全 文 ：海洋科学/2004年/第 28卷/第 8期38
钝顶螺旋藻藻胆体的稳定性研究
张熙颖 1 , 刘鲁宁 1 , 陈秀兰 1 , 张玉忠 1 , 周百成1 , 2
(1.山东大学 生命科学学院微生物技术国家重点实验室 , 山东 济南 250100;2.中国科学院 海洋研究所 , 山东
青岛 266071)
摘要:根据室温荧光发射光谱表征 , 研究了藻胆蛋白浓度 、离子强度 、pH和葡聚糖等因素对钝
顶螺旋藻(Spirulina platensis)藻胆体的稳定性的影响 。藻胆蛋白浓度为 0.6 ～ 1.2 g/L时 ,钝顶
螺旋藻藻胆体的室温荧光发射峰在 676 ～ 681 nm之间 , 此时藻胆体的稳定性强 ,不易解离 。在
低离子强度(<0.75 mol/L)条件下 ,钝顶螺旋藻藻胆体易解离 ,解离速度随离子强度的递减而
加快 。钝顶螺旋藻藻胆体在 pH 7时稳定 ,而在 pH 5 , 6 , 8 , 9时只有轻微解离 ,表明藻胆体在较
宽的 pH范围内保持相对稳定 。在钝顶螺旋藻藻胆体溶液中加入 10%的葡聚糖 ,保存 30 d后藻
胆体依然保持完整 ,说明葡聚糖对藻胆体的稳定性有保护作用 。
关键词:钝顶螺旋藻(Spirulina platensis);藻胆体;荧光谱;稳定性
中图分类号:Q586 文献标识码:A 文章编号:1000-3096(2004)08-0038-05
藻胆体是蓝藻和红藻的捕光器 , 其主要功能是捕
获光能并高效地传递给光系统Ⅱ , 推动光合作用的进
行 [1 ] 。钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)是一种重要的经
济蓝藻 , 它的藻胆体主要由 C-藻蓝蛋白 、异藻蓝蛋白
及连接蛋白构成 ,呈典型的半圆盘(hemidiscoidal)状结
构 , 但扫描隧道显微镜观察的结果表明 , 钝顶螺旋藻
藻胆体的杆是放射状的 [2 ]。在螺旋藻藻胆体的内部 ,
能量传递的顺序是:C-藻蓝蛋白-异藻蓝蛋白-核膜
连接蛋白(Lcm)或 aAP-B [3 ] 。组成藻胆体的各种蛋白主
要靠疏水作用相互维系 , 在离体条件下易解离 , 因而
保证藻胆体的结构完整对于研究藻胆体结构 、功能及
其应用具有重要的意义 [4 ]。基于此 , 作者针对藻胆蛋
白浓度 、离子强度和 pH等多种因素 ,对钝顶螺旋藻藻
胆体的稳定性进行了研究 ,同时也考察了多糖对钝顶
螺旋藻藻胆体的稳定性的影响 , 为钝顶螺旋藻藻胆体
的提取 、保存和利用提供了理论依据 。
1 材料和方法
1.1 培养条件
钝顶螺旋藻用 3 ～ 4 L Zarrouk培养基培养在 5 L
透明玻璃瓶中 , 通气 ,白炽灯照光(光强 2 500 lx), 温
度 30℃±2℃。培养 7～ 10 d ,于对数生长期收集藻体 ,
用于分离藻胆体 。
1.2 藻胆体的分离
据文献 [ 5] , 以蔗糖密度梯度高速离心的方法制
备钝顶螺旋藻藻胆体 。离心完毕后 ,取出蔗糖密度为
1 mol/L层的蓝色藻胆体液 ,对 1 mol/L Na 2HPO 4 -
KH2PO 4缓冲液(pH 6.98 ,含 1mmol/L EDTA 和 0.2‰
NaN 3)透析过夜去除蔗糖 。
1.3 藻胆蛋白浓度的计算
测定藻胆体溶液在 615 nm及 652 nm 光吸收
值 , 根据 Bennett和 Bogorad [6 ]的公式计算藻胆蛋白
浓度 。
1.4 藻胆体溶液 pH调节
用 6 mol/L HCl 和 5 mol/L NaOH以 Thermo O-
收稿日期:2004-02-05;修回日期:2004-05-29
基金项目:国家高技术研究与发展计划 (863计划)项目
(2002AA302213)和山东省科技发展计划项目(031070113)
作者简介:张熙颖(1973-), 男 , 山东章丘人 , 博士 , 主要从
事藻胆蛋白及藻胆体的结构功能研究 , E-mail:zxy-
ma1@yahoo.com.cn;张玉忠 ,通讯联系人 , E-mail:zhangyz@
sdu.edu.cn
研究报告 REPORTS
Marine Sciences/Vol.28, No.8/2004 39
图 1 不同藻胆蛋白浓度藻胆体溶液的室温荧光发射光谱
a:0.4 g/L, b:0.6 g/L , c:1.2 g/L
Fig.1 The room temperature fluorescence emission spectra of
phycobilisomes with different phycobiliprotein concen
tration
rion 868型 pH计监测 , 分别调节藻胆体溶液的 pH
达到3.5 , 4.0 , 4.5 5.0 , 6.0 , 7.0 , 8.0 , 9.0 , 10.0 , 10.5
和 11。
1.5 葡聚糖对藻胆体稳定性的影响
准确称量葡聚糖 (相对分子质量为 20 000 , 国
产), 加入到藻胆体溶液中溶解 , 使终浓度达 10%,
20℃保存 ,于不同保存时间测定藻胆体的荧光光谱 。
1.6 光谱测定
吸收光谱用岛津 UV-3100紫外可见光分光光度
计测定 。荧光光谱用日立 F-4500荧光分光光度计测
定 , 激发波长为 580 nm , 狭缝宽度为 5 nm , 扫描速度
为 1 200 nm/min。
2 结果与分析
2.1 蛋白浓度对藻胆体稳定性的影响
以 1mol/L Na 2HPO 4 -KH2PO 4 缓冲液稀释钝顶
螺旋藻藻胆体溶液 ,得到不同藻胆蛋白浓度的藻胆体
溶液 。在较高蛋白浓度范围(≥0.4 g/L)内 ,钝顶螺旋
藻藻胆体的室温荧光发射峰在 670 ～ 683 nm之间(图
1 ,表 1), 说明藻胆体是完整的 , 此时藻胆体发射能量
末端受体 LCM或 aAP -B的荧光 。在此浓度范围内 , 随
蛋白浓度的增加 ,峰位置红移 ,峰型愈加尖锐 ,半带宽
愈窄 (图 1), 表明藻胆体内部结合愈加紧密 , 能量可
以更高效地传递给末端受体。
不同浓度的藻胆体在 20℃保存不同时间其室温
荧光发射峰的位置变化见表 1。由表 1可以看出 ,在藻
胆蛋白浓度低于 0.5 g/L时 , 藻胆体的室温荧光发射
峰随蛋白浓度的降低逐渐蓝移至 660 nm左右 , 表现
为异藻蓝蛋白的荧光 ,说明能量末端受体 aAP -B或 Lcm
已经解离 , 但在 C-藻蓝蛋白与异藻蓝蛋白间存在着
能量的传递 , 此时的藻胆体可以认为是相对完整的 。
但随着保存时间的延长 ,这种相对完整的藻胆体的荧
光发射峰在短时间内即可蓝移至 650 nm左右 , 表现
为 C-藻蓝蛋白的荧光 , 此时藻胆体已经解离 , 藻胆
体内部 C-藻蓝蛋白至异藻蓝蛋白间的能量传递被
完全阻断 。藻胆体溶液蛋白浓度越低 ,其荧光发射峰
蓝移的速度越快(表 1), 而高浓度的藻胆体溶液其发
射峰位置变化小 , 说明它的稳定性好 , 即使在较长的
保存时间内依然可以维持完整的结构 。这表明蛋白浓
度是影响藻胆体稳定性的因素之一 , 蛋白浓度越高 ,
藻胆体越稳定 。但是蛋白浓度过高可引发荧光淬灭
效应 ,使得藻胆体的荧光强度大大减弱 ,故本文采用
0.6 g/L藻胆蛋白浓度的藻胆体作为完整藻胆体的标
准 ,此时藻胆体的室温荧光发射峰位于 676 nm。
2.2 离子强度对藻胆体稳定性的影响
取在 1 mol/L Na 2HPO 4-KH2PO 4缓冲液的钝
顶螺旋藻藻胆体 (0.6 g/L), 用去离子水稀释 ,
使磷酸缓冲液的浓度分别为 0.1 , 0.125 , 0.25 ,
研究报告 REPORTS
海洋科学/2004年/第 28卷/第 8期40
图 2 藻胆体在不同浓度的磷酸缓冲液中处理 1 h的室温
荧光发射光谱
Fig.2 The room temperature fluorescence emission
spectra of phycobilisomes treated in various concentra-
tions of phosphate buffer for 1 hour
曲线 1～ 5的磷酸缓冲液浓度分别为:0.75 , 0.5 , 0.25 , 0.125 , 0.1
mol/L
the concentration of curve 1 ～ 5 was 0.75 , 0.5 , 0.25 , 0.125 , 0.1
mol/L, respectively
图 3 不同浓度磷酸缓冲液中藻胆体 V值的变化
Fig.3 The changes of V-value of phycobilisomes in various
concentrations of phosphate buffer at different treat-
ment times
0.5 , 0.75 mol/L , 分别于不同的处理时间测定上述
缓冲液浓度下的藻胆体的室温荧光发射光谱 。
图 2是藻胆体在不同浓度的磷酸缓冲液中处理
1 h后的室温荧光发射光谱 。图 2显示随磷酸缓冲液
浓度的减小 ,藻胆体的室温荧光发射峰逐渐蓝移 。在
此过程中 , 随离子强度的减小 , 藻胆体荧光发射主峰
由 676 nm渐变为 665 nm ,而 650 nm肩峰随之出现 ,半
带宽也明显加宽(曲线 3),接着 665 nm主峰演变为肩
峰 , 650 nm成为主峰(曲线 4 , 5)。荧光发射峰位置的
变迁 , 反映了能量末端受体与藻胆体间的解离及 C-
藻蓝蛋白与异藻蓝蛋白间的解离这两种过程 。由曲线
的变化趋势看 , 这两种解离可能同时进行 , 但由于能
量末端受体的数量少 , 表观上能量末端受体与藻胆体
间的解离对离子强度更为敏感 。可由 V=F 676 mm/
F650 mm反映藻胆体的解离程度 , V值越大 ,藻胆体越
完整 , V值越小 ,藻胆体的解离程度越大 。在不同浓度
磷酸缓冲液中藻胆 V值随处理时间的变化趋势见图
3。由图 3可以看出 , 离子强度越小 , V值降低的速度
和幅度越大 ,说明藻胆体越不稳定。而在 0.75mol/L
的磷酸缓冲液中的藻胆体 , 其 V值在所考查的时间
内几乎没有变化 , 表明藻胆体在此条件下的稳定性
好 。
2.3 pH对藻胆体稳定性的影响
不同 pH条件下钝顶螺旋藻藻胆体的室温荧光发
射光谱见图 4 , 发射峰的位置及其相对荧光强度值见
表 2。钝顶螺旋藻藻胆体在 pH 7的荧光发射峰位于
676 nm ,此时藻胆体处于稳定状态 ,不易解离 。由图 4
和表 2可知 ,从 pH 7至 3.5 ,随 pH下降 ,藻胆体荧光
发射峰位置不断蓝移 , 光谱半带宽逐渐增加 , 说明藻
胆体的解离程度越来越大 。在 pH 3.5时 ,发射峰移至
665 nm ,此时能量末端受体已完全解离 。而从 pH 7至
11 , 随 pH的增加 , 发射峰也发生蓝移 , 至 pH 10.5时
发射峰位于 672 nm , 而且出现明显的 650 nm左右的
肩峰 , 这表明已有部分的 C-藻蓝蛋白解离 。由图 4
可以看出 , pH 5 , 6 , 8 , 9藻胆体的荧光光谱与 pH 7藻
胆体荧光光谱相近 , 这反映藻胆体在弱酸 , 弱碱的条
件下都处于较稳定状态 。pH对藻胆体的荧光强度影
响较大(表 2), pH 3.5或 pH 10.5时的荧光强度只有
pH为 7时的 1/4左右 , pH越接近 7 ,荧光强度的降低
越小 。图 5显示 ,与 pH 7藻胆体相比 , pH的变化 ,导
致了藻胆体的吸收光谱的改变 , 藻胆体在紫外区的吸
收明显增高 ,而在 600 ～ 650 nm区明显降低 。
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Marine Sciences/Vol.28, No.8/2004 41
图 4 藻胆体在不同 pH条件下的室温荧光发射光谱
Fig.4 The room temperature fluorescence emission spectra of phycobilisomes under di fferent pH conditions
曲线上方数字是该曲线代表的 pH值
the figure above each curve was the pH value of the curve
表 2　不同 pH条件下藻胆体的荧光发射峰位置及其相对荧光强度
Tab.2　The wavelengths and the relative fluorescence intensity of emission maxima of phycobi lisomes under different pH condi-
tions
pH 3.5 4 4.5 5 6 7 8 9 10 10.5
荧光峰(nm) 665 671 672 674 675 676 675 674 673 672
相对荧光 0.25 0.5 0.87 0.92 1.02 1 0.85 0.79 0.52 0.24
图 5 藻胆体在不同 pH条件下的吸收光谱
Fig.5 The absorption spectra of phycobilisomes under different
pH conditions
曲线上方数字是该曲线代表的 pH值
the figure above each curve was the pH value of the curve
不同 pH条件下藻胆体吸收光谱及荧光光谱的不
同说明 pH的变化影响了藻胆蛋白的脱辅基蛋白的构
象 , 而脱辅基蛋白构象的变动进而又影响了被它所保
护的色素基团的光化学性质 。作为一种极端的情况 ,
在 pH 11时 , 藻胆蛋白已变性 , 钝顶螺旋藻藻胆体的
吸收光谱及荧光光谱已完全失去了藻胆体在 pH 7时
的特征谱形(图 4 ,图 5)。
2.4 葡聚糖对藻胆体稳定性的保护作用
葡聚糖的加入 , 使得钝顶螺旋藻藻胆体(0.6 g/L)
的 V值增加 , 说明葡聚糖使藻胆体结合得更为紧密
(图 6)。在 30 d的考查期(于 1mol/L Na 2HPO 4 -
KH 2PO 4缓冲液中 , pH 7 , 20℃保存)内 , 与对照藻
胆体相比 , 加入葡聚糖的藻胆体的 V值始终大
于对照组相应的 V值 , 而且保存过程中 V值的
降低量较小 。保存 30 d 后 ,加入葡聚糖的藻胆体
的荧光发射峰位置变化不大 , 由 676 nm蓝移至
671 nm , 且在 650 nm左右未出现肩峰 , 而对照藻
胆体已出现明显的 650 nm左右的肩峰 , 荧光发
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海洋科学/2004年/第 28卷/第 8期42
图 6 加入葡聚糖后藻胆体 V值随保存时间的变化
Fig.6 The changes of V_value of phycobilisomes with addition
of dextran during di fferent store times
图 7 加葡聚糖(a)及未加葡聚糖对照(b)藻胆体保存 30 d
的室温荧光发射光谱
Fig.7 The room temperature fluorescence emission spectra of
phycobilisomes with addition of (a)10% dextran and
(b)0% dextran buffer solution in 30 days
射主峰亦蓝移至 668 nm(图 7)。
外观上看 , 保存 30 d后 , 加葡聚糖的藻胆体形成
蓝色沉淀沉降在试管底部 , 上清液澄清 , 而对照组藻
胆体蓝色溶液已出现较多的白色絮状沉淀 , 说明已有
少量藻胆蛋白变性 。这些结果说明葡聚糖对藻胆体的
稳定性有明显的保护作用 。
3 讨论
钝顶螺旋藻藻胆体在较宽的蛋白浓度及 pH范围
内可以保持相对稳定 , 但对离子强度却较敏感 , 离子
强度的少量降低即可引发明显的解离 ,这说明藻胆体
在体外纯化状态下 , 离子强度是影响藻胆体稳定性的
关键因素 , 这主要是因为藻胆体各组成蛋白间靠弱疏
水作用力结合的缘故 。但是 ,在蓝藻的类囊体基质内 ,
不可能有像分离介质(1mol/L Na 2HPO 4 -KH2PO 4缓
冲液)这样高的离子强度 , 因而体内藻胆体完整结构
的维持可能是由于其它因素共同作用的结果 。藻胆体
在类囊体膜表面的排列异常紧密 ,藻胆蛋白含量也非
常高 [7 ] , 造成单位体积藻胆体的浓度非常高 , 势必将
水分子外排 。同时基质内各种可溶性的蛋白 、糖类及
其它有机物质的浓度也比较高 ,它们与水易形成高度
水合的化合物 , 实际上类囊体基质是处于溶胶状态 ,
这又进一步降低了藻胆体周围基质中水的含量及活
度 ,从而使得藻胆体在体内非常稳定 [4 ] 。因此 ,在离体
条件下 ,提高溶液中藻胆蛋白的浓度也能提高藻胆体
的稳定性 。葡聚糖富含羟基 ,容易吸附水分子 ,它的加
入降低了藻胆体溶液中水的活度 ,可以认为是在模拟
体内藻胆体所处的微环境 ,因此葡聚糖对藻胆体的结
构完整性有一定的保护作用 。在以前的研究中 ,作者
也曾观察到了褐藻胶对钝顶螺旋藻藻胆体稳定性的
保护现象 [8 ] , 因此多糖对藻胆体完整结构的保护可能
是一种普遍的现象 。葡聚糖等多糖类化合物为长期保
存藻胆体提供了一种简便有效的方法 ,这将有助于藻
胆体结构 、功能和进化的研究 。
参考文献:
[ 1] MacColl R.Cyanobacterial phycobi lisomes [ J] .J StruBiol ,
1998 , 124:311-334.
[ 2] 张玉忠 , 陈秀兰 , 周百成 , 等 .钝顶螺旋藻中一种新
的模型藻胆体 [ J] .中国科学(C辑), 1999 , 29(2):
145-150.
[ 3] Glazer A N.Phycobilisome:a macromolecular complex opti-
mized for lightenergy transfer [ J] .BiochimBiophysActa,
1984, 768(1):29-51.
[ 4] Katoh T.Phycobilisome stabili ty [ J] .Meth in Enzymol,
1988, 167:313-318.
[ 5] Gantt E, Lipschultz C A , Grabowski J , et al.Phycobili-
somes from blue-green and red algae:isolation criteria and
dissociation characteristics [ J] .Plant Physiol , 1979, 63
(6):615-620.
[ 6] Bennett A , Bogorad L.Complementary chromatic adaptation
in a filamentousblue-greenalga[ J] .J CellBiol , 1973, 58:
419-435 .
[ 7] GanttE.Phycobilisomes[ J] .AnnRevPlant Physiol , 1981,
32:327-347.
[ 8] 张玉忠 , 周百成 , 曾呈奎 .钝顶螺旋藻藻胆体的简易
制备及褐藻酸钠对其稳定性的保护 [ J] .海洋科学 ,
1997, 21(6):39-42.
(下转第 46页)
研究报告 REPORTS
海洋科学/2004年/第 28卷/第 8期46
Study on ingestion and growth of shrimp , Litopenaeus van-
namei
LIN Ji-hui 1 ,LI Song-qing 2 ,3 , LIN Xiao-tao2 , XU Zhong-neng2
(1.College of Fishery , Zhanjiang Ocean University , Zhanjiang 524025 , China;2.Institute of Hydrobiology , Jinan Uni-
versity , Guangzhou 510632 , China;3.Guangzhou Marine Resources ＆ Environmental Monitoring Center , Guangzhou
510235 , China)
Received:Feb., 12 , 2004
Key words:Penaeus vannamei;ingestion rate;growth rate;temperature;body weight
Abstract:The effects of temperature and body weight on ingestion rate , growth rate and food conversion efficiency of
Penaeus vannamei were studied in laboratory.The experimental results indicate that ingestion rate and growth rate are
correlated positively with water temperature and negatively with the body weight , but there weren t notable effects on the
food conversion efficiency of P .vannamei with water temperature.Relative relationship can be expressed by following
multiple regression equations:RF=0.461W -0 .793e0 .122T(r2=0.876 , P<0.01), RG=0.163W-1 .398e0 .174T(r2=0.784 , P
<0.01), EF=0.384W -0 .546e0 .046 T(r2=0.529 , P<0.05).
(本文编辑:刘珊珊)
(上接第 42页)
The study of the stability of phycobilisomes in algae , Spirulina
platensis
ZHANG Xi-ying1 , LIU Lu-ning 1 , CHEN Xiu-lan1 , ZHANG Yu-zhong1 , ZHOU Bai-cheng1 ,2(1.State Key Laboratory of Microbial Technology , Shandong Universi ty , Jinan 250100, China;2.Institute of Oceanology , The Chinese
Academy of Sciences , Qingdao 266071 , China)
Received:Feb., 5, 2004
Key words:Spirulina platensis;phycobi lisomes;fluorescence spectra;stability
Abstract:The effects of ionic strength , phycobiliprotein concentrations , pH and dextran on the stability of the phy-
cobilisomes in Spirulina platensis were studied by room temperature fluorescence emission spectra measurement.The phy-
cobilisomes with 0.6 ～ 1.2 g/L phycobiliprotein concentrations exhibited high stability and did not easily dissociate , The
fluorescence emission maxima were between 676 nm and 681 nm.The phycobilisomes were unstable and readily dissociated
into various subparticles under low ionic concentration (<0.75 mol/L).The speed and the degree of dissociation were
increased with the decrease of the ionic concentration.Phycobilisomes in buffe r solution at pH 7 were stable and slightly
dissociated.But at pH 5 , 6 , 8 or 9 , it showed that phycobilisomes exhibited stable within broad pH range.When 10%
dextran was added into the phycobilisomes solution , the phycobilisomes could keep intact for 30 days at 20℃, it could be
concluded that dextran had protection effect on the stability of phycobilisomes.
(本文编辑:张培新)
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