全 文 ：龙牙木心匆木 SE 基因克隆与植物表达载体构建
成　慧 , 杨　光 , 刘雅婧 , 赵春彦 , 原亚萍 , 吴　颖
吉林大学植物科学学院 , 长春 130062
摘　要:采用 RT-PCR的方法 ,从龙牙木心匆木中克隆到鲨烯环氧酶(SE)基因 , 该基因的 cDNA全长为 1 682 bp ,
含有 1 644 bp 的开放阅读框(ORF), 编码 547 个氨基酸 , 将所得的序列提交 GenBank 数据库 , 登录号为
GU354314。序列分析结果表明:龙牙木心匆木 SE 基因的氨基酸序列与人参 、三七 、绞股蓝的同源性>90%, 并构
建了该基因的植物表达载体 pAeSE。
关键词:龙牙木心匆木;鲨烯环氧酶(SE)基因;植物表达载体;三萜皂苷
中图分类号:Q781　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-5684(2011)01-0047-04
DOI:CNKI:22-1100/ S.20101215.1412.000
网络出版地址:http:∥www.cnki.net/kcms/ detail/ 22.1100.S.20101215.1412.000.html
Cloning of Squalene Epoxidase Gene in Aralia elata and Construction of
Its Plant Expression Vector
CHENG Hui , YANG Guang , LIU Ya-jing , ZHAO Chun-yan , YUAN Ya-ping , WU Ying
College of Plant Sciences , Jilin University , Changchun 130062 , China
Abstract:The squalene epoxidase (SE)gene from Aralia elata (AeSE)was amplified by RT—PCR.
The result showed that the full-length cDNA of AeSE gene (GenBank accession Number:GU354314)is
1 682 bp and contains a 1 644 bp open reading frame (ORF)encoding a polypeptide of 547 amino acids.
The SE proteins from Aralia elata , Panax ginseng , Panax notoginseng and Gynostemma pentaphyllum
showed more than 90% identities based on amino acid sequences alignment.The plant expression vector
pCAMBIA 3301-AeSE was constructed.
Key words:Aralia elata;squalene epoxidase gene;plant expression vector;triterpenoid saponin
　　龙牙木心匆木[ Aralia elata (Miq.)Seem.] 俗称刺
老芽 ,为五加科木心匆木属落叶乔木 ,主要分布于我国
东北林区[ 1] 。它是药食两用植物[ 2] ,其嫩芽可做
蔬菜 ,是我国出口创汇的主要山野菜[ 3] 。根 、皮可
入药[ 4] ,具有治疗脑力和体力过度疲劳 、急慢性肝
炎 、胃癌 、肝癌 、胃及十二指肠溃疡等作用[ 5] 。龙
牙木心匆木富含齐墩果烷型三萜皂苷 ,其生物体内次
生代谢合成途径已经明确。目前 MVA途径是公
认的三萜皂苷元合成的必由途径[ 6] ,其生物合成
过程为由三分子的乙酰 CoA 经过一系列的反应
生成异戊二烯焦磷酸(IPP), IPP 与　牛儿基焦磷
酸(GPP)在法尼基焦磷酸合酶(FPS)的作用下生
成法尼基焦磷酸(FPP),FPP又在鲨烯合酶(SS)的
作用下生成反式角鲨烯 ,然后经鲨烯环氧酶(SE)
催化生成 2 ,3-氧化鲨烯[ 7-8] ,最后在 2 ,3-氧化鲨烯
环化酶(OSCs)的作用下经过一系列的反应最终生
成三萜类物质[ 9] 。
其中鲨烯环氧酶(Squalene epoxidase , SE , EC
1.14.99.7)是该生物合成途径中的重要调控酶 ,
该酶可以促进皂苷的释放 , 增加皂苷的合成
量[ 6 ,10] 。目前虽然应用分子生物学手段对一些药
用植物的鲨烯环氧酶基因有比较深入的研究 ,但

通讯作者
基金项目:长春市科技计划项目(08YJ29)
作者简介:成慧 ,女 ,硕士研究生 ,主要从事药用植物生物技术研究。
收稿日期:2010-06-28　　网络出版时间:2010-12-15　14:12
吉林农业大学学报　2011 ,33(1):47 ～ 50 http:// xuebao.jlau.edu.cn
Journal of Jilin Agricultural University E-mail:jlndxb@vip.sina.com
对龙牙木心匆木鲨烯环氧酶基因的研究较少 。本研究
首次成功分离 、克隆该基因 ,并构建该基因的植物
表达载体 ,为后继的转基因研究奠定基础。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　植物材料 [ 龙牙木心匆木 Aralia elata (Miq.)
Seem.] 采自吉林大学植物科学学院药用植物园。
1.1.2　菌株和质粒　pGM-T vector 购自天根生
化科技(北京)有限公司 ,大肠杆菌 DH5α及质粒
pCAMBIA 3301(载体含 Kan筛选标记和Gus基因 ,
为双元植物表达载体)为吉林大学植物科学学院
基础生物学实验室保存。
1.1.3　酶和生化试剂　LA Taq 酶 、限制性内切
酶 、T4 DNA 连接酶 、RNA 提取试剂盒及 cDNA 第
一链合成试剂盒 、DNA Marker均购自宝生物工程
(大连)有限公司 ,其他试剂均为国产分析纯。
1.1.4　引物　引物由金斯特科技(南京)有限公
司合成 ,DNA测序由北京六合华大基因科技股份
有限公司完成。
1.2　方法
1.2.1　RNA提取及 cDNA 合成　采用 Biozol试
剂盒提取龙牙木心匆木叶片的总 RNA ,利用反转录试
剂盒合成 cDNA第一链 。
1.2.2　PCR扩增　由于龙牙木心匆木与人参同为五
加科植物 ,亲缘关系较近 ,因此根据 GenBank 登录
的人参 SE 基因(AB122078.1)的序列设计 1对引
物 ,并在上下游引物的 5′端分别加 BglⅡ和BstpⅠ
酶切位点序列 ,引物序列为
FP:5′-GGAAGATCTACGTCAACCAAC
Bgl Ⅱ
ACCATGAA-3′;
RP:5′-CGAGGTGACCAAATGAAGGCC
Bstp Ⅰ
ATAATCACTTT-3′。
在 25 μL 的反 应体系 中 , dNTP 0.5 μL
(10 mmol/L),引物各0.5μL(10μmol/L),模板 cD-
NA 2μL ,LA Taq 酶0.25μL ,10倍 buffer 2.5μL ,以
ddH2O补足至 25μL。PCR扩增条件:94 ℃预变性
5 min;94 ℃变性1min ,58 ℃复性 1min ,72 ℃延伸
2 min ,35个循环;72 ℃延伸 10 min。
1.2.3　目的片段的回收 、克隆测序与分析　将
PCR产物回收后 ,按 3∶1比例与克隆载体 pGM-T
连接。连接产物转化大肠杆菌 DH5α感受态细
胞 ,进行蓝白斑筛选 ,挑取阳性克隆用碱裂解法提
取质粒 DNA ,对重组质粒进行 PCR 、酶切鉴定 ,测
序由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。
将测序结果经 BLAST 比对 , 采用 NCBI 的 ORF
finder确定该基因的开放阅读框 ,多序列比对用
DNAman软件完成 。
1.2.4　龙牙木心匆木 SE 植物表达载体的构建　将
含有 目 的 基 因 的 重 组 质 粒 pGMSE 和
pCAMBIA 3301分别用 Bgl Ⅱ和 Bstp Ⅰ双酶切 ,回
收酶切后的目的片段和载体大片段 ,经 T4 DNA连
接酶连接 ,转化大肠杆菌 DH5α感受态 ,在含有
10 μg/mL的卡那霉素的 LB培养基上筛选重组子。
挑取阳性克隆 ,经 PCR检测和酶切鉴定验证重组
质粒 ,命名为 pCAMBIA 3301-AeSE 。
2　结果与分析
2.1　SE 基因 cDNA序列的扩增及 pGMSE重组
质粒 PCR、酶切鉴定结果
以逆转录合成的 cDNA 第一链为模板 ,利用
引物 FP 、RP 进行 PCR扩增 ,产物经 0.8%琼脂糖
凝胶电泳检测 , 得到单一 、特异的扩增带 ,片段大
小约为1 700 bp ,与预期结果一致(图 1)。
M.DL2000 Marker;1.阴性对照 Negative control;2 , 3.AeSE 基
因 cDNA of AeSE amplif ied by RT-PCR
图 1　龙牙木心匆木 SE基因 RT-PCR扩增结果
Fig.1.Amplification result of AeSE gene by RT-PCR
　　pGMSE 重组质粒大小约为 4 600 bp , 经
BglⅡ 、Bstp Ⅰ 双酶切和 PCR 鉴定后 , 出现约
1 700 bp的特异性条带(图 2),与预期大小基本一
致。测序结果表明 ,所得序列长度为 1 682 bp ,命
名为 AeSE 。将所得序列提交到 GenBank数据库 ,
登录号为GU354314。
2.2　SE 基因生物信息学分析
龙牙木心匆木 SE 基因的 cDNA 序列包含 1个完
48　　吉林农业大学学报　2011年 2月
Journal of Jilin Agricultural University 2011 , February
整的开放阅读框(1 ～ 1 644 bp),编码 547个氨基
酸(图 3), 推测其分子量为 60.28 kD ,等电点为
8.85 ,这是一类不稳定的蛋白质 。利用 DNAman
软件对龙牙木心匆木 SE 基因的序列进行分析 ,发现
该基因的氨基酸序列与人参 、三七 、绞股蓝同源
性>90%。
2.3　SE 基因植物表达载体的构建
对筛选出的阳性克隆进行 PCR 和 Bgl Ⅱ、
Bstp Ⅰ双酶切鉴定 ,0.8%琼脂糖凝胶电泳检测到
约1 700 bp的目的带(图 4),结果表明该片段大小
与预期值一致 ,说明目的片段插入的位置和方向
正确 , 成功构建出了植物表达载体 pCAMBIA
3301-AeSE(图 5)。
M1.DL15000 Marker;1 , 2.质粒 purif ied pGMSE vector;M2.
DL2000 Marker;3 , 4.PCR 鉴定 PCR amplifi cation of pGMSE
vector;5 , 6.酶切鉴定 pGMSE vector was digested by resitriction
enzyme
图 2　克隆载体 pGMSE的 PCR、酶切鉴定
Fig.2.Identification of pGMSE vector by PCR and en-
zyme digestion
图 3　AeSE 的全长 cDNA序列及推导的氨基酸序列
Fig.3.AeSE cDNA sequence and its deduced amino acid sequences
49成慧等:龙牙木心匆木 SE 基因克隆与植物表达载体构建
吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University
M1.DL15000 Marker;1.重组质粒 Purified pCAMBIA 3301-
AeSE plant expression vector;2 , 3.酶切鉴定 Enzyme digestion of
pCAMBIA 3301-AeSEM2.DL2000 Marker;4 , 5.PCR 鉴定
PCR amplif ication of pCAMBIA 3301-AeSE
图 4 　植物表达载体 pCAMBIA 3301-AeSE 的
PCR、酶切鉴定
Fig.4.Identification of pCAMBIA 3301-AeSE plant
expression vector by PCR amplification and
enzyme digestion
图 5　植物表达载体 pCAMBIA 3301-AeSE 图谱
Fig.5.The map of pCAMBIA 3301-AeSE plant ex-
pression vector
3　讨　论
三萜类皂苷是植物次生代谢产物中一类重要
化合物 ,其含量和组分主要取决于生物合成途径
中的关键酶以及在细胞中的表达水平[ 11] 。目前 ,
三萜皂苷的代谢途径已明确 ,决定三萜皂苷产量
的关键酶也已找到 。鲨烯环氧化酶是一种单氧
酶 ,它是三萜皂苷生物合成途径中的关键酶之
一[ 12] , 该酶催化反式鲨烯在C C双键之间插入
1个氧原子形成环氧化物 ,即 2 , 3-氧化鲨烯[ 13] 。
因此 ,SE对三萜皂苷产量的影响起到关键作用。
本研究首次克隆到龙牙木心匆木的限速酶-鲨烯环氧
化酶基因 ,与人参 、三七 、绞股蓝等药用植物同源
性高 ,进一步验证了亲缘关系越近 ,代谢产物越趋
同的观点 。
本研究利用优化的 PCR反应体系和反应条
件成功获得了目的基因 AeSE ,构建了该基因的植
物表达载体 ,为下一步转基因研究奠定了基础。
龙牙木心匆木是一种大有开发利用潜力的宝贵植物资
源[ 14] 。但由于近年来国内外市场对龙牙木心匆木的
需求量剧增 ,导致对龙牙木心匆木掠夺式的采集而使
其野生资源迅速减少[ 15] 。因此 ,运用生物技术手
段克隆 、转化其关键酶基因 ,对提高次生代谢物的
产量和解决医药紧缺等问题有深远的意义。
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