全 文 ：海洋科学/2007年/第 31卷/第 8期
钝顶螺旋藻藻蓝蛋白提取纯化新工艺
李　冰1 ,张学成2 ,高美华1 ,褚现明3
(1.青岛大学 医学院 , 山东 青岛 266012;2.中国海洋大学 海洋生命学院 , 山东青岛 266003;3.青岛市海慈
医院 , 山东 青岛 266033)
摘要:对钝顶螺旋藻(S pirulina p latensis)中藻蓝蛋白的提取和纯化方法进行了改进。用磷
酸盐缓冲液循环冻融联合超声波破碎法 , 50%硫酸铵沉淀获得藻蓝蛋白(phycocyanin ,
PC), 提取率达到 13.1%。粗蛋白提取液再经过两次羟基磷灰石柱(HA)层析和 sephacry l-
HR-200 凝胶层析对其进行纯化 , 纯度达到 4.71%。纯化后的 PC 在 12%十二烷基磺酸钠-
聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中得到两条带 ,分别是α和 β 两个亚基 , 分子质量分别为
21.4 ku 和 17.0 ku。结果表明 ,通过上述分离纯化过程得到了较高提取率和电泳纯度的藻
蓝蛋白。
关键词:钝顶螺旋藻(S pirulina p latensis);藻蓝蛋白;提取;纯化
中图分类号:Q51　　　文献标识码:A　　文章编号:1000-3096(2007)08-0048-05
　　钝顶螺旋藻(S pirulina platensis)又称钝顶节旋
藻(Arthrospira p latensis)是一种原核丝状蓝藻 , 含
有藻蓝蛋白 、多糖 、β-胡萝卜素 、r-亚麻酸等多种生物
活性物质 ,而藻蓝蛋白以其特有的营养和保健价值
受到广泛的重视。
藻蓝蛋白(phycocyanin , PC)是一种存在于蓝藻
细胞内的光合色素 ,能高效捕获光能[ 1] 。其分子质量
在 40 ku左右 , 由α、β 两个亚基组成 , 亚基分子质量
都在 20 ku 左右。肽链上共价结合 1 个开链的四吡
咯环辅基 ,类似动物红细胞的血红素结构。天然存在
的藻蓝蛋白通常以六聚体(αβ)6 的形式存在[ 2] 。与
之相近的别藻蓝蛋白(Anthocyanin , APC)为三聚体
(αβ)3 ,在 650 nm 处有最大吸收峰。分离纯化的水溶
藻蓝蛋白在溶液中呈蓝色 , 并发出紫色荧光 ,在波长
620 nm 具有特异吸收峰 , 可用吸光度 A620/ A280表示
其纯度[ 3] 。因其水溶性 、无毒 、清亮且着色力强等优
点 ,藻蓝蛋白被广泛用于食品着色剂和化妆品的添
加剂[ 4] 。藻蓝蛋白带有荧光 , 可用作荧光标记物[ 5] 。
另外 , 研究表明藻蓝蛋白具有一定的医疗价值 ,
Schw artz 和 Skla r[ 6]发现螺旋藻藻蓝蛋白对癌细胞有
抑制作用 ,蔡心涵等[ 7] 研究了藻蓝蛋白对激光疗法
的增敏作用 , 张成武等[ 8] 报道了螺旋藻藻蓝蛋白对
小鼠急性放射病的防护作用 , 李冰等[ 9] 研究还发现
藻蓝蛋白在抗肿瘤和提高机体免疫力方面有明显疗
效。作者对藻蓝蛋白的提取和纯化方法进行了改进 ,
分离纯化了 PC ,分离出α, β 两个亚基 ,为 PC 的应用
积累充足的实验数据。
1　材料与方法
1 .1　材料
钝顶螺旋藻粉(由作者所在的实验室提供);羟基
磷灰石(上海生物工程有限公司);sephacrylH R-200
(Sigma公司);紫外分光光度计(日本岛津公司);自
动部分收集器(上海沪西仪器厂);高速低温冷冻离心
机 3K30 型(美国 PE 公司);超声波细胞破碎仪(B-30
型 , Branson ultrasonics Co.);恒流泵(HL-2 型 , 上海
新波无线电厂)。
1 .2　藻蓝蛋白的提取和含量测定
1.2.1　藻蓝蛋白的提取方法
用磷酸盐缓冲液循环冻融联合超生波破碎法提取
藻蓝蛋白。取螺旋藻粉 50 g ,加入 pH7.0 10 m mol/ L的
磷酸盐缓冲液(PBS)300 mL , 于 4 ℃浸泡后置于磁
力振荡搅拌器上高速搅拌30 min ,然后在-20 ℃和38
℃间交替冻融数次。静置 30 min , 7 000 r/ min 4 ℃离
心 50 min。其中上清液用 50%饱和度的硫酸铵 4 ℃
收稿日期:2005-05-10;修回日期:2006-03-20
作者简介:李冰(1980-), 女 ,山东青岛人 , 博士 ,电话:0532-
82991208 , E-mai l:libing 516@yahoo.com.cn;张学成 ,通讯
作者 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事海洋藻类生物技术研究 ,
电话:0532-82032789 , E-mail:xczhang@ou c.edu .cn
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盐析[ 10] 24 h 得藻蓝蛋白;而离心沉淀得到的藻渣用
PBS 溶解后超声波处理 9 min(功率 100 W , 振幅
25%),然后7 000 r/ min离心 40 min , 50%硫酸铵沉
淀得藻蓝蛋白。收集以上两步得到的沉淀 , 用 20
mLPBS 溶解 , 置于透析袋(截留分子质量为 12 ku)中
在 2 000 mL 10 m mo l/ L PBS 中透析 12 h 以去除铵
离子。
1.2.2　藻蓝蛋白浓度测定
采用考马斯亮蓝法:取洁净干燥的试管分成两
组按表 1 进行操作。标准蛋白质溶液质量浓度为
500 mg/ L 。
表 1　标准曲线制备
Tab.1　Preparation of standard curve
试剂
用量(μL)
管号
0 1 2 3 4 5
标准蛋白 0 50 100 150 200 250
蒸馏水 500 450 400 350 300 250
加 3 m L考马斯亮蓝 G-250 , 立即摇匀 ,置室温放
置 15 min ,然后 595 nm 波长处比色。 取两组测定的
平均值,以标准蛋白质质量浓度(g/ L)为横坐标 , A595 nm
值为纵坐标作图,即得标准曲线。另取 0.5 mL 未知浓
度的 1∶100 倍稀释的待测样品蛋白溶液同上测定 ,
以其 A595值推算出浓度大小。
1.3　藻蓝蛋白提取率的影响因素
1.3.1　浸泡时间
将螺旋藻粉置于 PBS 中于 4 ℃分别浸泡 2 , 6 ,
10 , 24 , 48 h。
1.3.2　冻融次数
螺旋藻粉在 PBS 中于 4 ℃浸泡 48h ,改变冻融次
数 ,分别冻融 0 , 2 , 4 , 6 , 8 , 10 次。
1.3.3　超声波
用于冻融后离心沉淀的藻渣的处理。藻渣用
PBS 溶解后超声波处理 9 min(功率 100 W , 振幅
25%),然后7 000 r/min 离心 40 min , 50%硫酸铵沉
淀得藻蓝蛋白。
1.4　藻蓝蛋白的纯化
1.4.1　羟基磷灰石柱(HA 柱)
用 10 m mol/ L pH7.0 磷酸盐缓冲液预平衡层
析柱 ,然后加入粗蛋白提取液上柱 , 在洗脱过程中不
断增加磷酸盐缓冲液的离子强度(分别以 10 , 20 ,
50 , 100 , 200 m mo l/ L pH7.0 的 PBS 缓冲液 , 并加
0.1 mo l/ L 的 NaCl 洗脱), 洗脱速度控制在 0.52
m L/ min。分别收集不同离子强度缓冲液的洗脱液 ,
并进行光谱测定。再分别将特征吸收峰的藻蓝蛋白
部分的洗脱液合并 ,透析脱盐并用 PEG8000 浓缩。
1.4.2　Sephacry lH R-200 柱凝胶层析
经 1.4.1 纯化得到的藻蓝蛋白液上柱 , 用 0.02
m mo l/ LNa2H PO4 +0.1 mo l/ L KCl缓冲液洗脱 , 流
速控制在 0.8 mL/ min。取藻蓝蛋白部分洗脱液脱盐
浓缩。
1.4.3　HA 柱
由 1.4.2 得到的藻蓝蛋白浓缩液再次过 HA 柱
进行纯化。透析 、浓缩 、冷冻干燥 ,以备电泳。
1 .5　SDS-PAGE 电泳
采用垂直板状不连续电泳系统。分离胶质量分
数为 12%,浓缩胶质量分数为 5%。样品在浓缩胶中
电泳电压为 100 V , 进入分离胶后 200 V 电泳 3 ～ 4
h。剥胶 , 0.1%考马斯亮蓝 R-250 染液固定染色 1 h ,
用含 30%甲醇的 10%冰醋酸脱色。
2　结果
2 .1　藻蓝蛋白浓度测定
将得到的 6个点连接起来得到一条标准曲线 ,计
算回归率 R2=0.990 4 , 说明线性关系良好。对应曲
线可通过检测待测藻蓝蛋白在 595 nm 的吸光度 , 计
算待测样品的浓度。
图 1　蛋白质标准曲线
Fig.1　T he standard cu rve of protein
2 .2　藻蓝蛋白提取率的影响因素
2.2.1　浸泡时间对藻蓝蛋白提取率的影响
表 2显示浸泡 48 h藻蓝蛋白的提取率明显高于浸
泡 2 h 的提取率 ,但其纯度组间无明显差距。由此证明
在实验范围内浸泡时间越长藻蓝蛋白的提取率越高。
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表 2　浸泡时间对藻蓝蛋白提取率的影响
Tab.2　The effect of soaked time on the recovery of PC
参数 浸泡时间(h)
2 6 10 24 48
蛋白提取率(%) 3.3 4.6 5.1 5.4 5.6
A 620/ A280 0.81 0.81 0.9 0.74 0.7
2.2.2　冻融次数对藻蓝蛋白提取率的影响
取浸泡 48 h 后的藻粉经 PBS 反复冻融处理。由
表 3 可见冻融 10 次藻蓝蛋白的提取率最高可达
7.1%,由此可见藻蓝蛋白的提取率与冻融次数在实
验范围内呈正相关性。
表 3　冻融次数对藻蓝蛋白提取率的影响
Tab.3　The effect of freezing and thawing times on the recov-
ery of PC
参数 冻融次数
0 2 4 6 8 10
蛋白提取率(%) 5.6 5.8 6.0 6.6 6.8 7.1
A 620/ A280 0.88 0.81 0.79 0.97 0.89 1.01
2.2.3　超声波处理对藻蓝蛋白提取率的影响
对于冻融后仍未破裂的藻细胞采用超声波处
理。表 4可见在 2.2.2 中冻融 0 , 2 , 4 , 6 , 8 和 10 次后
仍未破裂的藻细胞经超声处理后 , 藻蓝蛋白的提取
率分别为 4.8%, 4.9%, 5.3%, 5.7%, 5.9%和
6.06%。
表 4　超声波处理对藻蓝蛋白提取率的影响
Tab.4　The effect of ultrasonic wave on the recovery of PC
参数 冻融次数
0 2 4 6 8 10
蛋白提取率(%) 4.8 4.9 5.3 5.7 5.9 6.0
A 620/ A280 0.61 0.59 0.55 0.60 0.52 0.55
2.2.4　藻蓝蛋白的总提取率
综合上面 2.2.2 和 2.2.3 两步的蛋白提取率即
可得到藻蓝蛋白的总提取率(图 2)。藻蓝蛋白在浸
泡 48 h ,后经 PBS 冻融 10 次 , 最后超声波处理得到
的蛋白最大提取率为 13.1%。
图 2　藻蓝蛋白的总提取率测定
Fig.2　The determinat ion of the total ext raction rate of PC
2 .3　纯化结果
2.3.1　经 HA 柱纯化结果
粗藻蓝蛋白经过羟基磷灰石柱层析 ,磷酸盐缓冲
液洗脱 , 结果见图 3。峰 1 为穿过组份 , 目标组份藻
蓝蛋白主要集中在峰 2 和峰 3 ,峰 4 含藻蓝蛋白和别
藻蓝蛋白 , 峰 5 为别藻蓝蛋白。 A620/ A280=2.56。
图 3　藻蓝蛋白粗品经羟基磷灰石层析洗脱曲线
Fig.3　Elu tion cu rve of crude p hycocyanin via H A column
2.3.2　经 sephacry lHR-200 柱凝胶层析结果
收集峰 2和峰 3 的组份 , 经过 sephacrylH R-200
柱凝胶层析得到 3 个峰 , 结果见图 4。 a组份呈深蓝
色 , 成分主要是藻蓝蛋白。 A620/ A280 =3.64。
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图 4　组份 2 , 3经 sephacrylH R-200柱凝胶层析洗脱曲线
Fig.4　Elut ion curve of component 2, 3 via sephacrylHR-200
2.3.3　经 HA 柱凝胶层析结果
组分 a再次经过 HA 柱层析得到藻蓝蛋白的单
一洗脱峰 ,结果见图 5。表明藻蓝蛋白得到进一步纯
化 , A620/ A280 =4.71。
图 5　组份 a经 HA 柱凝胶层析洗脱曲线
Fig.5　The elu tion cu rve of component a via HA colum n
2.3.4　纯化后藻蓝蛋白的 SDS-PAGE 电泳结果
纯化后的藻蓝蛋白通过 12%SDS-PAGE 电泳得
到两条条带 ,对应蛋白的两个亚基α和 β , 分子质量
分别为 17.0 ku±0.7 ku 和 21.4 ku±1.0 ku(图 6)。
图 6　SDS-PAGE电泳图
Fig.6　SDS-PAGE elect rop horetogram
1.蛋白 marker;2.藻蓝蛋白粗提取液;3 ,4 ,5为纯化后的藻蓝蛋白
1.marker pro teins;2.crude PC ex tracts;3 ,4 ,5.purif ied PC
3　讨论
高效的分离纯化技术是提高产品质量和得率 ,降
低目标产物生产成本的关键。藻蓝蛋白的应用现状 ,
要求开发出一套藻蓝蛋白低成本生产技术 , 以扩大
对这一优良的荧光标记物和具潜在药用价值的高附
加值产品的生产和应用。为此 ,作者简化了某些分离
纯化步骤 , 提高了藻蓝蛋白的得率和纯度。
(1)选用的实验材料为钝顶螺旋藻粉。由于藻
粉经喷雾处理 ,部分细胞壁已被破坏 , 因此溶于磷酸
盐缓冲液的藻粉经磁力搅拌 30 min 后 , 某些细胞的
细胞壁破碎 , 藻蓝蛋白易溶出。
(2)实验证明 ,用反复冻融的方法来破碎螺旋藻
细胞壁效果很好。经 6次反复冻融之后 ,用显微镜观
察发现大部分藻丝已断裂 ,藻细胞破裂 ,藻蓝蛋白从
胞内释出。
(3)经搅拌和冻融处理仍未破碎的细胞作者采
用超声破碎法做进一步处理。但作用的强度和时间
要注意控制 , 强度过大时间过长都可能导致细胞内蛋
白等有效组份的破坏 ,强度过小时间太短又可能达不
到破碎细胞的目的。经过实验比较 , 发现用功率 100
W ,振幅 25%的超声波处理 9 min(每作用 2 min 间隔
1 min)效果较好。
(4)Siegelman 等[ 11]曾建议用硫酸铵盐析时 , 采
用分步沉淀的方法 , 即用 30%饱和度的硫酸铵来沉
淀 PC ,而 50%饱和度的硫酸铵来沉淀 APC。但本实
验发现两者所得的盐析沉淀溶解液中的 PC 和 APC
成分比例几乎无差异 , 不能将 PC 主体和 APC 主体
分开。因此 , 要想获得较高纯度的螺旋藻藻蓝蛋白 ,
必须采用柱层析法对粗提取液进行纯化。
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(5)蛋白粗提取液经过 HA 柱层析时 , 在 10 ～
20 m mol/ L 缓冲液作用下 , PC 即可被洗脱下来 , 而
APC 要在 50 ～ 100 m mo l/ L 缓冲液作用下才被洗脱
下来。经过一次 HA 柱层析之后 , PC 纯度可大幅度
提高 ,达到 2.56。
(6)再经 sephacry lH R-200 柱和 HA 柱各一次 ,
藻蓝蛋白得到进一步纯化 ,纯度达 4.71。
(7)经 SDS-PAGE 电泳分析 ,藻蓝蛋白单体由α
和 β 两个亚基组成 , 分子质量分别为 17.0 ku ±0.7
ku 和 21.4 ku±1.0 ku。天然存在的钝顶螺旋藻藻
蓝蛋白以六聚体(αβ)6 形式存在 , 分子质量为(17.0
+21.4)×6=230.4 ku。
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New research on extraction and purification of phycocyanin
from Spirulina platensis
LI Bing
1 , ZHANG Xue-cheng2 , GAO M ei-hua1 , ZH U Xian-ming3
(1.Medical Colleg e of Q ingdao Univ ersity , Qingdao 266012 , China;2.College of Ma rine L ife Science s , O-
cean Univer sity of China , Qingdao 266003 , China;3.Haici H ospital , Qingdao 266033 , China)
Received:May , 10 , 2005
Key words:Sp irul ina p lantensi s;phycocyanin;ext raction;pu rifi cat ion
Abstract:The optimum method of ex traction and purification of phycocyanin from S pirulina p latensis
was improved in this paper.Through repeatedly freezing and thaw ing alternative ly in the presence o f phosphate
buffer combined with ultrasonic fr agmentation , the phycocyanin w as efficiently ex tracted fr om S.platensis by
being precipitated in 50% solid ammonium sulpha ted , resulting in 13.1% recove ry of phycocyanin.Then , the
crude phycocyanin was chromatog raphed by hydro xy lapatite(HA)column , fur the r purified by sephacry lH R-
200 ge l chroma to g raphy and H A co lumn chroma tog raphy again .In the end the phycocyanin with a high purity
(A620/ A280)o f 4.71 was obtained.Analyzed by 12% SDS-PAGE electropho resis , phycocyanin migr ated as tw o
bands co rresponding to its two subunits(αand β)and the molecular w eights wer e 17.0 ku and 21.4 ku , r e-
spectively.The results showed tha t w e got the phycocyanin with a compara tively high ex tracting r ate and a
high purity by means o f a series of ex traction and purification pro cedures.
(本文编辑:张培新)
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