全 文 :第 35卷 第 2期 西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) Vol. 35 No. 2
2007年 2月 Journal of No rthw est A& F Univer sity ( Nat. Sci. Ed. ) Feb. 2007
板蓝根、大青叶中靛蓝和靛玉红的测定方法比较⒇
董娟娥 a ,龚明贵 a ,梁宗锁b
(西北农林科技大学 a林学院 , b生命科学学院 ,陕西杨凌 712100)
[摘 要 ] 为了筛选出合适的测定板蓝根、大青叶中靛蓝、靛玉红含量的方法 ,对比、分析了高效液相色谱法、
双波长分光光度法和薄层扫描法测定的稳定性、精密度和加标回收率等。 结果表明 ,高效液相色谱法测定靛蓝、靛
玉红含量的各项指标均优于其他方法 ;双波长分光光度法由于无法排除提取液中其他成分对靛蓝、靛玉红的干扰 ,
使得测定结果偏高 ;薄层扫描法不适宜于板蓝根中靛蓝、靛玉红含量的测定 ,而可用于大青叶中这 2种成分的定量 ,
但测定必须在薄层板展开后3 h内完成。可见 3种分析方法各有优缺点 ,可用于不同精度下对靛蓝、靛玉红含量的测
定。
[关键词 ] 板蓝根 ;大青叶 ;靛蓝 ;靛玉红 ;测定方法
[中图分类号 ] O655 [文献标识码 ] A [文章编号 ] 1671-9387( 2007) 02-0215-05
Comparison of three methods of measuring indigo and indirubin
in radix isatidis and folium isatidis
DONG Juan-ea , GON G Ming-guia , LIANG Zong-suob
( a College of Forestry ; b College of L if e Sciences ,Northwest A & F University , Yangling , Shaanxi 712100,China)
Abstract: In o rder to obtain the sui table measure to select indigo and indirubin contained in radix
isatidis and fo lium isa tidis, three methods i. e. , HPLC, DWSP and TLCS w ere compared from the aspects of
stabili ty, precision and recovery. The resul ts a re as follow s: The HPLC is the best one. The DWSP makes
the results higher than true due to the interference o f the impuri ties. The TLCS is no t sui table to measure
the contents o f indigo and indirubin in radix isatidis, but sui table in fo lium isatidis if the test can be
accomplished wi thin three hours af ter the development o f tw o consti tuents. Each of the three methods has
i ts advantag es and disadvantag es and can be adopted in di fferent precisions.
Key words: radix isatidis; folium isa tidis; indigo; indi rubin; measurement
板蓝根和大青叶为十字花科 ( Cruci ferae)菘蓝
( Isat is indigotica Fo rt. )的不同部位 ,具有清热解
毒、凉血、消斑的功效 ,主治温病发热、发斑、发疹、风
热感冒、咽喉肿痛、流行性脑脊髓膜炎、乙型脑炎、肝
炎、腮腺炎、丹毒、痛肿等症 [1 ] ,是常用的大宗中药
材。近年来 ,许多学者为探明板蓝根、大青叶的治病
机理 ,对其化学成分进行了研究 ,发现其主要成分为
生物碱类、有机酸类及苷类化合物等 [2-3 ] ,并尝试以
化学成分作为其质量控制指标 ,加强对板蓝根、大青
叶及其制剂的质量控制 ,其中包括靛蓝、靛玉红、有
机酸类、氨基酸类、尿苷、腺苷等化学成分。目前 ,对
板蓝根中是否含有靛蓝、靛玉红以及以何种成分作
为板蓝根及其制剂的质量控制指标尚没有一致的观
点 [4-8] ,对靛蓝、靛玉红含量的测定方法虽有文献报
道 [9-10] ,但尚未见对这些方法进行系统比较研究的
报道。针对上述情况 ,本研究对板蓝根、大青叶中靛
蓝、靛玉红含量测定的常用方法进行了系统研究 ,并
比较了各种方法的优缺点 ,以便使测定结果更能真
实、客观地反映板蓝根、大青叶质量的优劣。
⒇ [收稿日期 ] 2006-01-09
[基金项目 ] 陕西省“十五”科技攻关项目 ( 2001KG01-G15-03) ;中科麦迪森天然药物有限公司中药现代化项目
[作者简介 ] 董娟娥 ( 1968- ) ,女 ,陕西蒲城人 ,副教授 ,在读博士 ,主要从事天然产物提取和中药现代化理论与技术研究。
1 材料、仪器与试剂
1. 1 试验材料
试验所用板蓝根、大青叶分别于 2004-04和
2004-09采自陕西汉阴板蓝根规范化种植基地
( GAP基地 )。样品采集后置烘箱内 60℃鼓风干燥
至恒重 ,粉碎 ,过 0. 36 mm筛 ,备用。
1. 2 主要仪器与试剂
主要仪器: 高效液相色谱仪 ( LC-10ATVP型 ,日
本岛津 ) ,紫外-可见分光光度计 ( UV-2000,上海尤
尼可公司 ) ,双波长薄层扫描仪 ( KAMAG scanner
3,瑞士卡玛公司 ) ,半自动点样仪 ( Linomat 5,瑞士
卡玛公司 )。
试剂: 高效液相色谱所用甲醇为色谱纯 (美国
Fisher公司 ) ,水为双蒸水 ,靛蓝、靛玉红标准品 (中
国药品生物制品检定所 ) ,薄层层析用硅胶 (青岛海
洋化工有限公司 ) ,羧甲基纤维素钠 (天津市博迪化
工有限公司 )。
1. 3 方 法
1. 3. 1 高效液相色谱法 ( HPLC) ( 1)色谱条件。
流动相: 甲醇-水 (体积比为 75∶ 25) ;色谱柱: C18
ODS反相柱 ( Shimadzu) 4. 6 mm× 150 mm; SPD-
10Avp紫外检测器 ;检测波长: λ= 280 nm;流速: 1
m L /min;柱温: 25℃。 ( 2)标准曲线绘制。精密称取
于 60℃烘箱干燥至恒重的靛玉红标准品 4. 4 mg,靛
蓝标准品 1. 9 mg ,置于 25 mL棕色容量瓶中 ,用氯
仿稀释至刻度作为标准品溶液。分别精密吸取靛蓝、
靛玉红标准溶液 1, 2, 4, 6, 8, 10和 12μL注入高效液
相色谱仪 ,以色谱峰面积和对应的浓度拟合出回归
方程。 ( 3)待测样品提取液的制备。分别精确称取备
用板蓝根样品 2 g ,大青叶样品0. 5 g,置于150 mL平
底烧瓶中 ,加入 100 mL氯仿 ,于 80℃水浴中索氏提
取 (板蓝根提取 8 h,大青叶提取 12 h) ,浓缩提取液 ,
氯仿定容至 25 mL,用高效液相色谱仪测定靛蓝、靛
玉红含量。 ( 4)稳定性试验。精密吸取靛蓝、靛玉红
标准品溶液 5μL,每隔 2 h用高效液相色谱仪测定 1
次 ,共测 5次后 ,过24 h再测定1次。( 5)精密度试验。
精密吸取靛蓝、靛玉红标准品溶液 5μL,注入高效液
相色谱仪 ,测定标准品溶液浓度 ,重复 6次。 ( 6)加标
回收率试验。精密称取大青叶粗粉 8份 (每份 0. 5 g )
进行提取 ,其中 4份提取液中加入 12. 40μg的靛蓝
标准品 ,另 4份加入 12. 50μg的靛玉红标准品 ,高效
液相色谱法测定含量 ,计算回收率。( 7)靛蓝、靛玉红
标准添加液的配制。精确称取靛蓝标准品 1. 24 mg,
靛玉红标准品 1. 25 mg ,用氯仿溶解于 50 mL容量
瓶中 ,配制成含靛蓝 0. 024 8 mg /mL、靛玉红 0. 025
0 mg /mL的标准品溶液 ,作为标准添加液。
1. 3. 2 双波长分光光度法 ( DWSP) ( 1)标准品溶
液的制备。 依 1. 3. 1中标准品溶液配制方法操作。
( 2)待测样溶液的制备。依 1. 3. 1中待测样溶液配制
方法制备。 ( 3)靛蓝、靛玉红含量的测定。以氯仿为
对照 ,在一定波长下测定待测样溶液的吸光度 ,由公
式计算出待测样溶液中靛蓝、靛玉红的含量 [ 5]。 ( 4)
最大吸收波长的确定。以氯仿作空白样 ,将标准溶液
置于 1 cm石英比色皿中 ,用分光光度计在 230~ 800
nm变化波长 ,测定吸光度 ,确定最大吸收波长。 ( 5)
稳定性试验。以氯仿为空白对照 ,分别于波长 608和
544 nm处测定靛蓝、靛玉红标准品溶液浓度 ,每隔 2
h比色测定 1次 ,测定 5次后 ,过 24 h再测定 1次。
( 6)精密度试验。以氯仿为空白 ,分别于波长 608和
544 nm处测定靛蓝、靛玉红标准品溶液浓度 ,重复 6
次。 ( 7)加标回收率试验。依 1. 3. 1中描述的方法进
行提取、加样 ,分光光度法测定含量 ,计算回收率。
1. 3. 3 薄层扫描法 ( TLCS) ( 1)待测样溶液的制
备。依 1. 3. 1中相应方法操作。 ( 2)标准品溶液的制
备。 精密称取在 60℃烘箱中干燥至恒重的靛蓝、靛
玉红标准品 ,用乙醇 -氯仿溶液 (体积比 40∶ 60)制成
0. 1 mg /mL对照液。 ( 3)薄层色谱条件。参照《中国
药典》中描述的方法 [11 ]。 ( 4)点样、扫描与计算。精密
吸取待测样溶液 5μL,标准品溶液 2μL和 7μL,用
半自动点样仪分别交叉点于同一硅胶薄层板上 ,展
开后进行双波长反射法锯齿扫描 ,测量待测样品溶
液吸收度积分值与标准品吸收度积分值 ,计算含量。
( 5)稳定性试验。精密吸取标准品溶液 5μL点于硅
胶薄层板上 ,展开 ,扫描测定 ,计算浓度。 ( 6)精密度
试验。薄层板上点标准品溶液 7点 ,每点 5μL,展开 ,
扫描 ,计算浓度。 ( 7)加标回收率试验。参照 1. 3. 1方
法进行提取、加样 ,薄层扫描法测定含量 ,求出加标
回收率。 ( 8)靛蓝、靛玉红标准添加液的配制。参照
1. 3. 1中描述的方法配制。
2 结果与分析
2. 1 3种检测方法的测定条件与计算结果
2. 1. 1 高效液相色谱法 用高效液相色谱仪测得
已知浓度靛蓝、靛玉红标准品对应的色谱峰面积值 ,
以色谱峰面积和对应的浓度拟合回归方程。 靛蓝的
216 西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) 第 35卷
回归方程为:
Y= 1. 864 4× 10- 8X- 0. 003 2( R= 0. 999 5) ;
靛玉红的回归方程为:
Y= 1. 237 6× 10- 8X+ 0. 000 1(R= 0. 999 8)。
2. 1. 2 薄层扫描法 分别取靛蓝、靛玉红对照溶
液 ,在 200~ 700 nm波长内扫描 ,结果见图 1。
图 1 靛蓝和靛玉红的吸收光谱
Fig. 1 Abso rption o f indigo tin and indirubin
图 1显示 ,靛蓝在 608 nm处有最大吸收 ,靛玉
红在 544 nm处有最大吸收 ,且相互干扰较小 , 2种
成分在 700 nm处几乎无吸收。因此 ,确定λS= 544和
608 nm分别为靛蓝、靛玉红的测定波长 ,λR= 700
nm为参比波长。
2. 1. 3 双波长分光光度法 根据图 1,同样选择 544
和 608 nm作为双波长分光光度法测定靛蓝、靛玉红
的吸收波长。以氯仿作空白样 ,分别在 544和 608 nm
处测定靛蓝、靛玉红标准溶液吸光度。根据 Lamber t-
beer定律: A= EC ( A表示吸光度 , E表示消光系
数 ,C表示溶液的浓度 ) ,分别计算出 4个消光系数。
靛蓝、靛玉红含量的计算公式如下:
当波长为 608 nm时 , E608靛蓝 = 34. 6, E608靛玉红 =
6. 9;当波长为 544 nm时 , E544靛蓝 = 19. 6, E544靛玉红 =
44. 6。
当溶液为 2种物质的混合溶液时:
A608= E608靛蓝×C靛蓝+ E608靛玉红×C靛玉红 ,
A544= E544靛蓝×C靛蓝+ E544靛玉红×C靛玉红。
由靛蓝、靛玉红在可见光区的吸收光谱可知 ,靛
蓝、靛玉红的吸收光谱相互重叠 ,根据吸收度加和性
原理 ,应用靛蓝、靛玉红氯仿溶液在波长 544和 608
nm处测定比吸收系数 ,导出如下浓度计算公式:
C靛蓝 = 1. 54× 10- 3× A608- 1. 87× 10- 4× A544 ,
C靛玉红 = 3. 65× 10- 3× A544 - 9. 41× 10- 4× A608。
式中: C靛蓝为靛蓝在待测溶液中的质量浓度
( mg /L) , C靛玉红为靛玉红在待测溶液中的质量浓度
( mg /L) , A608为待测溶液在波长 608 nm处的吸光
度 , A544为待测溶液在波长 544 nm处的吸光度。
2. 2 3种检测方法测定指标的比较
2. 2. 1 稳定性 3种测定方法的稳定性试验结果
见表 1。
表 1 3种方法测定靛蓝和靛玉红含量的稳定性试验结果
Table 1 Results o f stability test of the contents o f indig o and indirubin with 3 methods mg /L
测定方法
M easurement
m ethod
成分
Cons ti tuent
测定时间 /h Tes t time
0 2. 0 2. 5 3. 0 3. 5 4. 0 6. 0 8. 0 24. 0
高效液相色谱法
HPLC
靛蓝 Indigo 76. 32 74. 99 75. 69 74. 39 76. 32 75. 96
靛玉红 Indi ru bin 174. 63 173. 26 175. 85 174. 36 173. 95 174. 33
双波长分光光度法
DWSP
靛蓝 Indigo 84. 37 88. 32 97. 36 86. 32 80. 323 89. 54
靛玉红 Indi ru bin 195. 62 180. 26 187. 85 190. 62 182. 96 193. 66
薄层扫描法
TLCS
靛蓝 Indigo 72. 58 81. 26 75. 33 73. 25 67. 32 55. 21 36. 24
靛玉红 Indi ru bin 171. 32 166. 33 167. 32 164. 32 147. 30 132. 32 123. 15
表 1显示 ,用高效液相色谱法和双波长分光光 度法测定靛蓝、靛玉红含量时 ,在 24 h内两者的浓
217第 2期 董娟娥等: 板蓝根、大青叶中靛蓝和靛玉红的测定方法比较
度均无显著变化 ,较稳定。 鉴于在测定板蓝根、大青
叶生药及其产品中靛蓝、靛玉红含量时 ,从提取到最
终测定 ,完全可以在 24 h内完成 ,故采用高效液相
色谱法和双波长分光光度法时 , 2种成分的稳定性
可以满足测定要求。采用薄层扫描法时 ,靛蓝、靛玉
红在 3 h内测定结果较稳定 ; 3 h后测得的靛蓝、靛
玉红浓度越来越小 ,从 3 h到 3. 5 h靛蓝减少了 5. 93
mg /L,靛玉红减少了 17. 02 mg /L;到 24 h时 ,靛蓝
的质量浓度减少到原溶液质量浓度的 50% ,靛玉红
减少到原溶液质量浓度的 70% 。这可能是由于标准
品溶液点于硅胶薄层板上展开后 ,少量的靛蓝、靛玉
红在薄层板上分解或是被薄层板的硅胶吸附的缘
故。故当待测溶液在硅胶板上展开后 ,对薄层进行扫
描应在 3 h内完成 ,才能保证测定结果的偏差在允
许范围内。
2. 2. 2 精密度 表 2给出了 3种测定方法的精密度
试验结果。表 2显示 ,高效液相色谱法测定 2种成分
的相对标准偏差 ( RSD)均小于 2% ,符合《中国药典》
要求 ,表明高效液相色谱法测定靛蓝、靛玉红含量精
密度高 ,偏差小 ,测定结果可信 ;双波长分光光度法
和薄层扫描法测定靛蓝、靛玉红精密度 RSD均小于
5% ,符合中药材含量测定质量标准要求 ,但与高效
液相色谱法相比 , RSD稍偏大 ,其精密度没有高效
液相色谱法高。 因此 ,在测定方法选择上 ,应优先考
虑采用高效液相色谱法。
表 2 3种方法测定靛蓝和靛玉红含量的精密度试验结果
Table 2 Results of pr ecision tests of the content o f indig o and indirubin with 3 methods mg /L
测定方法
M easurement
method
成分
Cons ti tuent
重复次数 Number of repeti tion
1 2 3 4 5 6 平均 Mean RSD
/%
高效液相色谱法
HPLC
靛蓝 Indigo 73. 33 74. 92 72. 15 73. 00 72. 30 74. 32 73. 34 1. 17
靛玉红 Indi rubin 173. 62 172. 66 173. 36 174. 97 172. 04 174. 69 173. 58 0. 50
双波长分光光度法
DWSP
靛蓝 Indigo 84. 75 79. 33 84. 63 80. 37 78. 65 83. 37 81. 85 2. 93
靛玉红 Indi rubin 184. 69 180. 68 175. 39 189. 62 172. 36 174. 33 179. 51 3. 05
薄层扫描法
TLCS
靛蓝 Indigo 77. 33 76. 02 75. 32 82. 32 81. 87 78. 36 78. 54 3. 02
靛玉红 Indi rubin 173. 21 178. 37 171. 55 174. 32 176. 36 177. 35 175. 19 1. 23
2. 2. 3 加标回收率 各测定方法的加标回收率试
验结果见表 3。加标回收率试验结果 (表 3)显示 ,当大
青叶为 0. 5 g、加标量为 12. 5μg左右时 ,高效液相色
谱法测定靛蓝、靛玉红含量的平均加标回收率在
99%~ 101% ,薄层扫描法的平均加标回收率在 97%
~ 103% ,双波长分光光度法的在 95%~ 105% , 3种
测定方法的平均加标回收率试验结果均符合要求。
其中以高效液相色谱法的回收率最高 ,其次是薄层
扫描法 ,双波长分光光度法的回收率最低。 因此 , 3
种方法适宜于不同精度要求下的靛蓝、靛玉红含量
测定。
表 3 3种方法测定靛蓝和靛玉红含量的加标回收率试验结果
Table 3 Results o f r ecover y test o f the contents of indig o and indirubin with 3 meth ods
测定方法
M easurement
method
成分
Cons ti tuent
样品含量 /
( mg· kg- 1 )
Contents of
s ample
加入标品量 /μg
STD sample
ad ded
理论值 /
( mg· kg- 1 )
Theoret ic
value
测定值 /
( mg· kg- 1 )
M easu ring
value
回收率 /%
Recov ery
rate
高效液相色谱法
HPLC
靛蓝 Indigo 325. 00 12. 40 349. 80 352. 78 100. 97
靛玉红 Indi rubin 359. 35 12. 50 384. 35 386. 00 100. 43
双波长分光光度法
DWSP
靛蓝 Indigo 352. 62 12. 40 377. 42 393. 85 104. 35
靛玉红 Indi rubin 394. 61 12. 50 419. 61 405. 96 96. 74
薄层扫描法
TLCS
靛蓝 Indigo 314. 68 12. 40 339. 48 345. 16 101. 69
靛玉红 Indi rubin 365. 48 12. 50 390. 48 401. 42 102. 81
2. 3 3种方法测定大青叶样品中靛蓝、靛玉红含量
的比较
利用上述 3种测定方法对大青叶中靛蓝、靛玉
红的含量分别进行测定 ,结果见表 4。由表 4可知 , 3
种测定方法中 ,若以高效液相色谱法为标准 ,双波长
分光光度法的测定结果偏高 ,而薄层扫描法的测定
结果偏低。
218 西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) 第 35卷
表 4 3种方法测定的大青叶样品中靛蓝、靛玉红含量的比较
Table 4 Contents o f indigo and indirubin in Folium isa tidis with 3 methods mg /L
成分
Cons ti tuen t
高效液相色谱法
HPLC
双波长分光光度法
DWSP
薄层扫描法
T LCS
靛蓝 Indig o 330. 49 390. 28 310. 22
靛玉红 Indi rubin 363. 33 441. 19 359. 65
3 讨 论
3种靛蓝、靛玉红测定方法各有优缺点 ,可用于
不同精度要求的含量测定。 用高效液相色谱法测定
靛蓝、靛玉红含量具有稳定性好、精密度高和加标回
收率高等优点 ,是测定工作首选的方法。 《中国药
典》 2005版也将大青叶中靛玉红含量测定方法由以
前的薄层扫描法改为高效液相色谱法 ,但其缺点是:
测定过程中流动相消耗大 ,仪器、试剂较为昂贵。分
光光度法不能排除提取液中其他化合物在测定波长
处有吸收 ,从而使得测定结果高于真实值。对比试验
结果表明 ,分光光度法精密度、重复性和加标回收率
等各项指标均能达到中药材含量测定的要求 ,但不
及高效液相色谱的好 ;同时 ,由于其所需要的仪器廉
价、使用普遍 ,在没有高效液相色谱仪的条件下 ,不
失为一种较为简便、快速的含量测定方法。薄层扫描
法是点样、展开后 ,用双波长或单波长扫描 ,然后与
对照物按同法所得的色谱图作对比 ,用以进行含量
测定的方法 ,只要得到分离度和重复性好的薄层色
谱 ,就可获得满意的结果。 对比试验结果表明 ,薄层
扫描法测定大青叶中靛蓝、靛玉红含量切实可行 ,稳
定性、精密度、重复性和加标回收率等各项测定结果
均符合要求。 但该法也有一定缺陷 ,当原料中靛蓝、
靛玉红的含量较低 ,待测液在薄层板上显色不明显
时 ,测定误差较大 ,因而不适宜测定板蓝根中靛蓝、
靛玉红含量。同时 ,薄层板质量、样品展开效果、待测
物质的稳定性和固定相对样品的吸附能力等因素对
测定结果影响也很大。 在测定靛蓝、靛玉红含量时 ,
待测液薄层板展开 3 h后扫描 ,测定的靛蓝、靛玉红
含量明显降低 ,因此 ,测定工作必须在薄层展开后 3
h内完成。
目前 ,以何种成分作为板蓝根、大青叶类药材的
质量控制指标观点尚不一致。有学者认为应以胞苷、
尿苷、腺苷等作为质量控制指标 [4 ] ;有学者认为板蓝
根中不含靛蓝、靛玉红 ,以往在板蓝根中测出的靛
蓝、靛玉红 ,实际上是在采收和加工过程中混入的根
茎和附带的叶柄残基所含的靛蓝和靛玉红 ,可以考
虑将苯甲酸、丁香酸、邻氨基苯甲酸、水杨酸等 4种
有机酸作为质控指标 [12 ]。本试验发现 ,板蓝根药材
(没有含根茎和其附带的叶柄残基 )的氯仿提取液 ,
经高效液相色谱仪检测确实含有少量的靛蓝、靛玉
红。《中国药典》 ( 2005年版 )规定了大青叶原药材的
有效成分为靛玉红 ,并对其含量做了明确规定 ,而对
于板蓝根的质量控制仅是以精氨酸的定性检验为标
准 ,没有具体的含量要求。鉴于板蓝根、大青叶中的
靛蓝、靛玉红具有保护肝脏、治疗白血病、抗菌、抗病
毒等功效 [13 ] ,对板蓝根、大青叶的质量控制不能忽
视这 2种成分。
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