全 文 ：海洋科学/2007年/第 31卷/第 2期
用改进的超声波-溶菌酶法制备钝顶螺旋藻原生质球
银红梅 ,张学成 ,王志刚
(中国海洋大学 生命科学与技术学部 , 山东 青岛 266003)
摘要:用改进的超声波-溶菌酶法制备钝顶螺旋藻原生质球。钝顶螺旋藻(S pirulina p laten-
sis)经超声波破碎后 ,用 1.5 mol/ L NaCl的 Zarr ouk 培养基洗去细胞外壁的胶质鞘 ,然后进
行酶解。酶解条件为:pH7.2 的 0.2 mo l/ L 磷酸钾缓冲液 , 0.8 mo l/ L KCl , 0.5%溶菌酶 ,
28 ～ 30℃水浴震荡酶解 5～ 7 h ,获得 40%以上有活力的钝顶螺旋藻原生质球。
关键词:钝顶螺旋藻(S pirulina p latensis);原生质球;超声波;溶菌酶
中图分类号:Q28　　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-3096(2007)02-0044-04
　　钝顶螺旋藻(S pirulina platensis)又名钝顶节旋
藻(Arthrospire platensis)属蓝藻门 , 颤藻科 , 是一种
具有重要应用价值的蓝藻[ 1] , 并已经得到了开发应
用[ 2] 。原生质球是生理研究和遗传育种的良好材
料[ 3] ,其制备在螺旋藻基因工程中是不可缺少的实
验手段。螺旋藻细胞外被有内壁 、外壁和胶质鞘多层
结构 ,其中内层的肽聚糖是溶菌酶作用的对象 , 而外
壁含有的脂蛋白和脂多糖以及胶质鞘 , 是溶菌酶不
能起作用的结构[ 4 ,5] , 因此 , 在制备螺旋藻的原生质
球时常常是用改进了的酶法。
周金鑫等[ 6]用 NaCl等处理螺旋藻后转入酶解
液中得到原生质球并再生成功 , 但未报道球形体得
率。彭国宏等[ 7]采用机械法和酸性缓冲液去鞘 ,在混
合酶液中获得原生质球。秦松等[ 8] 用超声波制得螺
旋藻单细胞和部分原生质球。郭厚良等[ 9] 将螺旋藻
经青霉素和超声处理后作静止酶处理得到了原生质
球。上述方法 ,或是未报道得率 ,或是操作方法较为
繁琐 ,延时较长。作者对制备钝顶螺旋藻原生质球的
方法进行了改进 ,将超声波法 、离子法和酶法相结合 ,
经溶菌酶酶解后 ,得到大量有活性的原生质球 , 为螺
旋藻遗传转化体系的建立和其他相关研究奠定基础。
1　材料和方法
1.1　材料
藻种为本实验室纯培养的钝顶螺旋藻(S piruli-
na platensis)FACHB341 , 培养基为 Zar rouk[ 1] , 培养
条件:温度为 25℃± 1℃, 光照强度为 2 000 ～
2 500 lx ,光暗周期 12 h∶12 h。
1.2　方法
1.2.1　螺旋藻胶质鞘的去除
取对数期(A560 =0.6 ～ 0.8)的钝顶螺旋藻
FACHB341 培养液 , 置于离心管中进行超声波处理 ,
能量为 3 ～ 5W , 超声处理 1.0 s , 间歇 0.5 s , 处理 2
min。 3 000r/ min 离心 10 min , 收集沉淀 , 置于含 1.5
mo l/ L NaCl的 Zar rouk 培养基中洗涤 5 min。 3 000
r/min 离心10 min ,收集沉淀 ,用无菌 Zar rouk 培养基
洗涤 2～ 3 遍 , 3 000r/ min离心 10 min ,收集沉淀。
1.2.2　酶解
沉淀转入酶解液中。酶液组成为:0.2 mo l/ L 磷
酸钾缓冲液 pH 7.2 , 渗透稳定剂 KCl 0.8 mol/ L ,
0.5%溶菌酶。在 28 ～ 30℃水浴低速震荡下酶解 5 ～
7 h , 低渗爆破法检测原生质球 , 显微镜下计数细胞总
数 , 经伊文思蓝染色液活体染色每隔 1.5 h 计数原生
质球数目 , 得出活体原生质球得率。
2　结果和讨论
根据以上实验方法 ,用超声波处理后,再用较高浓
度的盐洗掉螺旋藻表面的胶质鞘,可获得大量细胞数目
小于10 的螺旋藻小片段和部分单细胞(图 1a),然后转
入酶解缓冲液中, 经过 6 h ,即可获得数量较多 、有活力
的原生质球(图1b),随着酶解时间的延长,到 7.5 h 部分
原生质球开始变黄死亡(图1c)。
收稿日期:2004-11-30;修回日期:2005-06-10
作者简介:银红梅(1980-),女 ,内蒙古呼和浩特人 , 硕士研究
生 ,研究方向:藻类分子生物学 , E-mail:qdy hm @163.com;
张学成 ,通讯作者 ,电话:0532-82032789 , E-mail:xczhang @
ouc.edu.cn
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图 1　不同酶解时间螺旋藻原生质球的情况
Fig.1 Spheroplast s of Spiru lina p latensis under dif feren t t imes of enzym at ic t reatment
a.经超声波和 NaCl处理后螺旋藻片段;b.酶解 6h 后出现大量原生质球;c.酶解7.5 h 出现死亡细胞
a.F ragments o f S pirulina dispo sed by ult ra sonic and NaCl;b.Lot s o f sphe roplasts appeared aft er being dige sted by ly so-
zyme fo r 6 hours;c.The dead ce lls appeared afte r being digested by ly sozyme fo r 7.5 hours
2.1　不同去鞘方法对钝顶螺旋藻FACHB341
原生质球得率的影响
　　在酶解前经超声波打断藻丝 , 再用高浓度盐洗
掉细胞壁外的胶质鞘后酶解 , 溶菌酶可以很有效地
作用于螺旋藻细胞壁 ,原生质球得率为 42.5%;而不
经过高浓度盐的处理 , 溶菌酶就很难发挥作用 , 酶解
4.5 h 原生质球得率仅为 20%, 之后得率逐渐下降
(图 2)。这表明 , 超声波并不能有效地去除细胞外壁
的胶质鞘 ,而经高浓度盐洗脱 , 胶质鞘会逐渐脱去 ,暴
露出细胞壁。
图 2　两种去鞘方法的比较
Fig.2　Comparation of two methods of removing sheathes
2.2　不同渗透稳定剂对钝顶螺旋藻FACHB341
原生质球得率的影响
　　其它酶解条件不变 , 改变酶解液的渗透稳定剂 。
4 种不同的渗透稳定剂分别为:0.8 mol/ L KCl , 0.8
mo l/ L 甘露醇 , 0.8 mo l/ L 山梨醇 , 复合渗透稳定剂
各 0.05 mo l/ L 的 NaCl、KNO 3 、(NH4)2SO 4 。 4 种渗
透稳定剂分别溶于含 0.5%溶菌酶的 0.2 mo l/ L 磷
酸钾缓冲液中 。
如图 3所示 , 以甘露醇和山梨醇为渗透稳定剂的
酶解缓冲液中 , 原生质球得率在 1.5 h 内没有变化 ,
1.5 h 后细胞便开始死亡;在多盐复合渗透稳定剂的
酶解液中 , 原生质球数目在 4.5 h 内成直线上升趋
势 , 得率达到 27%之后 , 原生质球数目便开始下降 ,
原生质球逐渐变黄 ,趋向死亡;而以 KCl作渗透稳定
剂 , 螺旋藻原生质球在 6 h 都具有较高的活性 , 得率
可达到 40%以上 ,可见作为酶解液的渗透稳定剂 0.8
mo l/ L KCl明显优于其他 3 种。
海藻细胞分离可用甘露醇 、山梨醇 、KCl 、NaCl等
作渗透稳定剂[10 ,11] 。 甘露醇 、KCl及多盐复合渗透
稳定剂均曾应用于螺旋藻原生质球的制备。甘露醇
引起细胞的死亡 ,可能是甘露醇对蓝藻细胞的毒害作
用[ 12] , 山梨醇作为有机渗透稳定剂引起螺旋藻细胞
死亡的原因可能是与甘露醇相似。郭厚良等使用多
盐复合渗透稳定剂[ 8 , 13] 制备螺旋藻原生质球效果较
好 , 而对于螺旋藻 FACHB341 多盐复合渗透稳定剂
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的渗透压偏低 ,造成原生质球后期死亡 , 这可能是品
系之间的差异。因此 ,本实验仍然采用彭国宏等使用
的 0.8 mol/ L KCl作为分离钝顶螺旋藻 FACHB341
原生质球的渗透稳定剂。
图 3　不同渗透稳定剂对原生质球得率的影响
Fig.3　Ef fcet s of dif f erent osmosis s tabiliz ers on the
rate of spheroplast s
2.3　磷酸钾缓冲液的 pH 值对钝顶螺旋藻
FACHB341原生质球得率的影响
　　在其他条件不变的前提下 , 改变磷酸钾缓冲液
的 pH 值 , pH 梯度设置为 6.0 , 6.4 , 6.8 , 7.2 , 7.6 ,
8.0。结果如图 4 ,当 pH 值为 7.2时 ,原生质球得率在
6 h 可以达到 51.5%,明显优于其它 pH 值的得率。
彭国宏[ 6]曾采用 pH8.0 的磷酸缓冲液获得钝顶
螺旋藻原生质球 , 而在本实验中 , 发现原生质球在
pH7.2 的磷酸钾缓冲液中得率较高(图 4)。钝顶螺
旋藻生活在高碱环境中(pH8.5 ～ 10.5), pH 值较低
不利于藻细胞的存活 , pH 值较高又不利于溶菌酶的
作用(溶菌酶的最适作用 pH =6 ～ 7), 因此 , 作者选
择 pH7.2 为缓冲液最佳 pH 值。
图 4　缓冲液 pH 值对原生质球得率的影响
Fig.4　Effect s of bu ffer′s pH on the rate of spherop
last s
2.4　溶菌酶浓度对钝顶螺旋藻 FACHB341
原生质球得率的影响
　　设置溶菌酶浓度梯度为 0 , 0.25%, 0.5%,
0.75%, 1.0%, 1.25%。 结果如图 5 , 溶菌酶浓度为
0.5%能获得最高得率的螺旋藻原生质球 , 低于此浓
度不能有效地去壁 , 当溶菌酶浓度在 1.0%以上时 ,
原生质球在 6 h 后就开始部分死亡 , 到 7.5 h , 原生质
球和单细胞逐渐变黄死亡。因此 ,作者在原生质球的
分离上采用浓度为 0.5%的溶菌酶。
图 5　溶菌酶浓度对原生质球得率的影响
F ig.5 　Effects of ly so zyme′s concentrations on the
rate o f spheroplasts
2.5　溶菌酶和果胶酶及单独溶菌酶对钝顶螺
旋藻原生质球FACHB341得率的影响
　　分别使用 0.5%溶菌酶和 0.5%溶菌酶与 0.1%
果胶酶(Y-23)的组合酶酶解已去鞘的螺旋藻细胞。
结果如图 6 , 果胶酶的加入并没有有效地提高原生质
球得率。果胶酶的加入是为了去胶质鞘 , 而在酶解
前 , 已用高盐溶液洗掉了大部分胶质鞘;更为重要的
是 , 果胶酶的最适作用 pH 值介于 3.5 ～ 4.0 之间 , 在
pH 值为 7.2 的磷酸钾缓冲液中果胶酶也难以发挥
作用。从试验结果来看(图 6), 单独溶菌酶处理完全
可以获得较多有活力的原生质球。
图 6　不同酶处理对原生质球得率的影响
Fig.6　Effect s of di ff erent enzym es on the rate of
spheroplast s
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　　如图 6 所示 , 螺旋藻原生质球最佳酶解时间是 6
h , 6 h 后部分原生质球和单细胞开始死亡。
作者探索了更为适合制备钝顶螺旋藻原生质球
的方法和条件 , 采用了改进的制备螺旋藻原生质球
的方法———超声波-溶菌酶法:螺旋藻培养液经超声
破碎 2 min , 用 1.5 mo l/ L NaCl的 Za rrouk 培养基洗
去细胞外壁的胶质鞘 ,然后溶菌酶酶解 6 h , 可获得
40%以上有活力的钝顶螺旋藻原生质球 ,为螺旋藻的
进一步遗传转化以及基因工程研究提供了实验基
础。
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Preparation of spheroplasts from Spirulina platensis by
ultrasonic-lysozyme method
YIN Hong-mei , ZHANG Xue-cheng , WANG Zhi-gang
(L ife Sciences and Technolo gy College , Ocean Univer sity of China , Qingdao 266003 , China)
Received:Nov., 30 , 2004
Key words:Spiru lina p latensis;spheroplast s;u lt rasonic;lysozyme
Abstract:The obtainment o f spheroplasts o f S pirulina platensis by the improved ultrasonic-ly sozyme
me thod w as dealt with in the pape r.S.p latensis w as broken by ultrasonic , and the gelatinous shea th of the
cells w as rinsed with Zar rouk medium containing 1.5 mo l/ L NaCl.Then the cells w ere dig ested by ly so zyme at
28 ～ 30℃ for 5 ～ 7 hour s , the enzyme so lution w as composed of 0.8 mol/ L KCl , 0.5% ly sozyme and 7.2 pH ,
0.2 mol/ L buffe r of K2H PO 4 and KH 2PO4 .Results showed tha t sphe roplasts rate could be obtained above
40%.
(本文编辑:张培新)
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