Glap的信号;
δ84.68 ,81.91可能分别为 1 , 4-连接的 Man 和 Glc
的取代碳(C4)的信号 ,δ21.13为 Rha的 C6信号。
4　讨论
通过对夏枯草水溶性多糖的系统研究 ,首次分
离得到了 4个多糖部位 ,测定了他们的分子量和纯
度 ,其中 XKC00为均一分子量的中性杂多糖 ,用化
学和光谱方法对其进行了结构分析 ,确定了其糖残
基组成及比例 ,并基本明确了其主要的糖残基连接
方式;比较 XKC00 和 XKC02-A 的糖残基组成 ,均
是由鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、木糖(Xy l)、甘
露糖(Man)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)6 种单糖残
基组成 ,可能是由于两者来源于同一植物;初步研究
表明夏枯草各多糖部位具有促进淋巴细胞转化增殖
与诱生γ-干扰素作用 ,详细化学结构和生物活性还
有待进一步研究。
参考文献:
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[收稿日期] 2007-09-12
[ 基金项目] 国家自然科学基金资助项目(编号:39800193)　[ 作者简介] 方建国 ,男 ,主任药师 ,博士 ,电话:027-83649095 , Emai l:f jg3560@si-
na.com
大青叶在大鼠中的血清药物化学研究
方建国 ,彭静 ,王文清 ,汤杰 ,马永贵 　(华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部 ,湖北 武汉 430030)
[ 摘要] 　目的:建立大青叶水煎液血清药物化学的初步研究。方法:通过 HPLC-DAD图谱和紫外光谱分析比较空白血清 、含
药血清和水煎液的成分异同 ,确定灌服大青叶后大鼠血中移行成分。结果:多次重复后 ,确定了处理血清的方法。大青叶给
药后血中出现了 3 个移行成分 ,移行成分极性中等 , 其中有一成分相对含量较高 , 且与水煎液的 H PLC 图谱在相同保留时间
出峰 ,光谱类似 , 其他成分可能为代谢产物。结论:血中移行成分及代谢产物将成为大青叶的体内作用基础 , 其来源为大青叶
中的主要物质 ,对其进行深入的研究将为进行大青叶活性成分的进一步研究奠定基础。
[ 关键词] 　大青叶;血清药物化学;移行成分;HPLC 图谱
[中图分类号] R284.1　　[ 文献标识码] A　　[文章编号] 1001-5213(2008)06-0434-03
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Study on the bioactive components in Folium Isatidis.by serum pharmacochemistry on rat
FANG Jian-guo , PENG Jing ,WANG Wen-qing , TANG Jie , MA Yong-gui(Department o f Pharmacy , Tong ji H os-
pital A ffiliated to the Tong ji Medical Co llege , Huazhong Univer sity o f Science and Techno lo gy ,H ubei Wuhan 430030 , China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　To investig ate the pa rameters o f serum pha rmacochemistry of Folium Isatidis.METHODS　Based
on the HPLC-DAD chroma to g ram and UV spectrum , compa rison w as car ried out among the peaks o f blank se rum , serum con-
taining drug and Folium Isatidis.decoction to determine the t ransitional blood components in rats after administra tion o f the de-
coc tion.RESULTS　Af te r repeated expe riments we de te rmine the be tte r me thod to deal with the se rum.Three compounds were
obtained , they are medium po lar;one of them was found to be high content and had the same retention time w ith the one in the
HPLC chromatog ram of decoction , and the similar UV spectrum;o the r compounds should be metabo lite s.CONCLUSION　The
compounds a re abso rbed into blood and their metabo lites a re the efective constituents , the origina l crude drug s are the main in-
g redients of Folium Isatidis.Its serum pharmacochemistr y should be subject to comple te inve stigation so a s to lay a foundation
for the fur ther study o f active ing redients o f Folium Isatidis..
KEY WORDS:Folium Isatidis;serum pha rmacochemistry;compounds;HPLC chroma to g ram
　　大青叶(Folium I sat id is)系十字花科植物菘蓝
(I sat is indigotica Fort .)的干燥叶 ,具有清热解毒 ,
凉血消斑之功效[ 1] 。为清热解毒类中药的代表 ,临
床应用多年 ,疗效显著。据文献报道[ 2] ,大青叶中含
多种化合物 。中国药典 2005 年版一部仅以靛玉红
的含量测定为质量控制依据[ 1] 。但是至今为止 ,对
于大青叶的研究无论是化学[ 3]还是药效[ 4] 都过于分
散而缺乏系统性 ,仍然不能明确其药效物质 ,彻底阐
明其作用机理 ,导致药材以及复方制剂的质量控制
均无行之有效的方法和指标。药物无论经过何种代
谢必须由给药部位进入血液循环 ,以血液为介质输
送到靶点 ,从而产生作用(局部用药除外),中药亦不
例外 。因此给药后的血液才是真正起作用的“制
剂” 。药物进入血液发挥药效的物质基础有 3 种可
能:1 、直接吸收入血的原形化合物;2 、前体化合物进
消化道代谢后入血的代谢产物;3 、机体应激产生的
生命活性物质[ 5] 。文献报道中药血清药物化学的研
究不多[ 6-7] ,其中对于大青叶的研究还是空白 ,大青
叶体内过程 、药动学研究及其分析方法也未见文献
报道 。本实验首次采用血清药物化学方法研究大青
叶进入血液后的原形药物及其代谢产物的存在状况
及谱效关系 ,逆向追溯大青叶药效活性物质(群),有
助于运用建立大青叶的基于生物效应的品质评价指
标。
1　材料
1.1　仪器　LC-20AD型高效液相色谱仪(日本岛
津), 包括 LC -20AD 泵 , 7725i 定量阀 , SPD -
M20A型二极管阵列检测器(190 ～ 800 nm);TG L
-16G 台式高速冷冻离心机;XW-80A 型涡旋混
合器 。
1.2　药品与试剂　大青叶药材购自安徽亳州 ,由华
中科技大学同济医学院附属同济医院方建国教授鉴
定其均为十字花科植物菘蓝 Isat is ind igot ica
Fort .的干燥叶;乙腈为色谱纯 ,其他试剂为分析纯。
1.3　动物　健康 SD大鼠 , ♀♂不拘 ,体质量 200 ～
250 g[华中科技大学同济医学院实验动物中心 ,许
可证号:SCXK(鄂)2004-0007] 。
2　方法与结果
2.1　大青叶灌胃药液的制备　大青叶药材 500 g ,
加水煎煮 2次 ,煎液滤过 ,滤液浓缩至 500 mL ,即得
质量浓度为 1 g·mL-1的大青叶灌胃药液 ,于 4 ℃冰
箱保存。
2.2　空白血清及含药血清样品的制备　选择健康
SD大鼠 8只 ,眼静脉丛采集空白血样 3 mL ,禁食
12 h ,第 2天灌服药液(剂量按 8 g·kg-1),每日给药
2次 ,连续 3 d。末次给药后 1 ,1.5 ,2 h ,分别通过眼
静脉丛采血 3 mL 。全血静置凝结后 , 3 000 r ·
min
-1 ,上清液即为含药血清 。取血清0.5 mL于已
活化好的 SPE柱中用 10 mL 纯化水洗脱 ,弃去洗脱
液 ,再用乙酸乙酯 10 mL 洗脱 ,收集洗脱液 ,减压挥
干溶剂。进样前加入 15%乙腈溶解 , 15 000 r ·
min-1离心 15 min ,取上清液进样。
2.3　大青叶样品的处理　为减小药物与血液样品
处理方法不同带来的误差 ,取上述制备的大青叶灌
胃液0.2 mL于 5 mL 离心管中 ,加人空白大鼠血清
2 mL ,在液体混匀器上漩涡振荡 30 s ,放置 15 min。
然后照血清样品处理方法进行预处理 。
2.4　色谱条件　色谱柱:DIMAK Diamonsil C18柱
(200 mm ×4.6 mm , 5 μm);C18预柱;柱温:40 ℃,
流速:0.8 mL·min-1 ;进样量:10 μL ;流动相:水和
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乙腈 ,梯度条件为 0 min 乙腈 20%、30 min 乙腈
70%、50 min乙腈 85%。图谱如图 1 ～图 4所示。
图 1　灌服大青叶 1.5 h 后空白血清(A)和含药血清(B)的 HPLC
(3D)图
Fig 1　HPLC(3D)g raph s of b lank serum(A)and serum containing
d rug(B)af ter administ rat ion of the decoct ion
图 2　灌服大青叶 1.5 h后 251 nm 处灌胃液(1)、含药血清(2)和空
白血清(3)色谱图和特征峰(a)对应的光谱图
Fig 2　251 nm Compared HPLC ch romatogram of Folium Isatidi s.
decoction(1), s erum containing drug(2)and blank serum(3)and UV
g raph s of peak(a)af ter administ rat ion of the decoct ion
图 3　灌服大青叶 1.5h后 239 nm 处灌胃液(1)、含药血清(2)和空
白血清(3)色谱图和特征峰(b)对应的光谱图
Fig 3　239 nm Compared HPLC ch romatogram of Folium Isatidi s.
decoction(1), s erum containing drug(2)and blank serum(3)and UV
g raph s of peak(b)af ter administ ration of the decoct ion
图 4　灌服大青叶 1.5h后 322 nm 处灌胃液(1)、含药血清(2)和空
白血清(3)色谱图和特征峰(c)对应的光谱图
Fig 4　322 nm Compared HPLC ch romatogram of Folium Isatidi s.
decoction(1), s erum containing drug(2)and blank serum(3)and UV
g raph s of peak(c)af ter administ ration of the decoction
3　讨论
3.1　通过空白血清和含药血清的 HPLC(3D)图谱
比较可以看出 ,大鼠在连续灌服大青叶水煎液 3 d
以后 ,通过消化系统对其有效成分进行吸收与代谢 ,
其血液中出现了物质的变化 ,且灌服药液后1.5 h时
特征峰的数量最多 ,含量最高 。通过上述色谱和光
谱图可以看出 ,大鼠含药血清中的特征峰代表的物
质主要为最大吸收波长 251 nm 、239 nm 和 322 nm
处的 3个物质 。且色谱保留时间分别为 26 , 7 , 22
min 。但是通过比较色谱和光谱图 ,在相同的保留
时间下 ,含药血清与灌胃药液没有相同的物质。很
可能以上 3种物质均为代谢产物 。笔者注意到色谱
图中出现在 26 min的特征峰代表的物质在含药血
清与灌胃药液中均有较高含量 ,其紫外最大吸收在
250 nm 左右 ,见图 2 。该物质有可能是药液色谱中
出现在 26 min 处成分经消化道代谢丢失某个亲脂
性基团而吸收入血的代谢产物 ,其具体性质值得进
一步研究。药液加入空白血清后按同法处理 ,
HPLC 图谱中依旧存在 26 min的含量较高的峰。
3.2　通过检索[ 8] ,笔者发现含大青叶的国家已有标
准处方共有 21个 ,工艺操作中采用水提的有 9 个 ,
水提醇沉的有 11个 ,醇提的有 1个。为全面考察大
青叶能吸收入血的有效成分 ,本实验选用大青叶水
煎药液作为灌胃液 。
3.3　本实验关注的是血清中的小分子化合物 ,至于
大青叶如何影响血清中的蛋白质等高分子化合物有
待进一步研究 。通过比较回收率和内源性成分的除
去能力初步确定用 C18固相萃取小柱处理血清效果
较好 。
3.4　本实验仅通过对大青叶的血清药物化学的研
究 ,用 HPLC图谱可直接观察和解析进入血液后的
各种化合物的含量和数量的变化 。通过药理模型比
较进人血液前后各组分的相对含量变化 ,以期可以
对血液中测定的各组分的生物活性进行判断和预
测。并已开始通过现代方法提取分离并分析鉴定目
标成分 ,以探明中药大青叶中真正的药效成分。
参考文献:
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[收稿日期] 2007-05-28
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